戶春麗 雷召雄 汪書哲 盛輝 高玉紅 馬燕芬 馬云

摘 要 旨在探究 ?circADAMTS16在牛不同組織和前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平及其對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化的影響，為進(jìn)一步研究circRNA在細(xì)胞分化和脂肪組織發(fā)育過程中的調(diào)控作用提供依據(jù)。采用組織塊法分離培養(yǎng)牛原代前體脂肪細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，模擬牛脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育過程；通過qRT-PCR檢測(cè) ?circADAMTS16在牛不同組織（心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪）和脂肪細(xì)胞分化不同階段（0 d、2 d、4 d、8 d、10 d）的表達(dá)水平；構(gòu)建 ?circADAMTS16的過表達(dá)載體（pCD2.1- ?circADAMTS16），設(shè)計(jì)合成 ?circADAMTS16的小干擾RNA （si- ?circADAMTS16），采用（Lipofectamine3000）轉(zhuǎn)染試劑將pCD2.1- ?circADAMTS16和si- ?circADAMTS16轉(zhuǎn)染牛前體脂肪細(xì)胞，利用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，同時(shí)檢測(cè)脂肪分化標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα和 ?C/EBPβ的表達(dá)量變化，并進(jìn)行油紅O染色，綜合分析干擾和過表達(dá) ?circADAMTS16對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化的影響。結(jié)果如下：①qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明 ?circADAMTS16在心臟中表達(dá)量最高，肝臟次之，脾最低；②在牛原代前體脂肪細(xì)胞分化過程中， ?circADAMTS16在第2天顯著高表達(dá)，隨后逐漸降低，在第8天時(shí)達(dá)到最低。③在牛前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá) circADAMTST16后，脂肪分化標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表達(dá)量顯著下降；油紅O染色結(jié)果顯示，過表達(dá)后脂滴形成數(shù)量明顯少于對(duì)照組；而干擾 ?circADAMTS16表達(dá)后，脂肪分化標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα表達(dá)量顯著上升。綜上所述， ?circADAMTS16對(duì)牛原代前體脂肪細(xì)胞的分化過程具有顯著的調(diào)控作用，過表達(dá) ?circADAMTST16可抑制牛原代前體脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程，而干擾 ?circADAMTS16表達(dá)可以促進(jìn)牛原代前體脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程，探明 ?circADAMTS16對(duì)牛原代前體脂肪細(xì)胞分化的具體調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞 牛； ?circADAMTS16；脂肪細(xì)胞；載體構(gòu)建；過表達(dá)

牛肉因其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值而備受消費(fèi)者喜愛，而肌內(nèi)脂肪含量影響牛肉的多汁性、嫩度和風(fēng)味。脂肪沉積受到多種激素、酶、轉(zhuǎn)錄因子以及非編碼RNA（non-coding RNA， ncRNA）的調(diào)控，包括微小核糖核酸 （microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA （circular RNA， circRNA）廣泛參與了各種脂肪生成過程，如脂肪細(xì)胞的增殖和分化、脂滴形成和脂肪細(xì)胞特異性基因激活，以及在脂肪組織發(fā)育和重塑過程中基因的調(diào)控［1-2］?，F(xiàn)有研究報(bào)道，miR-27a通過降低RXR α表達(dá)來增強(qiáng)綿羊前體脂肪細(xì)胞增殖并抑制綿羊前體脂肪細(xì)胞分化［3］；lncRNA-Adi與miR -449a競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK6的3′非翻譯區(qū)，增強(qiáng)CDK6轉(zhuǎn)錄，激活pRb-E2F1通路進(jìn)而促進(jìn)脂肪形成［4］。

