張 研, 雷勝男, 張 茜1, , 3, 哈小琴, 馬慧萍,孫海燕, 周士燕1,

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院, 1. 血液科, 5. 全軍高原醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州, 730050;2. 西北民族大學(xué), 甘肅 蘭州, 730106; 3. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州, 730000;4. 甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州, 730050)

急性高原病(AMS)是指人群從平原進(jìn)入高海拔地區(qū)或久居高原者進(jìn)入更高的海拔地區(qū),在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)病,并出現(xiàn)一系列非特異性臨床表現(xiàn)的綜合征,嚴(yán)重時(shí)可引起多器官應(yīng)激綜合征,如腦水腫、肺水腫、心力衰竭。AMS的發(fā)生和發(fā)展與高原地區(qū)低壓低氧環(huán)境密切相關(guān),尤其是腦組織對(duì)缺氧極為敏感。高原腦水腫(HACE)是一種與高原疾病相關(guān)的嚴(yán)重且致命疾病,屬于重型急性高原病[1-2], 主要臨床表現(xiàn)為頭暈、頭痛、共濟(jì)失調(diào)、意識(shí)模糊等,是AMS的晚期,如治療不及時(shí)患者易在發(fā)病24 h內(nèi)死亡。高原地區(qū)具有低壓低氧、寒冷干燥、強(qiáng)紫外線等環(huán)境特點(diǎn),使得長(zhǎng)期生活在低海拔地區(qū)的人迅速進(jìn)入高原地區(qū)時(shí)極易發(fā)生HACE[3]。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、間充質(zhì)干細(xì)胞 來(lái)源細(xì)胞外囊泡(MSC-EVs)、間充質(zhì) 干細(xì)胞源性外泌體(MSC-Exos)

MSC在組織修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要作用,可誘導(dǎo)血管生成,特別是在缺氧條件下更有利于血管再生,促進(jìn)受損組織修復(fù)。但是缺氧MSC活化的分子機(jī)制尚不明確。MSC-EVs可產(chǎn)生與其親本MSC相似的治療效果,因具有免疫原性低、易于儲(chǔ)存、生物安全性高等特點(diǎn),與全細(xì)胞治療相比更具有優(yōu)勢(shì)[4]。MSC-EVs通過(guò)向受體細(xì)胞遞送微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)和蛋白質(zhì)傳遞信號(hào),直接發(fā)揮細(xì)胞、組織修復(fù)和再生的作用,避免了干細(xì)胞移植療法的許多不良反應(yīng)[5]。此外,因MSC-EVs不是活細(xì)胞, MSC-EVs治療可以解決由存活率低導(dǎo)致的MSC療效差的弊端。MSC-EVs可分為MSC-Exos、細(xì)胞微泡和凋亡小體3種類型,其中, MSC-Exos是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。MSC、MSC-Exos廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域,在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作用尤為突出,目前HACE治療無(wú)特效藥,新的防治藥物研發(fā)迫在眉睫。MSC、MSC-Exos有望成為防治HACE的新選擇。

