杜江源，張?zhí)m林，蔡同凱，曹永兵

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管病研究所, 上海 200082；2.上海市同濟(jì)醫(yī)院, 上海 200065；3.海軍軍醫(yī)大學(xué), 上海 200433）

針對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的靶向藥EGFRTKIs，自第一代問(wèn)世以來(lái)發(fā)展迅速，目前第四代已在臨床研發(fā)階段。但由于新的耐藥突變的不斷產(chǎn)生，導(dǎo)致其應(yīng)用受限。因此如何克服EGFR-TKIs耐藥問(wèn)題和尋找可改善肺癌靶向治療耐藥的藥物已成當(dāng)務(wù)之急。植物來(lái)源的單體成分種類(lèi)繁多，應(yīng)用前景巨大。毒胡蘿卜（Thapsia garganicaL.，傘形科毒胡蘿卜屬）是于地中海西部沿海地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種開(kāi)花植物，一直被作為止痛劑應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。毒胡蘿卜素是從該植物中分離的單體化合物，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）的誘導(dǎo)劑，近年也被用于抗腫瘤和抗病毒研究。吉非替尼作為第一代EGFR-TKIs，副作用小，有效率高。本研究旨在探討毒胡蘿卜素和吉非替尼聯(lián)合用藥對(duì)人肺腺癌耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR耐藥性的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

吉非替尼（純度99.94%，HY-50 895）、毒胡蘿卜素（純度99.95%，HY-13 433）、CCK8 試劑（HYK0301-500T）均購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；胎牛血清（F8318-500ML）和DMEM 培養(yǎng)基（D6429-500ML）購(gòu)自美國(guó)Sigam Aldrich 公司；胰酶（25 200-072）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；凋亡試劑盒（559 763）購(gòu)自美國(guó)BD 公司； ATF-6 抗體（#65880）、IRE1α 抗體（#3294）均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；羊抗兔二抗（AS003）購(gòu)自abclonal；PVDF 膜購(gòu)自Millipore；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。人肺腺癌?xì)胞（PC9）由同濟(jì)醫(yī)院惠贈(zèng)，PC9/GR 細(xì)胞購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。

圖1 吉非替尼對(duì)PC9 和PC9/GR 細(xì)胞增殖率的影響

圖2 毒胡蘿卜素對(duì)PC9 和PC9/GR 細(xì)胞增殖的影響

圖3 不同濃度的毒胡蘿卜素聯(lián)合吉非替尼對(duì)PC9/GR 增殖的影響

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

PC9 細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中含10%的胎牛血清、100 U/ml 的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。PC9/GR 細(xì)胞使用上述培養(yǎng)基維持培養(yǎng)并額外含800 ng/ml 的吉非替尼。

1.2.2 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

檢測(cè)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性：分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9 和PC9/GR 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為40 000/ml，接種于96 孔板，每孔100 μl細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。吸棄96 孔板上清液，加入含藥培養(yǎng)基（PC9 細(xì)胞中吉非替尼濃度分別為0、1、5、10、20、40、80、250、500、1 000 nmol/L；PC9/GR 細(xì)胞中吉非替尼的濃度分別為0、1、10、100、1 000、2 500、5 000、10 000、20 000、40 000 nmol/L），同時(shí)設(shè)對(duì)照組，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。72 h 時(shí)吸棄上清液，再加入含CCK8 的DMEM，0.5 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450。

檢測(cè)毒胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞增殖的影響：分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9 和PC9/GR 細(xì)胞同上述處理鋪96 孔板，貼壁后加入濃度為0.1、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L 的毒胡蘿卜素，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。72 h 時(shí)使用CCK8 法檢測(cè)A450。

檢測(cè)毒胡蘿卜素對(duì)PC9/GR 細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)：取PC9/GR 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞同上述處理鋪96 孔板，設(shè)12 組，加入吉非替尼的濃度分別為0、4.5、4.5、4.5、4.5、4.5、0、9、9、9、9、9 μmol/L，毒胡蘿卜素的濃度分別為0、0、0.1、1、10、100、 0、0、0.1、1、10、100 nmol/L。72 h 時(shí)用CCK8 法檢測(cè)A450。