circRNA是一種共價(jià)閉合RNA分子，通過反向剪接生成，廣泛存在于真核生物，在進(jìn)化過程中普遍是保守的［5］。circRNA可作為吸附miRNA的分子海綿，抑制miRNA功能；同時(shí)，可以參與靶基因剪接，將基因翻譯為蛋白質(zhì)，研究表明，具有無限ORF的circRNA以IRES獨(dú)立的方式進(jìn)行滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增，導(dǎo)致其生產(chǎn)力比線性轉(zhuǎn)錄本高百倍［6］；也可以與宿主基因位點(diǎn)結(jié)合，形成一個(gè)R-loop，導(dǎo)致宿主基因轉(zhuǎn)錄暫停［7-8］。circSEP3通過與宿主DNA位點(diǎn)結(jié)合，形成RNA-DNA雜交或R-loop，增加了同源外顯子跳過替代剪切變體的豐度，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄暫停和剪接因子的募集［9］。此外，circRNA可與RNA結(jié)合蛋白相互作用，也可作為蛋白質(zhì)誘餌，支架和招募者，與蛋白質(zhì)結(jié)合并鞏固蛋白之間的相互作用［10］。circRNA在脂肪細(xì)胞分化中起著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠充當(dāng)分子海綿或支架，與miRNAs或蛋白質(zhì)結(jié)合，從而調(diào)控脂肪沉積和脂質(zhì)代謝的體內(nèi)過程。Arcinas等［11］研究發(fā)現(xiàn)circTshz2-1和circArhgap5-2是體外脂肪生成不可或缺的調(diào)節(jié)劑。Liu等［12］研究表明circSAMD4A作為miR-138-5p分子海綿上調(diào)EZH2的表達(dá)抑制前脂肪細(xì)胞分化。在去勢(shì)公豬的皮下脂肪沉積研究中證實(shí)睪酮以劑量依賴性方式上調(diào)miR-181a而抑制circ_0005912的表達(dá)，這是circRNA在脂肪沉積中的新作用［13］。

具有血栓反應(yīng)蛋白1基序16的ADAM金屬肽酶（ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 16， ADAMTS16）基因，作為ADAMTS的家族成員，通過激活TGF-β導(dǎo)致心臟纖維化、心臟肥大和心力衰竭［14］。作為卵巢癌的發(fā)病基因， ADAMTS16錯(cuò)義突變?cè)隗w內(nèi)可能會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或者通過提高腫瘤鉑類藥物敏感性來抑制腫瘤生長(zhǎng)，其與甲狀球腺蛋白相互作用提高了卵巢早衰的風(fēng)險(xiǎn)［15-16］。本研究通過測(cè)序篩選發(fā)現(xiàn) cricADAMTS16在牛脂肪組織差異表達(dá)，而 ?circADAMTS16來源于 ?ADAMTS16基因編碼區(qū)，提示 cricADAMTS16可能在脂肪組織發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，但其對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化是否具有調(diào)控作用還不清楚。因此，本研究旨在檢測(cè) ?circADAMTS16在牛7種組織以及脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式，探究過表達(dá) ?circADAMTS16對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化的影響，為 ?circADAMTS16在牛脂肪沉積作用中的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 組織樣品采集 采集3頭成年健康的2歲秦川牛（公牛）心、肝、脾、肺、腎、肌肉和皮下脂肪組織，將組織樣放入標(biāo)記好的采樣管中，迅速放到液氮罐中保存，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.1.2 細(xì)胞樣品采集 在澤瑞生態(tài)養(yǎng)殖牧場(chǎng)采集用于分離培養(yǎng)牛前體脂肪細(xì)胞的皮下脂肪組織，用75%的酒精和含2%雙抗的PBS清洗多次，隨后將其浸泡在含雙抗的PBS中并快速地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間。

1.2 主要試劑

胎牛血清購自賽默飛公司，DMEM高糖培養(yǎng)基等購自?？寺∩锕?，油紅O購自北京索萊寶公司，qRT-PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物公司，羅格列酮、地塞米松、IBMX和胰島素均購自Sigma-Aldrich公司（美國），Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司（日本），RNase R酶購自Epicentre生物技術(shù)公司（美國）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 采用組織塊法分離培養(yǎng)牛前體脂肪細(xì)胞。待組織法得到的細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（含10 μg/mL胰島素、 ?1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IBMX和 ?1 μmol/L羅格列酮的完全培養(yǎng)基），誘導(dǎo)2 d后，棄去誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，加維持分化培養(yǎng)基 （含10 μg/mL胰島素和1 μmol/L羅格列酮的完全培養(yǎng)基），每2 d換液1 次并收集細(xì)胞。誘導(dǎo)10 d后，收獲最后一批細(xì)胞，用于qRT-PCR分析。利用油紅O對(duì)分化前和分化完成后的牛前體脂肪細(xì)胞染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，用PBS將油紅O儲(chǔ)存液（油紅O＋PBS）按照2∶3稀釋成工作液，用10%的福爾馬林固定細(xì)胞后染色，置于顯微鏡下進(jìn)行成像觀察并拍照記錄。

