謝 旭

南陽市第一人民醫(yī)院婦科，河南 南陽 473000

宮頸癌是最常見的癌癥之一，是女性癌癥死亡的第三大原因。越來越多的研究［1］表明，長期感染高危人類乳頭瘤病毒（HPV）、HPV16、HPV18 等是宮頸癌患者的主要組成部分。事實(shí)上，并不是所有的轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者都被診斷為HPV感染，這表明許多不確定因素可能導(dǎo)致宮頸癌的開始和發(fā)展。盡管手術(shù)結(jié)合放療和/或化療已經(jīng)取得進(jìn)展，但部分宮頸癌患者出現(xiàn)原發(fā)腫瘤侵襲和早期轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良，治療效果不佳［2］。因此，闡明宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制非常重要。

通過篩選與Wnt 信號中樞的散亂蛋白相互作用的蛋白，研究者分離出了β-環(huán)連蛋白抑制基因（DACT）支架蛋白家族，包括DACT1、DACT2 和DACT3。DACT 又名Dapper／Frodo，DACT 家族最初是在非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)的，其能夠結(jié)合Dsh 并且穩(wěn)定β-catenin 降解復(fù)合物。DACT 編碼可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號通路的脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)蛋白，根據(jù)以往的報(bào)道，DACT 蛋白在不同的腫瘤類型中都具有抑制腫瘤的作用［3］。此外，在肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等部分原發(fā)腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)DACT1 和DACT2 表達(dá)下降和啟動(dòng)子高甲基化，但在宮頸癌組織中DACT2的基因啟動(dòng)子甲基化作用機(jī)制尚不清楚［4］。在本研究中，研究者試圖檢測DACT2 在宮頸癌組織中的作用和甲基化狀態(tài)，并闡明其與宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年1 月—2022 年3 月在南陽市第一人民醫(yī)院就診的60 例宮頸癌患者作為觀察組，再選擇同期60 例健康體檢者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)檢查均確診為宮頸癌且均首次確診，此前未通過任何方式進(jìn)行治療，患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：處于妊娠期或者哺乳期，除宮頸癌之外患有其他各種惡性腫瘤，患有宮頸婦科炎癥，由于各種原因無法配合完成本次研究。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，并提供了參與研究的知情同意書。術(shù)后采集其宮頸癌組織及配對正常相鄰宮頸癌組織，立即用液氮保存，宮頸癌及癌旁正常組織切片均于醫(yī)院病理科取得。

1.2 方法

1.2.1 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測mRNA 表達(dá) 根據(jù)試劑盒的使用說明書，使用Trizol 試劑從組織中分離總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法評價(jià)RNA 的質(zhì)量和數(shù)量，其中引物按照RT-PCR 試劑盒說明書中推薦完成選擇，以甘油醛—3—磷酸脫氫酶（GAPDH）基因作為內(nèi)對照。對于PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色顯示，并使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。采用Stepone Plus 熱循環(huán)儀和SYBR 綠色PCR Master Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)，目的基因表達(dá)量采用2-△△CT 法，用GAPDH 歸一化，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行3 次上述反應(yīng)［5］。

1.2.2 DACT2免疫組化觀察 采用親和素—生物素復(fù)合物免疫過氧化物酶免疫染色法檢測組織中DACT2、DACT 表達(dá)。阻斷內(nèi)源性過氧化酶和非特異性反應(yīng)后，用兔抗人多克隆抗體DACT2（1∶100稀釋）孵育載片，然后用生物素化二抗和ABC 試劑孵育，以3,3’—二氨基聯(lián)苯胺為顯色劑，蘇木精反染，陰性對照用非免疫血清代替一抗作為陰性對照，以DACT2染色陽性的載玻片為陽性對照。DACT2表達(dá)按照評分方法進(jìn)行評估，評分與陽性細(xì)胞的強(qiáng)度和百分比有關(guān)［6］。

1.2.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）和亞硫酸氫鹽基因組測序（BGS）分析DACT 甲基化 用DNAzol 組織中分離總DNA，用蛋白酶K 消化法從組織中制備基因組DNA?；蚪MDNA 用Epitect Fast 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換試劑盒完成相關(guān)處理，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后可轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能轉(zhuǎn)化，仍然是胞嘧啶。基于亞硫酸氫鈉處理后甲基化和非甲基化等位基因的DNA 序列電位差，研究者設(shè)計(jì)了MSP 引物來分析DACT2的區(qū)域。DACT2的甲基化狀態(tài)在包含轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位區(qū)域內(nèi)測定，用2%瓊脂糖凝膠和溴化乙錠對MSP產(chǎn)品進(jìn)行分析，并在紫外照明下進(jìn)行可視化?；蚪MDNA 使用CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶處理，作為陽性對照，以水空白為陰性對照。為保證質(zhì)量控制，對每個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)甲基化分析。針對BGS，設(shè)計(jì)了用于識別亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化DNA 的引物，純化BGS PCR產(chǎn)物的目的片段，克隆到pGEM-T載體上，每個(gè)標(biāo)本的10個(gè)克隆進(jìn)行熒光自動(dòng)測序［7］。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)宮頸癌患者的病理特征，包括年齡、腫瘤大小、FIGO 分期、有無細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及宮頸浸潤深度；根據(jù)1.2 方法檢測宮頸癌組織、癌旁組織和正常組織的DACT2去甲基化發(fā)生率、DACT2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平；采用Pearson檢驗(yàn)法，分析DACT2啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性，其中檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者的病理特征