檢測(cè)毒胡蘿卜素對(duì)PC9/GR 細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)：取PC9/GR 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞同上述處理鋪96 孔板，設(shè)兩組，為吉非替尼單藥組和聯(lián)合用藥組：其中單藥組設(shè)7 個(gè)小組，加入吉非替尼的濃度分別為0、1、10、102、103、104、105μmol/L；聯(lián)合用藥組設(shè)7 個(gè)小組，每小組加入10 nmol/L 的毒胡蘿卜素，同時(shí)加入濃度分別為0、1、10、102、103、104、105nmol/L 的吉非替尼。72 h 時(shí)用CCK8 法檢測(cè)A450。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（RF）=逆轉(zhuǎn)前的IC50值/逆轉(zhuǎn)后的IC50值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9/GR 鋪6 孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，孵育過(guò)夜，吸棄上清液，加入含藥培養(yǎng)基（對(duì)照組為9 μmol/L 的吉非替尼組，實(shí)驗(yàn)組為9 μmol/L 的吉非替尼組+10 nmol/L 的毒胡蘿卜素聯(lián)合用藥組），孵育72 h 后，收集上清液及貼壁細(xì)胞，按說(shuō)明書(shū)加入膜聯(lián)蛋白（Annexin V-PE），室溫孵育20 min 后，再加入7-AAD，5 min 后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè)PC9/GR 細(xì)胞ERS 相關(guān)蛋白IRE1α、ATF-6 的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9/GR 鋪6 孔板，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，孵育過(guò)夜，吸棄上清液，加入含藥培養(yǎng)基（每孔吉非替尼濃度依次為0、0、4.5、4.5、9、9 μmol/L，毒胡蘿卜素濃度依次為0、10、0、10、0、10 nmol/L），培養(yǎng)72 h，去上清液，收集細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)量樣品中總蛋白濃度。蛋白變性后取蛋白樣品，使用蛋白印跡法檢測(cè)IRE1α、ATF-6蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性者采用單因素方差分析的單向分類(lèi)方差分析（ANOVA），對(duì)取得的數(shù)據(jù)兩兩比較使用 LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吉非替尼對(duì)PC9 和PC9/GR 細(xì)胞株的IC50 值

吉非替尼對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9 和PC9/GR的IC50值經(jīng)計(jì)算分別為0.101 9 μmol/L（圖1A）和8.912 μmol/L（圖1B），按公式計(jì)算耐藥倍數(shù)為87.5（本課題中PC9 和PC9/GR 細(xì)胞株的IC50值分別以0.1 μmol/L 和9 μmol/L 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）。

2.2 CCK8 法檢測(cè)毒胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

毒胡蘿卜素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9 和PC9/GR的增殖均有抑制作用，呈劑量依賴(lài)性。當(dāng)毒胡蘿卜素濃度為10 nmol/L 時(shí)，對(duì)PC9 和PC9/GR 的抑制率分別為14.7%（圖2A）和4.11%（圖2B）。毒胡蘿卜素濃度為10 nmol/L 時(shí)對(duì)PC9 細(xì)胞的增殖顯示較弱的抑制作用，而對(duì)PCR/GR 細(xì)胞增殖的作用與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。抑制率（IR）＝（1-藥物組A值/對(duì)照組A值）×100%。本課題中，毒胡蘿卜素的工作濃度選擇10 nmol/L 或者圍繞10 nmol/L進(jìn)行設(shè)計(jì)。

2.3 毒胡蘿卜素對(duì)PC9/GR 耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

相比于吉非替尼單獨(dú)用藥，毒胡蘿卜素（濃度依次為0、0.1、1、10、100 nmol/L）和吉非替尼（4.5 μmol/L或9 μmol/L）聯(lián)合用藥72 h 時(shí)，PC9/GR 的細(xì)胞增殖率在10 nmol/L 和100 nmol/L 時(shí)顯著下降，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性（圖3A、B）。