1.3.2 總RNA提取及cDNA的獲得 采用Trizol法提取組織和細(xì)胞總RNA，操作流程參照Trizol試劑盒說明書，利用多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA的濃度及OD260/280值，并利用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)總RNA的完整性，同時(shí)根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中提供的隨機(jī)引物將 ?1 000 ng獲得的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA保存于 ?-20 ℃冰箱。

1.3.3 ??circADAMTS16接口處擴(kuò)增及真實(shí)性鑒定 采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增 ?circADAMTS16接口處引物（如表1），以脂肪組織cDNA（原液）為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus） 7.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA 1? μL、RNase-free ddH2O 5.5 μL。程序?yàn)椋航德銹CR溫度區(qū)間為55? ℃～65? ℃，切膠純化回收后連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性菌液送往北京奧科鼎盛公司（陜西楊凌）進(jìn)行測(cè)序。提取牛原代前體脂肪細(xì)胞的總RNA，取相同量RNA（4.1? μg）兩管，分別加入10×buffer? ?2 μL，一管加RNase酶0.8 μL，另一管加RNAfree H2O? ?0.8 μL，然后加ddH2O補(bǔ)至20 μL，震蕩離心。反應(yīng)程序?yàn)椋?7? ℃ 25 min，70? ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，兩組取等體積的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。分別以RNase R-和RNase R+的cDNA為模板PCR擴(kuò)增 ?circADAMTS16和GAPDH。通過凝膠電泳檢測(cè) ?circADAMTS16和GAPDH的PCR產(chǎn)物。

1.3.4 ??circADAMTS16表達(dá)譜的構(gòu)建 采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物（如表1）；利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)牛各組織（心臟、肝臟、脾、肺、腎、肌肉、脂肪）和前體脂肪細(xì)胞分化（0 d、2 d、 ?4 d、8 d、10 d）過程中 ?circADAMTS16的相對(duì)表達(dá)水平，以細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（n=3），qRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見表2，內(nèi)參基因選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。

1.3.5 ??circADAMTS16載體構(gòu)建及功能驗(yàn)證 以秦川牛脂肪組織的cDNA為模板，采用背靠背引物在 ?circADAMTS16序列兩端引入BamHⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增 ?circADAMTS16的全長(zhǎng)序列。引物信息為F：CGGATCCTGAAATATGCTATCTTACagACATGC-?? CCAAGCCTCCCAAAGAA；R：GGGTA- CCTCAAGAAAAAATATATTCacTTGTGTCCAGAC-? TCGTGGGCGAT，其中斜體部分是酶切位點(diǎn)，加粗部分為環(huán)化序列，小寫部分為環(huán)化介導(dǎo)位點(diǎn)。將 ?circADAMTS16全長(zhǎng)序列與pCD2.1載體分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，純化后按照T4? DNA連接酶說明書在4? ℃下過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)并挑取單克隆，將測(cè)序正確的質(zhì)粒在37 ℃擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，從而獲得過表達(dá)載體pCD2.1- ?circADAMTS16。將過表達(dá)載體pCD2.1- ?circADAMTS16及pCD2.1空載（Control組）通過轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入牛原代前體脂肪細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM 3000試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染第2天后加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo) ?2 d后更換為維持培養(yǎng)基，第8天后使用Trizol將細(xì)胞收集并進(jìn)行油紅O染色。向牛原代前體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染合成的siRNA（生工，安徽）對(duì) ?circADAMTS16進(jìn)行干擾，轉(zhuǎn)染2 d后收集細(xì)胞。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 利用2-ΔΔCt法分析熒光定量的結(jié)果，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD法，其中P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異 ?顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)

