韓朵，石書瑋，田菲，龐得全，張晉冀，聶秋明

1 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院放療科，河北唐山 063000；2 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科；3 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，宮頸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且逐漸年輕化。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界每年約有57.0 萬例宮頸癌新發(fā)病例，31.1 萬例死亡病例［1］。放療是目前治療宮頸癌的主要方法之一，大部分宮頸癌患者經(jīng)過放療可有效控制病情，但仍有約30%的患者復(fù)發(fā)，其機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞對放療抵抗有關(guān)［2］。明確放療抵抗的原因，對放療不敏感的宮頸癌患者進(jìn)行個體化的綜合治療，有助于改善患者預(yù)后，提高其生存率。艾迪注射液是純中藥制劑，具有清熱解毒、消瘀散結(jié)的作用，常用于肝癌、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤的治療。研究顯示，肺癌、乳腺癌、食管癌患者放化療期間聯(lián)合應(yīng)用艾迪注射液，不僅能夠減輕放化療相關(guān)的不良反應(yīng)，還可提高臨床療效［3-4］。但艾迪注射液能否提高宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性目前尚不明確。2019 年4 月—2020 年6 月，我們觀察了艾迪注射液對宮頸癌SiHa 細(xì)胞放療敏感性的影響，并探討其作用機(jī)制，為深入研究艾迪注射液的抗腫瘤作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌SiHa 細(xì)胞購于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。艾迪注射液（貴州益佰制藥股份有限公司）；MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、EDTA（美國Gibco 公司）；PBS（中國Solarbio 公司）；Annexin Ⅴ-PI 凋亡檢測試劑盒、TRIzol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒（長沙艾科瑞生物科技有限公司）；DEPC 水（上海江萊生物科技有限公司）。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；顯微鏡（日本Olympus 公司）；臺式高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；醫(yī)用直線加速器（美國瓦里安公司）；流式細(xì)胞儀（FACS Culibur，美國BD Biosciences公司）；紫外分光光度計（美國GE 公司）；熒光定量PCR 儀（德國Eppendoff公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取SiHa 細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、青霉素—鏈霉素雙抗溶液的MEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時，加入胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞放療敏感性觀察 采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按3 × 105/孔接種于6 孔板中。將細(xì)胞分為空白對照組和艾迪注射液組，空白對照組加入100 μL 培養(yǎng)液，艾迪注射液組加入10 mg/mL艾迪注射液100 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用醫(yī)用直線加速器對細(xì)胞進(jìn)行放療，分別給予0、2、4、6、8 Gy 照射劑量，放療結(jié)束后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)15 h，然后加入胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液稀釋，接受0、2、4、6、8 Gy 照射劑量的細(xì)胞分別接種200、500、1 500、6 000、8 000 個至6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)10～13 d，觀察培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時停止培養(yǎng)。PBS 清洗，加入結(jié)晶紫固定液將細(xì)胞固定15 min，流水沖洗，空氣中干燥，在低倍鏡顯微鏡下計數(shù)大于50 個細(xì)胞的克隆數(shù)。計算兩組0 Gy 時的克隆形成率（PE），PE=0 Gy 時克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%；然后根據(jù)PE 計算兩組2、4、6、8 Gy 時的存活分?jǐn)?shù)（SF），SF=2、4、6、8 Gy 時克隆數(shù)/（接種細(xì)胞數(shù)×PE） × 100%。SF降低表示放療敏感性升高。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 采用AnnexinⅤ/PI 雙染法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照2 × 106/孔接種于6 孔板中，將細(xì)胞分成空白對照組、放療組、艾迪注射液+放療組?？瞻讓φ战M加入100 μL 培養(yǎng)液；放療組加入100 μL 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后，使用直線加速器進(jìn)行放療，照射劑量10 Gy；艾迪注射液+放療組加入10 mg/mL 艾迪注射液100 μL 培養(yǎng)24 h 后，用直線加速器進(jìn)行放療，照射劑量10 Gy。放療后48 h 消化、洗滌并重懸細(xì)胞，加入稀釋的PI 和AnnexinⅤ染液混勻，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2 mRNA 檢測 采用實(shí)時定量PCR 法。按照1 × 105個細(xì)胞接種于6 孔板中，按照“1.4”中的分組和干預(yù)方法進(jìn)行處理。取三組細(xì)胞，加入TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA 濃度。將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。使用熒光定量PCR儀（Eppendoff公司）進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系（10.0 μL）：SYBR Green 熒光染料預(yù)混試劑5.0 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，Rnasefree 水3.6 μL。Bcl-2 引物序列：上游 5'-TGGATGACCGAGTACCTGAA-3' ，下 游5'-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3'。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸60 s，共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)均來自3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用配對樣本t檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞放療敏感性比較 空白對照組和艾迪注射液組在照射劑量0 Gy 時的PE 分別為83.50% ± 7.00%、79.17% ± 4.16%。空白對照組在2、4、6、8 Gy 時的SF 為64.70% ± 6.42%、24.44% ±4.49%、4.42% ± 0.73%、0.36% ± 0.10%，艾迪注射液組分別為42.94% ± 3.01%、8.49% ± 1.23%、0.68% ± 0.11%、0.08% ± 0.03%；艾迪注射液組2、4、6、8 Gy 時的SF 較空白對照組降低（P=0.002），表明放療敏感性升高。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較 空白對照組、放療組、艾迪+放療組細(xì)胞凋亡率分別為9.60% ±0.58%、23.14% ± 1.29%、28.33% ± 1.42%。放療組細(xì)胞凋亡率高于空白對照組，艾迪+放療組高于放療組（P均＜0.01）。