在不同濃度（0、1、10、102、103、104、105nmol/L）的吉非替尼聯(lián)合10 nmol/L 的毒胡蘿卜素作用后，PC9/GR 的細(xì)胞增殖率相比吉非替尼單獨(dú)用藥（吉非替尼組濃度依次為0、1、10、102、103、104、105nmol/L）也出現(xiàn)了下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。計(jì)算得出吉非替尼單獨(dú)用藥的IC50值為11.039 μmol/L，聯(lián)合用藥后其IC50值為3.584 μmol/L，其RF 為3.15。

圖4 不同濃度的吉非替尼與毒胡蘿卜素聯(lián)合用藥對(duì)PC9/GR 增殖的影響

2.4 藥物作用對(duì)PC9/GR 細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組（圖5A）、吉非替尼單獨(dú)作用（圖5B）、毒胡蘿卜素單獨(dú)作用（圖5）相比，聯(lián)合用藥（圖5）后PC9/GR 細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均相應(yīng)增加，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5）。說(shuō)明毒胡蘿卜素在一定程度上可以改善PC9/GR 細(xì)胞的耐藥性。

圖5 吉非替尼、毒胡蘿卜素及兩者聯(lián)合用藥對(duì)PC9/GR 細(xì)胞凋亡的影響

2.5 Western blotting 法檢測(cè)藥物作用對(duì)細(xì)胞PCR/GR中ATF-6 和IRE1α 蛋白表達(dá)的影響

圖6 毒胡蘿卜素、吉非替尼及兩者聯(lián)合用藥對(duì)PC9/GR 細(xì)胞中ATF-6 和IRE1α 蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與吉非替尼組1 或2 相比，藥物作用后聯(lián)合用藥組1 或聯(lián)合用藥組2 中PC9/GR 細(xì)胞的ATF-6 及IRE1α 蛋白表達(dá)均上調(diào)（圖6A），并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6B、C）。ATF-6 和IRE1α 均是ERS 的指標(biāo)蛋白，說(shuō)明PC9/GR 細(xì)胞在藥物聯(lián)合作用后發(fā)生了ERS。

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界最常見(jiàn)、致死率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1]。NSCLC 是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，約占所有比例的85%[2]。約70%的NSCLC 患者在確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)。近年來(lái)，NSCLC 的分子靶向治療發(fā)展迅速，靶向藥EGFR-TKIs 不斷更新，成為放化療和免疫治療之外的重要治療手段之一。

截止目前，EGFR-TKIs 已從第1 代發(fā)展至第3 代[3]，且有多款第4 代靶向藥已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。然而由于抗腫瘤耐藥性，患者使用靶向藥一定時(shí)間后不可避免的會(huì)出現(xiàn)耐藥[4]。于是尋找能夠克服腫瘤耐藥的藥物及方法已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域中亟待解決的問(wèn)題。由于中草藥植物的毒副作用小且療效明確，故從中尋找能夠克服腫瘤耐藥的成分已經(jīng)成為一種趨勢(shì)。毒胡蘿卜素是從地中海菊屬植物中提取的單體成分[5]，作為常用的ERS 的誘導(dǎo)劑，毒胡蘿卜素在科研中有著廣泛的應(yīng)用[6]。也有文獻(xiàn)報(bào)道其有抗腫瘤活性[7]，同時(shí)對(duì)冠狀病毒、合胞病毒、甲型流感病毒等有較強(qiáng)的抑制作用[8]。本研究中使用的吉非替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR 經(jīng)CCK8 實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)吉非替尼具有耐藥性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉非替尼對(duì)PC9 的IC50值為0.101 9 μmol/L（圖1A），對(duì)PC9/GR 的IC50值為8.912 μmol/L（圖1B），耐藥倍數(shù)為87.6。當(dāng)毒胡蘿卜素濃度為 10 nmol/L時(shí)，對(duì)PCR/GR 細(xì)胞增殖的作用與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故該濃度的毒胡蘿卜素未顯示出對(duì)PCR/GR 的細(xì)胞增殖的抑制作用（圖2B），故本課題中毒胡蘿卜素選擇10 nmol/L 作為實(shí)驗(yàn)濃度。而提高毒胡蘿卜素的濃度，其對(duì)PC9/GR 細(xì)胞抑制率也增加，表明毒胡蘿卜素本身對(duì)于肺腺癌細(xì)胞PC9/GR具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥中當(dāng)毒胡蘿卜素濃度為大于或等于10 nmol/L 時(shí)，PCR/GR 細(xì)胞的增殖相比吉非替尼單獨(dú)用藥受到了更強(qiáng)的抑制，并具有顯著性差異（圖3A、B）。本課題同時(shí)使用不同濃度的吉非替尼聯(lián)合10 nmol/L 的毒胡蘿卜素共同作用于PC9/GR 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有聯(lián)合用藥組相比于吉非替尼單獨(dú)用藥組，均對(duì)PC9/GR 細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。分別計(jì)算吉非替尼單藥和聯(lián)合用藥對(duì)PC9/GR 細(xì)胞的IC50值，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥的IC50值降低（圖4），逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.15。說(shuō)明10 nmol/L 的毒胡蘿卜素可以有效改善PC9/GR 對(duì)吉非替尼的耐藥。