組織塊法分離培養(yǎng)第10天可觀察到部分脂肪細(xì)胞貼壁（圖1-A），將分離出的原代前體脂肪細(xì)胞重新鋪板。48 h后細(xì)胞密度達(dá)到90%（圖1-B），隨即將細(xì)胞消化傳代，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至90%以上時(shí)，再次將細(xì)胞消化傳代并用于后續(xù)誘導(dǎo)分化試驗(yàn)。將牛原代前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并在第0天、第2天、第4天、第8天和第10天收集細(xì)胞，在誘導(dǎo)10 d后，進(jìn)行油紅O染色并拍照（圖1-C），明顯有脂滴形成。將收集的細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，使用10 g/L凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量（圖1-D），28 s和18 s條帶清晰明顯，RNA質(zhì)量較好。將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，qRT-PCR檢測(cè)成脂標(biāo)志基因在脂肪分化過程中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)0 d相比，成脂標(biāo)志基因PPARγ和C/EBPα在誘導(dǎo)2 d、4? d、6 d、8 d和 ?10 d中均顯著上調(diào)（P<0.01）（圖1-E和圖1-F）。

2.2 ??circADAMTS16真實(shí)性鑒定

根據(jù)Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增得到295 bp? ?circADAMTS16序列（圖2-A）。以RNase R-和RNase R+的cDNA為模板PCR擴(kuò)增 ?circADAMTS16和GAPDH，結(jié)果表明RNase R+組 circADAMTST6條帶明顯清晰，而GAPDH與RNase R-相比較暗（圖2-B）。Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)均為單一峰（圖2-C）。利用DNAMAN軟件將克隆得到的序列與NCBI已有序列進(jìn)行比對(duì)，相似度高達(dá)100%，表明克隆所獲得序列是牛 ?circADAMTS16的接口區(qū)（圖2-D）。表明 ?circADAMTS16的真實(shí)存在。

2.3 ??circADAMTS16組織表達(dá)譜

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示， ?circADAMTS16在牛的心臟中表達(dá)量最高，其次為肝臟，在脂肪、腎、肌肉和肺中的表達(dá)量差異不大，在脾中的表達(dá)量最低。然而各組織中表達(dá)量差異不顯著（圖3）。

2.4 ??circADAMTS16時(shí)序表達(dá)譜

將獲得總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后，通過qRT-PCR檢測(cè)circADAMTST6在牛前體脂肪細(xì)胞分化各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量。如圖4所示，以分化第0天為對(duì)照， ?circADAMTS16在第2天的表達(dá)量最高（P＜0.01）；從第4天開始， ?circADAMTS16的表達(dá)量逐漸降低，到第8天表達(dá)量達(dá)到最低（P<0.05）。

2.5 pCD2.1-? ?circADAMTS16載體構(gòu)建及 ?circADAMTS16對(duì)成脂基因的影響

利用pCD2.1過表達(dá)載體構(gòu)建 ?circADAMTS16的過表達(dá)載體，載體信息如圖5-A所示，酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和KpnⅠ。 ?ADAMTS16基因及 ?circADAMTS16的基因組定位如圖5-B所示，來源于牛20號(hào)染色體 ?ADAMTS16基因CDS區(qū)964 bp～1 513 bp。轉(zhuǎn)染牛原代前體脂肪細(xì)胞后檢測(cè)過表達(dá)效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛原代前體脂肪細(xì)胞中 ?circADAMTS16表達(dá)水平明顯升高，升高倍數(shù)達(dá)15倍左右（圖5-C）。轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)8 d檢測(cè)過表達(dá) ?circADAMTS16對(duì)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響。結(jié)果顯示（圖5-D），過表達(dá) ?circADAMTS16后，成脂標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPβ和C/EBPα顯著降低（P< ?0.01）； ?pCD2.1- ?circADAMTS16和對(duì)照兩組進(jìn)行油紅O染色，對(duì)照組脂滴明顯多于pCD2.1- ?circADAMTS16組，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)480? nm處的吸光值，過表達(dá)組低于對(duì)照組（圖5-E）。如圖6-A所示，合成 ?circADAMTS16小干擾片段轉(zhuǎn)染牛原代脂肪細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)表明干擾效率達(dá)50%以上（P<0.01），如圖6-B所示， qRT-PCR檢測(cè)成脂標(biāo)志基因發(fā)現(xiàn)PPARγ和C/EBPα表達(dá)量顯著上升（P<0.05）；如圖6-C所示，誘導(dǎo)后進(jìn)行油紅O染色及480 nm吸光度值的檢測(cè)結(jié)果顯示干擾組顯著高于對(duì)照組（P< ?0.01）。由此表明， ?circADAMTS16抑制牛原代前體脂肪細(xì)胞的分化。