宮頸癌患者的病理特征中分期、有無細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及宮頸浸潤深度所占百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而年齡和腫瘤大小比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 宮頸癌患者的病理特征（n=60）

2.2 DACT2去甲基化發(fā)生情況

宮頸癌組織、癌旁組織和正常組織中DACT2去甲基化發(fā)生率分別為45.00%、6.67%和5.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 DACT2去甲基化發(fā)生情況

2.3 DACT2 mRNA和蛋白表達(dá)水平

宮頸癌甲基化組DACT2 mRNA 和DACT2 蛋白表達(dá)水平低于宮頸癌非甲基化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 DACT2 mRNA和蛋白表達(dá)水平（±s）

表3 DACT2 mRNA和蛋白表達(dá)水平（±s）

組別宮頸癌甲基化組宮頸癌非甲基化組t值P值DACT2 mRNA 0.78±0.14 1.54±0.19 11.332 0.001 DACT2蛋白1.13±0.19 2.38±0.26 8.543 0.001

2.4 DACT2 啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明，DACT2啟動(dòng)子甲基化是引發(fā)宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 DACT2啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

DACT 家族蛋白最初在爪蟾中被發(fā)現(xiàn)。人類DACT 家族有3個(gè)成員，DACT1、DACT2和DACT3的編碼基因分別位于人類14q22.3、6q27 和19q13.32 染色體上。此前的研究［8-9］表明，人類DACT 在人類癌癥中經(jīng)常是沉默的，例如DACT2 基因所在的6q 染色體的缺失是人類腫瘤中最常見的染色體畸變之一，除了缺失外，DACT 的表觀遺傳修飾也被報(bào)道。例如有報(bào)道稱［10］DACT1 和DACT2 在肝細(xì)胞癌、口腔鱗狀癌、胃癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中被甲基化，此外，DACT3在甲狀腺乳頭狀癌中被發(fā)現(xiàn)有組蛋白修飾［11］。DACT2 在宮頸癌中的功能和表達(dá)調(diào)控在很大程度上是未知的。

采用RT-qPCR 和Western blot 方法檢測DACT2 啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，宮頸癌組織、癌旁組織和正常組織中DACT2去甲基化發(fā)生率分別為45.00%、6.67% 和5.00%。同 樣 的，有 研 究［12］發(fā) 現(xiàn)，DACT2在乳腺癌組織和細(xì)胞系中經(jīng)常處于沉默狀態(tài)，對這些DACT2 沉默的乳腺癌組織和細(xì)胞系的MSP 分析表明，DACT2 啟動(dòng)子高甲基化，且乳腺癌細(xì)胞中DACT2 的丟失主要是由于DACT2 啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化。DACT2 基因編碼的Dapper2 蛋白對Wnt 通路具有較強(qiáng)的抑制作用，可通過對Wnt 通路中的Dishevelled 因子相互作用并促進(jìn)其降解，來減弱由GSK3β、Axin 等組成的降解復(fù)合物對通路中心因子β-catenin 的降解，以抑制該信號通路的活化，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，宮頸癌甲基化組DACT2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平低于宮頸癌非甲基化組。相關(guān)性分析結(jié)果表明，DACT2啟動(dòng)子甲基化是引發(fā)宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的因素。同樣有研究［13］用細(xì)胞生長曲線法評價(jià)DACT2 對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，用Transwell 法評價(jià)DACT2 對癌細(xì)胞侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)DACT2 過表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，而DACT2 啟動(dòng)子甲基化可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。目前的數(shù)據(jù)表明，DACT2 在乳腺癌中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。DNA 甲基化是一種主要的表觀遺傳機(jī)制，涉及甲基轉(zhuǎn)移到C5 碳?xì)埢陌奏ぃ?mC），由一個(gè)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族介導(dǎo)DNA 甲基化在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括基因表達(dá)調(diào)控、基因組印記、細(xì)胞分化、發(fā)育和炎癥異常甲基化，大多數(shù)DACT2 均是未甲基化的，這些DACT2 的高甲基化是腫瘤細(xì)胞中常見的改變之一，可能導(dǎo)致腫瘤抑制基因的沉默［14］。而DACT2 基因在肺癌細(xì)胞中被高甲基化，一些研究已經(jīng)報(bào)道甲基化標(biāo)記比蛋白質(zhì)標(biāo)記更敏感，因此，癌癥特異性甲基化標(biāo)記在臨床上用于準(zhǔn)確診斷癌癥有很大的潛力［15-16］。

綜上所述，宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移主要影響因素就是DACT2 啟動(dòng)子甲基化，且DACT2 啟動(dòng)子甲基化率越高，細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移程度就越高。因此，臨床應(yīng)密切監(jiān)測患者DACT2啟動(dòng)子甲基化情況，有助于優(yōu)化宮頸癌患者的治療方案。此外，本研究提示DACT2啟動(dòng)子甲基化可能促進(jìn)了乳腺癌的進(jìn)展，這也為乳腺癌的治療提供了一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。