腫瘤細(xì)胞的耐藥性嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后。耐藥突變、自噬、腫瘤免疫微環(huán)境都是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的因素[9]。由于耐藥突變，EGFR-TKIs 治療已經(jīng)陷入了研究人員開(kāi)發(fā)新藥物與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生新耐藥突變的循環(huán)之中。近年來(lái)，因自噬異常與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展、細(xì)胞死亡及抗腫瘤治療療效相聯(lián)系而受到廣泛關(guān)注[10]。但是抑制自噬只能延緩EGFRTKI 耐藥的產(chǎn)生，并不能有效解決耐藥的問(wèn)題[11]。因此，耐藥問(wèn)題亟待找到新的解決方法。體內(nèi)低氧、低糖等惡劣環(huán)境會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生ERS，并啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)從而讓細(xì)胞重新恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。ERS 過(guò)度可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。因此，ERS 也與肺癌治療息息相關(guān)[12]。毒胡蘿卜素作為研究ERS 常用的激動(dòng)劑，是一種特異性的肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP 酶抑制劑，能夠使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+量減少、未折疊蛋白增多，引起ERS[13]。本研究中通過(guò)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，和單獨(dú)用藥相比，毒胡蘿卜素聯(lián)合吉非替尼聯(lián)合用藥可以進(jìn)一步促進(jìn)PC9/GR 細(xì)胞的凋亡（圖5B、D 和E）。通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，聯(lián)合用藥相比吉非替尼單獨(dú)用藥，PC9/GR 細(xì)胞中ATF-6（圖6A、B）和IRE1α 蛋白（圖6A、C）的表達(dá)均上調(diào)，表明聯(lián)合用藥后PC9/GR 細(xì)胞處于ERS 狀態(tài)。這是毒胡蘿卜素有效改善PC9/GR對(duì)吉非替尼耐藥的可能原因之一。

綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)毒胡蘿卜素低濃度下可以有效促進(jìn)PC9/GR 的ERS，高濃度下對(duì)肺癌細(xì)胞具有直接殺傷作用，說(shuō)明毒胡蘿卜素本身具有抗腫瘤活性，本課題同時(shí)證實(shí)，毒胡蘿卜素能增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PC9/GR 的殺傷作用。其可能的機(jī)制是，在抗腫瘤藥物和ERS 狀態(tài)的雙重壓力下，肺腺癌耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR 對(duì)靶向藥吉非替尼的敏感性增加。因此，毒胡蘿卜素有望成為解決非小細(xì)胞肺癌靶向治療耐藥的潛在藥物之一，但其中的機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索。