2 MSC防治HACE的潛在作用機(jī)制

2.1 腦血流量增加及血液-腦屏障(BBB)破壞

在進(jìn)入高原地區(qū)初期,由于缺氧的刺激,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng),包括腦血管擴(kuò)張、通氣量增加和心率加快,以增加腦血流量,從而提供更多的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給大腦。然而,這種腦血流量的增加也會(huì)導(dǎo)致血液對(duì)血管壁的側(cè)壓力增加引起顱內(nèi)壓升高,顱內(nèi)壓升高會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成機(jī)械性損傷,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致BBB的破壞。BBB是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和緊密連接蛋白組成的屏障,作用是將中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血液循環(huán)分開,阻止有害物質(zhì)進(jìn)入大腦[6-7]。缺氧會(huì)引起內(nèi)皮緊密連接蛋白中斷,從而破壞BBB的完整性[8]。此外,缺氧還會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致血管壁破壞,使得BBB的屏障功能受損,有害物質(zhì)可以進(jìn)入大腦[9]。缺氧還會(huì)引起一系列生物化學(xué)反應(yīng)的改變,包括缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α的表達(dá)和激活以及基質(zhì)金屬蛋白9的表達(dá)和激活。HIF-1α是一種重要的調(diào)節(jié)因子,可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的發(fā)生,從而導(dǎo)致BBB的破壞?；|(zhì)金屬蛋白9是一種可以降解血管基底膜的酶,其活化也會(huì)導(dǎo)致BBB的破壞。此外,血管內(nèi)皮細(xì)胞還會(huì)分泌一系列的細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β等,它們的失衡也會(huì)導(dǎo)致BBB的破壞。這些細(xì)胞因子還可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,進(jìn)一步加劇BBB的損傷。綜上所述,高原地區(qū)缺氧引起的腦血流量增加及BBB的破壞會(huì)引發(fā)一系列病理生理變化。這些變化通過(guò)多種途徑相互作用,最終導(dǎo)致BBB的破壞,使有害物質(zhì)進(jìn)入大腦,加速HACE的形成[10]。進(jìn)一步的研究可以揭示這些途徑的具體機(jī)制,為預(yù)防和治療高原腦水腫提供新的思路和方法。

以上眾多因素中,內(nèi)皮細(xì)胞損傷是BBB完整性被破壞導(dǎo)致腦水腫的關(guān)鍵因素[11-13]。ZHAO B等[14]認(rèn)為,在急性低壓缺氧(模擬6 000 m高空)環(huán)境中脂多糖誘導(dǎo)的大鼠全身炎癥可能會(huì)通過(guò)破壞BBB完整性和激活小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)加重腦水腫。缺氧損傷BBB的內(nèi)皮細(xì)胞,引起細(xì)胞外水腫。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中一種巨噬細(xì)胞,在極化狀態(tài)下對(duì)維持血BBB的完整性具有雙重作用[15-16]。正常環(huán)境下,小膠質(zhì)細(xì)胞維持BBB的完整性,但活化小膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)激活分化成M1型、M2型2種形式,M1型具有有害的神經(jīng)毒性作用, M2型能夠促進(jìn)組織修復(fù)和神經(jīng)保護(hù),其中M1型介導(dǎo)了HACE的發(fā)生[17]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞由于趨化作用被募集到血管中,吞噬血管內(nèi)皮的緊密連接的同時(shí)導(dǎo)致血管通透性增加,進(jìn)而引起B(yǎng)BB的破壞。研究[18-20]顯示, MSC能夠誘導(dǎo)M2型的產(chǎn)生,進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)及保護(hù)作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的胞外囊泡通過(guò)核因子(NF)-κB和絲裂原活化蛋白激酶途徑促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1。MSC抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生,減少CD68+小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的合成,從而減輕神經(jīng)損傷部位內(nèi)的炎癥。此外,來(lái)自人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的EVs可以穩(wěn)定小膠質(zhì)細(xì)胞,以避免其過(guò)度活化、遷移和增殖,從而減少炎性細(xì)胞因子的分泌,并增加抗炎基因的表達(dá),從而減輕神經(jīng)炎癥,進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]。MSC-EVs的膜富含膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和脂質(zhì)蛋白,可以通過(guò)胞吞、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)-3/Snap23/syntaxin 4依賴性EVs作用穿過(guò)BBB來(lái)充分發(fā)揮療效[22]。