3 討? 論

動(dòng)物脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞構(gòu)成，通過儲(chǔ)存能量和執(zhí)行內(nèi)分泌功能影響新陳代謝，參與調(diào)控動(dòng)物健康和肉品品質(zhì)［17］，而脂肪細(xì)胞的成熟是極其復(fù)雜的過程，受多種調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路的影響［18］。其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein，C/EBPα）是最主要的兩類調(diào)控因子［19］。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量研究表明circRNAs廣泛參與調(diào)節(jié)牛機(jī)體脂肪的生成。

ADAMs是一種解離素-金屬蛋白酶，與其緊密相關(guān)的ADAMTS家族長(zhǎng)期以來被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生有關(guān)， ?ADAMTS16就是其家族成員之一［20］。有研究表明，人體中 ?ADAMTS16抑制腫瘤細(xì)胞增殖并且與眼睛的發(fā)育有關(guān)［21］。在小鼠和斑馬魚中發(fā)現(xiàn)其可以通過降解視神經(jīng)裂邊緣的基底膜促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，與視神經(jīng)裂閉合有關(guān)［22］。而在人類早產(chǎn)相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)， ?ADAMTS16基因的甲基化在調(diào)節(jié)早期胎盤形成和早產(chǎn)易感性中具有重要的影響［23］。此外，通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)， ?ADAMTS16的突變可能與重度抑郁癥、雙向情感障礙和精神分裂等疾病有關(guān)［24］。

本研究將來源于牛 ?ADAMTS16基因的環(huán)狀非編碼RNA命名為 ?circADAMTS16，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在牛各組織中廣泛表達(dá)，在脂肪組織中表達(dá)量較高，提示 ?circADAMTS16可能對(duì)脂肪生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用。隨后檢測(cè) ?circADAMTS16在不同誘導(dǎo)階段前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在誘導(dǎo)分化第2天的表達(dá)量最高，而后又逐漸降低，直至誘導(dǎo)第8天達(dá)到最低，表明 ?circADAMTS16在脂肪細(xì)胞增殖分化中的潛在作用，這一結(jié)果與 ?circFUT10促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖研究結(jié)果相一致［25］。RNase R是一種3′-5′外切核糖核酸酶，在許多多聚腺苷酸化的 mRNA 體內(nèi)停滯，基本上可消化所有線性RNA，circRNA因其具有共價(jià)連接的末端能抵抗RNase R的降解［26］。對(duì) ?circADAMTST6接口進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)克隆獲得的序列與NCBI公布的序列達(dá)到100%一致，以RNase R消化獲得cDNA為模板擴(kuò)增得到 ?circADAMTS16片段，進(jìn)一步證實(shí)它的真實(shí)存 ?在性。

PPARγ促進(jìn)脂肪酸在脂肪中的儲(chǔ)存，在脂肪沉積過程中具有重要?????? 作用，被普遍認(rèn)為是脂肪沉積的標(biāo)志基因［27-28］。CEBPs在脂肪細(xì)胞分化過程中促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化并延長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)程，與PPARγ同為脂肪分化的特異性基因［29］。本研究過表達(dá)牛原代前體脂肪細(xì)胞中的 ?circADAMTS16并誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)成脂標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，油紅O染色結(jié)果顯示過表達(dá) ?circADAMTS16后脂滴形成大小明顯低于對(duì)照組；反之，干擾 ?circADAMTS16后，PPARγ和C/EBPα的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，由此表明 ?circADAMTS16抑制牛前體脂肪細(xì)胞分化。在棕櫚酸酯通過激活 ?C/EBPβ介導(dǎo)的G0/G1開關(guān)基因2（G0/G1 switch gene 2， G0S2）表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的研究中，Zhao等［30］通過對(duì)成脂標(biāo)志基因及油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)積累，并通過提取的油紅O染料的吸光度值進(jìn)行定量。