2.3 各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平比較 空白對照組、放療組、艾迪+放療組Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量分別為2.80 ± 0.05、1.71 ± 0.02、1.45 ± 0.05。放療組Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平低于空白對照組，艾迪+放療組低于放療組（P均＜0.01）。

3 討論

近年來，腫瘤的多學(xué)科綜合治療獲得廣泛認(rèn)可和推廣，放療、化療、靶向治療和免疫治療在宮頸癌治療中發(fā)揮重要作用，同時傳統(tǒng)藥物與現(xiàn)代治療的結(jié)合也為宮頸癌的治療帶來新的突破。艾迪注射液屬于中藥制劑，其主要成分為人參、黃芪、刺五加及斑蝥提取物。人參具有補(bǔ)脾益肺、生津安神的功效，其主要活性成分為人參皂苷。LEE 等［5］報道，人參皂苷Rh2 聯(lián)合放療可使結(jié)腸癌CT26/luc 細(xì)胞發(fā)生G2/M 期捕獲，從而起到放療增敏作用。黃芪具有益氣、扶正、健脾的功效，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力。研究表明，黃芪能夠通過下調(diào)Cyclin B、Cyclin E 表達(dá)及上調(diào)p21表達(dá)，抑制白血病K562細(xì)胞增殖［6］；通過下調(diào)Bcl-2 表達(dá)、上調(diào)Bax 表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡［7］。刺五加具有平補(bǔ)肝腎、益精壯骨的功效，斑蝥具有破血消瘀、攻毒蝕瘡的功效。從刺五加中提取的刺五加多糖和斑蝥中提取的班蝥素均可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［8-9］。此外，斑蝥素還可通過促進(jìn)染色質(zhì)致密性提高結(jié)腸癌細(xì)胞的放療敏感性［10］。艾迪注射液是治療婦科腫瘤的輔助用藥，與單純手術(shù)或放化療相比，加入艾迪注射液可顯著提高宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等婦科惡性腫瘤患者的總生存率和生活質(zhì)量［11］。此外，艾迪注射液還可以降低放化療和靶向治療導(dǎo)致的胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、肝腎功能異常等不良反應(yīng)，提高患者的體力狀態(tài)KPS評分［12-15］。

放療抵抗可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，放療后細(xì)胞增殖、周期、凋亡的變化會影響細(xì)胞的放療敏感性。近年來，研究者們不斷尋找放療抵抗的原因，并發(fā)掘提高放療敏感性的方法及藥物。XU等［16］研究發(fā)現(xiàn)，對腦膠質(zhì)瘤SHG44 細(xì)胞給予艾迪注射液聯(lián)合放療后，細(xì)胞被更多地阻滯在G2/M期；艾迪注射液能夠下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1 和上調(diào)Wee1 蛋白表達(dá)，起到放療增敏作用。另有研究顯示，艾迪注射液單用及聯(lián)合放療均可抑制Lewis 肺癌裸鼠移植瘤生長，且艾迪注射液具有一定的放射增敏作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HIF-1α、p53、Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)［27］。本研究采用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，艾迪注射液組宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性明顯升高，表明艾迪注射液對宮頸癌細(xì)胞有放療增敏作用。

細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜而精細(xì)的程序性細(xì)胞死亡過程，在免疫、生物體進(jìn)化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定維持等方面發(fā)揮重要作用。研究顯示，艾迪注射液可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 和MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)MMP 裂解激活線粒體凋亡途徑，抑制肝癌細(xì)胞生長，促進(jìn)其凋亡［18］。本研究結(jié)果顯示，與放療組比較，艾迪+放療組細(xì)胞凋亡率明顯升高，表明艾迪注射液能夠有效誘導(dǎo)宮頸癌Siha細(xì)胞放療后的凋亡。

Bcl-2基因存在于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，是一種癌基因，具有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2 基因的編碼產(chǎn)物Bcl-2 蛋白是細(xì)胞內(nèi)完整的膜蛋白，在促進(jìn)細(xì)胞生長方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，Bcl-2 基因可通過啟動Bcl-2 家族以及Caspase 家族相關(guān)凋亡因子的釋放而調(diào)控細(xì)胞凋亡過程［19］。本研究結(jié)果顯示，與放療組比較，艾迪+放療組細(xì)胞Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯降低，表明艾迪注射液可下調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，從而通過促進(jìn)宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡來提高其放療敏感性。

綜上所述，艾迪注射液可增強(qiáng)SiHa 細(xì)胞的放療敏感性，其機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)從而促進(jìn)SiHa細(xì)胞放療后的凋亡有關(guān)。