2.2 腦細(xì)胞損害

腦耗氧量非常大,對(duì)缺氧極為敏感,缺氧導(dǎo)致Na+-K+-ATP酶受損、細(xì)胞鈉-鉀泵功能失調(diào),進(jìn)而影響水分子擴(kuò)散,使腦細(xì)胞腫脹而出現(xiàn)HACE, 每個(gè)腦細(xì)胞受損程度決定HACE的預(yù)后,細(xì)胞毒性腦水腫和線粒體自噬引起單個(gè)腦細(xì)胞受損。ARCHACKA K等[23]發(fā)現(xiàn),將缺氧預(yù)處理的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)移植到受傷的肌肉組織中,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)高表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、使肌肉組織再生,這也充分表明缺氧MSC能夠表現(xiàn)出更高的體內(nèi)組織修復(fù)潛力[24]。LIU J等[25]研究顯示,常氧和缺氧嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(OM-MSC)均能降低腦損傷的嚴(yán)重程度,但與常氧OM-MSC治療相比,缺氧OM-MSC移植治療腦出血患者移植后14、28 d神經(jīng)元凋亡顯著減慢,并且缺氧的OM-MSC表現(xiàn)出更高的組織修復(fù)及保護(hù)能力。此外, MSC的歸巢能力可以使其定向遷移到損傷部位,并分化成受損細(xì)胞、組織或分泌有助于組織再生的趨化因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。MSC因其組織再生和修復(fù)潛力在再生醫(yī)學(xué)中受到越來(lái)越多的關(guān)注[26]。綜上所述, MSC對(duì)受損的腦細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞有潛在的修復(fù)和保護(hù)作用,尤其在低氧條件下MSC提高了干細(xì)胞存活率,能夠更好地發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用,為高原低壓低氧環(huán)境MSC預(yù)防、HACE治療的新藥研發(fā)帶來(lái)了希望。但高原氣候復(fù)雜, MSC在高原地區(qū)的有效性還需大量的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 自噬

2.3.1 自噬與低氧誘導(dǎo)因子: 缺氧是HACE發(fā)生和發(fā)展的主要誘因,在缺氧條件下,線粒體以不同的方式調(diào)節(jié)其代謝,包括交換或修改呼吸鏈的亞基,降低氧化磷酸化、三羧酸(TCA)循環(huán)中間體,適應(yīng)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和減少β氧化[6]。線粒體TCA循環(huán)中間體參與調(diào)節(jié)HIF, HIF是生物體缺氧反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)控因子,其家族中含有3個(gè)亞型,均是由1個(gè)O2敏感的α亞基(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)和1個(gè)O2不敏感的β亞基(HIF-1β)組成的異二聚體結(jié)構(gòu),也被稱為芳基烴受體核轉(zhuǎn)位器[8]。HIF參與機(jī)體的血管生成、紅細(xì)胞產(chǎn)生、細(xì)胞代謝以及自噬的發(fā)生和發(fā)展,還與小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元損傷密切相關(guān)[27]。HIF-1α是缺氧時(shí)基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,并且對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)及修復(fù)的作用[28]。因此, HIF-1α的研究也成為近年來(lái)學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn), MSC進(jìn)行細(xì)胞治療是一種很有前景的治療策略。SHI Y等[29]發(fā)現(xiàn), MSC通過(guò)HIF-1α/TGF-β1/SMAD途徑促進(jìn)促血管生成、組織修復(fù),表明HIF-1α修飾的MSC是一種防治HACE很有前景的新方案。

2.3.2 自噬與鐵死亡: 自噬是一種保護(hù)機(jī)制,通過(guò)將細(xì)胞內(nèi)的有害或過(guò)剩物質(zhì)包裹在囊泡中,然后與溶酶體融合,將其降解并釋放出來(lái),在清除有害物質(zhì)的同時(shí)抑制ROS的產(chǎn)生,維持內(nèi)環(huán)穩(wěn)定。低氧環(huán)境中線粒體功能受損,進(jìn)而破壞細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過(guò)量、細(xì)胞死亡[30]。細(xì)胞死亡一般被分為意外細(xì)胞死亡和調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性死亡,是指細(xì)胞內(nèi)鐵離子的過(guò)度積累導(dǎo)致細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。過(guò)量的鐵離子可以引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)的氧化損傷和DNA的損傷,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在鐵死亡過(guò)程中,自噬可能參與調(diào)節(jié)鐵離子的平衡,清除過(guò)量的鐵離子,減輕氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷,從而保護(hù)細(xì)胞受到鐵死亡的影響。MSC、MSC-Exos通過(guò)SIRT1/Nrf2/HO-1通路、SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制鐵死亡,進(jìn)而對(duì)組織臟器發(fā)揮保護(hù)作用[31]。