在本研究中，利用qRT-PCR檢測(cè) ?circADAMTS16在牛7種組織和牛脂肪細(xì)胞分化過程中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn) ?circADAMTS16在牛組織中普遍表達(dá)，其在脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)與分化時(shí)間有關(guān)。通過構(gòu)建的過表達(dá)和干擾牛原代前體脂肪細(xì)胞模型，檢測(cè)成脂標(biāo)志基因相對(duì)表達(dá)量，從分子水平和表型檢測(cè)結(jié)果得出 ?circADAMTS16抑制牛原代前體脂肪細(xì)胞分化。

4 結(jié)? 論

綜上，本研究構(gòu)建 ?circADAMTS16組織表達(dá)譜和時(shí)空表達(dá)譜，探究 ?circADAMTS16在牛組織和脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)特點(diǎn)；構(gòu)建 ?circADAMTS16過表達(dá)和干擾脂肪細(xì)胞模型，探索 ?circADAMTS16對(duì)牛前體脂肪細(xì)胞分化的影響。研究結(jié)果表明， ?circADAMTS16抑制牛前體脂肪細(xì)胞的分化，該研究結(jié)果可為進(jìn)一步解析 ?circADAMTS16在牛脂肪沉積過程中的作用機(jī)制提供參考信息。

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Expression Profile Analysis of? ?circADAMTS16 and Its Effect on? Differentiation of Bovine Adipocytes

Abstract The expression level of? ?circADAMTS16 in different tissues and precursors of bovine adipose cells and its effects on the differentiation of bovine adipose cells were studied in this paper， so as to provide a basisfor the further study of the regulatory role of circRNA in cell differentiation and adipose tissue development. Tissue block method was used to simulate the growth and development of bovine adipose tissue. The expression levels of? ?circADAMTS16? in different tissues （heart， liver， spleen， lung， kidney， muscle and fat） and adipocyte differentiation in cattle at different stages （0， 2， 4， 8 and 10 day） was detected by qRT-PCR.Then， the overexpression vector of? ?circADAMTS16 （pCD2.1- ?circADAMTS16） was constructed， and the small interfering RNA of? ?circADAMTS16 （si- ?circADAMTS16） was designed and synthesized. The bovine precursor adipocytes were transfected with pCD2.1- ?circADAMTS16 and si- ?circADAMTS16 by using （Lipofectamine3000） transfection reagent. The transfection effect was detected by qRT-PCR， and the expression changes of adipose differentiation marker genes PPARγ， C/EBPα? and C/EBPβ?? were detected at the same time. Oil red O staining was performed to comprehensively analyze the effects of interference and overexpression of? ?circADAMTS16 on the differentiation of bovine adipocytes. The results showed that：①the results of qRT-PCR assay showed that the expression level of? ?circADAMTS16? was the highest in the heart， followed by the liver， and the lowest in the spleen. ②During the differentiation of bovine primary precursor adipocytes， the expression of? ?circADAMTS16 was significantly higher on day 2 （P<0.01）， then gradually decreased and was the lowest on day 8. ③After overexpression of ?circADAMTST16? in bovine precursor adipocytes， the expression levels of? PPARγ， C/EBPα? and C/EBPβ??? decreased? significantly（P< 0.01）. Oil red O staining showed that the number of lipid droplets formed after overexpression was significantly less than that in the control group. The expression levels of PPARγ and? C/EBPα?? significantly increased after? ?circADAMTS16 was interfered with （P<0.01）.In summary，? ?circADAMTS16 has a significant regulatory effect on the differentiation of primary bovine preadipocytes. Overexpression of? ?circADAMTS16 inhibits the differentiation of primary bovine precursor adipocytes， while interfering with the expression of? ?circADAMTS16 promotes the differentiation of primary bovine precursor adipocytes. The specific regulation of? ?circADAMTS16 on the differentiation of bovine primary precursor adipocytes was proved.

Key words Cattle;? ?circADAMTS16; Adipocytes; Vector construction; Overexpression