在高原環(huán)境中線粒體存在過(guò)度自噬現(xiàn)象,這一現(xiàn)象可能介導(dǎo)了急性高原低氧期海馬神經(jīng)元的損傷。HU Z等[32]認(rèn)為, MSC-Exos通過(guò)促進(jìn)叉頭蛋白3a(FOXO3a)的表達(dá)使線粒體自噬增強(qiáng),從而保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞免受細(xì)胞焦亡的影響,以此減輕低氧對(duì)神經(jīng)元的損傷。低氧時(shí)由HIF-1α-HMOX1軸介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的自噬活化和調(diào)節(jié)作用使MSC的生物學(xué)活性增強(qiáng)[33]。胡璐璐等[34]認(rèn)為,在高原缺氧環(huán)境下腸黏膜上皮細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)過(guò)程,可能對(duì)腸黏膜有保護(hù)作用。線粒體自噬還可促進(jìn)BMSC的增殖和分化,并保護(hù)其免受氧化應(yīng)激損傷[14]。MSC通過(guò)調(diào)節(jié)受損組織、器官中細(xì)胞自噬的能力進(jìn)而參與受損組織和器官的再生[35]。因此,MSC能夠調(diào)節(jié)靶細(xì)胞自噬的機(jī)制,反過(guò)來(lái)自噬又會(huì)影響MSC的治療特性。綜上所述,MSC、MSC-Exos可能通過(guò)抑制鐵死亡及調(diào)節(jié)自噬的途徑對(duì)HACE發(fā)揮藥用價(jià)值,但上述過(guò)程還需要大量的數(shù)據(jù)加以佐證。

2.4 炎癥反應(yīng)

免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)失調(diào)參與了HACE的發(fā)生和發(fā)展[36]。小膠質(zhì)細(xì)胞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)中的唯一免疫細(xì)胞,因此在促炎細(xì)胞因子、損傷和氧化應(yīng)激等環(huán)境中小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被激活[37-38]。在缺血的早期階段,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、清除細(xì)胞廢物和減少炎癥反應(yīng)。然而,持續(xù)性缺血、缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化,會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷[39-40]。NF-κB和TFAM通路能夠促進(jìn)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng),從而使水通道蛋白4(AQP4)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹。在腦出血模型中發(fā)現(xiàn)MSC-EVs, 說(shuō)明MSC、MSC-Exos歸巢到受傷的組織和炎癥部位[41]。缺氧環(huán)境下, MSC、MSC-Exos可能通過(guò)NF-κB和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)信號(hào)通路抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ, 以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用預(yù)防炎癥反應(yīng),增強(qiáng)受損細(xì)胞的修復(fù)和再生[42-43]。MSC還參與減輕炎癥免疫細(xì)胞的自噬來(lái)抑制炎癥反應(yīng)[44]。

2.5 氧化應(yīng)激

低壓缺氧環(huán)境引發(fā)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致人體的多個(gè)器官功能受損,尤其是大腦和心臟[45]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物水平升高和自由基產(chǎn)生進(jìn)而導(dǎo)致BBB血管損傷,加速了HACE的發(fā)生和發(fā)展,而且缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙,促進(jìn)炎癥反應(yīng)[46]。BAILEY D M等[47]也證實(shí),高海拔地區(qū)居民認(rèn)知能力的下降和抑郁的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激和炎癥有關(guān)。MSC因其強(qiáng)大的分化潛能、免疫調(diào)節(jié)作用和抗氧化應(yīng)激而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療和組織工程領(lǐng)域[48]。氧化應(yīng)激是不受控制的ROS產(chǎn)生和抗氧化劑水平不足的結(jié)果,MSC可能通過(guò)TGF-β/Smad途徑下調(diào)miR-486-5p、上調(diào)PIM1以減輕氧化應(yīng)激損傷,因此MSC具有抗氧化應(yīng)激作用[49]。通過(guò)調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生、自噬可以介導(dǎo)MSC保持較高細(xì)胞活力,這表明自噬活化、氧化應(yīng)激與MSC之間相互作用[33, 50]。因此,高原地區(qū)輸注MSC能夠更有效地發(fā)揮MSC功能?？寡趸委熆赡苁菧p輕HACE嚴(yán)重程度的重要策略,因此, MSC的抗氧化應(yīng)激的作用為治療HACE提供了理論支持。

3 小 結(jié)

雖然HACE發(fā)生率低,但其病情兇險(xiǎn),病死率高,目前針對(duì)HACE的治療藥物種類有限且無(wú)特效藥,迫切需要更切實(shí)有效的防治措施。MSC、MSC-Exos可促進(jìn)急性器官損傷后的細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng), MSC和MSC-Exos療法已成功應(yīng)用于多種急慢性疾病的治療,如慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征和特發(fā)性肺纖維化、急性心肌梗死、急性肝損傷、急性重癥胰腺炎、急性腎損傷和急/慢性移植物抗宿主病[51]。此外, MSC和MSC-Exos療法的安全性、有效性和多功能性已經(jīng)得到充分證實(shí)[52]。動(dòng)物模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), MSC、MSC-Exos療法在神經(jīng)相關(guān)疾病如癲癇、帕金森病、腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作和急性脊髓損傷中也具有良好的效果。MSC來(lái)源廣泛、致瘤性低且無(wú)倫理束縛,被認(rèn)為是治療疾病的理想選擇,但因細(xì)胞準(zhǔn)備期和細(xì)胞移植時(shí)間長(zhǎng),很難用于暴發(fā)性疾病患者[53]。此外, MSC和MSC-Exos在體內(nèi)可能會(huì)被快速清除,從而限制其長(zhǎng)期治療效果。國(guó)際干細(xì)胞建議使用液氮(-196 ℃)進(jìn)行冷凍干細(xì)胞儲(chǔ)存、運(yùn)輸,在進(jìn)行儲(chǔ)存及運(yùn)輸時(shí)存在著成本高、運(yùn)輸困難的問題。MSC可以在4 ℃培養(yǎng)基中保存14 d, 并且其生物學(xué)特性及功能不受影響,但非冷凍運(yùn)輸方式不方便[54]。通常情況下,體外擴(kuò)增會(huì)降低DNA聚合酶和修復(fù)能力,從而導(dǎo)致DNA損傷積累,降低天然BMSC的遺傳穩(wěn)定性,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和功能改變,甚至可能引發(fā)腫瘤,臨床級(jí)的MSC、MSC-Exos在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中嚴(yán)格控制質(zhì)量,要求理化性質(zhì)及生物學(xué)特性比較穩(wěn)定[55]。MSC療法是相對(duì)較新的治療,其長(zhǎng)期安全性、有效性以及潛在風(fēng)險(xiǎn)尚缺乏了解。生產(chǎn)設(shè)備、收集方法、培養(yǎng)條件、供體之間的差異,使得生產(chǎn)的MSC、MSC-Exo也很難滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,因而MSC的臨床應(yīng)用仍然十分有限。總的來(lái)說(shuō),MSC療法在治療高原疾病方面表現(xiàn)出潛在的益處,但也存在一定風(fēng)險(xiǎn), MSC和MSC-Exos防治HACE還需要大量的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行支持。