■ 馮沈雨桐 孫長坡 宋洪東 趙一凡 杜 穩(wěn) 劉虎軍*
(1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200093;2.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院,北京 100037;3.國家糧食和物資儲備局標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量中心,北京 100834)
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一種由禾谷 鐮刀菌(F.graminearum)和黃色鐮刀菌(F.culmorum)產(chǎn)生的非甾體類雌激素霉菌毒素,分子式為C18H22O5,分子量為318.36 u[1]。ZEN 污染在全球谷類作物中非常普遍,其中ZEN 污染風(fēng)險(xiǎn)最高的谷類作物是玉米、小麥和燕麥[2]。ZEN 對人體和家畜健康毒害很大,ZEN 具有與雌激素相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),通過競爭性結(jié)合雌激素受體,會導(dǎo)致生殖器病變以及生殖障礙,從而對人類和動物健康構(gòu)成威脅[3]。此外,ZEN 還具有致癌、免疫毒性和器官毒性。Zhang 等[4]發(fā)現(xiàn)ZEN 會促進(jìn)小鼠卵泡發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞中腫瘤發(fā)生基因的表達(dá)。Yu 等[5]發(fā)現(xiàn)ZEN 可以過表達(dá)雌激素依賴性乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中抗凋亡基因,同時(shí)抑制促凋亡基因Bax,導(dǎo)致乳腺癌。ZEN 及其代謝物會影響免疫細(xì)胞的發(fā)育和增殖、細(xì)胞周期以及功能性,從而減弱炎癥應(yīng)答和其合成活性分子的能力[6]。Wang等[7]的研究表明,ZEN會對小鼠腎臟造成損害。
由于ZEN對人和家畜的有害影響,應(yīng)盡量減少食物和飼料中的ZEN 污染。ZEN 產(chǎn)生于糧油作物種植、收獲、儲藏和加工的各個(gè)階段,盡管通過選育抗真菌品種、合理耕作、灌溉和施肥以及使用殺菌劑等農(nóng)業(yè)手段可以降低ZEN的污染,但完全防止ZEN的形成幾乎是不可能的[8-10]。因此,需要對ZEN 含量超標(biāo)的谷物及其加工制品進(jìn)行脫毒處理。物理吸附和化學(xué)降解是非選擇性的,會降低谷物中的營養(yǎng)成分,且會帶來二次污染[11-12]。相較之下,微生物或酶具有專一、高效、無二次污染的優(yōu)點(diǎn),是較為理想的脫毒方法[13-14]。由于酶制劑和菌對ZEN 的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能仍然具有較高的毒性,因此,文章將ZEN 脫毒酶定義為能夠?qū)R坏貙?fù)雜基質(zhì)中的ZEN 轉(zhuǎn)化為低毒和無毒的一類酶制劑。
隨著人們對ZEN污染和危害的認(rèn)識的深入,能夠工業(yè)化應(yīng)用的專一、高效降解復(fù)雜基質(zhì)中的酶制劑的開發(fā)受到廣泛重視,并取得了一定的進(jìn)展。基于此,文章從脫毒酶基因挖掘、酶結(jié)構(gòu)定向進(jìn)化、異源表達(dá)、發(fā)酵工藝優(yōu)化及酶制劑的制備及應(yīng)用等方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。
獲得脫毒酶基因并明確其轉(zhuǎn)化機(jī)制是ZEN 脫毒酶制劑開發(fā)的首要任務(wù)。目前已經(jīng)獲得的ZEN 脫毒酶類主要包括內(nèi)酯水解酶、過氧化物酶、漆酶以及磷酸轉(zhuǎn)移酶等(如圖1所示)。
圖1 ZEN降解途徑
ZEN內(nèi)酯水解酶可以水解ZEN的內(nèi)酯環(huán),水解的ZEN(HZEN) 會自發(fā)脫羧轉(zhuǎn)化為無毒的產(chǎn)物DHZEN[15]。2002 年,Takahashi-Ando 等[16]發(fā)現(xiàn),粉紅黏帚霉NRRL 1859 能夠?qū)EN 轉(zhuǎn)化為雌激素活性較低的產(chǎn)物,并克隆出了其編碼基因ZHD101,這是首次報(bào)道的ZEN 脫毒酶。ZHD101基因的發(fā)現(xiàn)為ZEN 的生物脫毒奠定了基礎(chǔ),隨著研究的不斷深入,又發(fā)現(xiàn)了許多其他微生物來源的內(nèi)酯水解酶。Zhang 等[17]從G.roseum中鑒定出在中性條件下高活性的脫毒酶ZENG,該酶對ZEN 及其衍生物α-ZOL 和α-ZAL 都具有較高的降解活性。Bi 等[18]從粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中分離出了新的ZEN 內(nèi)酯酶的基因ZENC。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)了與ZHD101的氨基酸同源性分別為61%、63%和97%的3 種新的ZEN 內(nèi)酯水解酶CLA、EXO 和TRI。Wang 等[20]從NCBI 數(shù)據(jù)庫中鑒定了一種與ZHD101 同源性為65%的新型內(nèi)酯水解酶ZHD518,這是首個(gè)被報(bào)道的中性ZEN 脫毒酶。Azam等[21]將ZHD 和赭曲霉毒素A(OTA)脫毒酶羧肽酶(CP)融合,獲得了一種重組融合酶(ZHDCP),該酶具有雙功能活性,能夠降解OTA 和ZEN,這種融合蛋白的方法為真菌毒素脫毒酶的酶工程提供了一種新的思路。Yu等[22]從Phialo-phora americana中分離、克隆出一種新的內(nèi)酯水解酶ZHD607。ZHD607 被表征為嗜溫內(nèi)酯水解酶,在35 ℃和pH 8.0下顯示最佳活性。
過氧化物酶(peroxidase,POD)是一種氧化還原酶,可以使用H2O2作為電子受體來催化各種酚類底物的氧化,而且不會形成有害副產(chǎn)物。迄今為止,一些研究已經(jīng)闡明了過氧化物酶在ZEN 降解中的特性。Yu 等[23]從不動桿菌(Acinetobacter)中分離出的一種新的硫代氧化還原蛋白過氧化物酶(peroxiredoxin,Prx)可以把ZEN 氧化成較小的雌激素代謝物,重組Prx 可以用于粉碎污染玉米樣品中的ZEN降解,降解率達(dá)到90%。Qin 等[24]從B.subtilis168 中分離出染料脫色過氧化物酶BsDyP,在大腸桿菌中表達(dá)后獲得的重組菌也能夠以H2O2為電子受體直接氧化ZEN,其氧化產(chǎn)物為ZEN-11,12-氧化物。盡管過氧化物酶可以有效脫除飼料和食品中的ZEN,但是H2O2在食品和飼料加工中無法大規(guī)模應(yīng)用,市場接受度低,實(shí)際應(yīng)用價(jià)值還有待后續(xù)開發(fā)。
漆酶是一種含銅多酚氧化酶,以氧氣作為電子受體催化各種芳香族和非芳香族化合物的氧化。由于漆酶的氧化反應(yīng)僅生成水,在食品加工、工業(yè)發(fā)酵等領(lǐng)域有巨大的發(fā)展?jié)摿?。漆酶氧化底物時(shí)可以分為直接氧化與間接氧化,漆酶直接氧化ZEN的方式可能與過氧化物酶相似,作用于ZEN的芳香環(huán)上,使其部分羥基化,但其降解機(jī)理尚不明確。而間接氧化需要添加介質(zhì),介質(zhì)可以與漆酶反應(yīng)形成自由基,自由基可以進(jìn)一步與底物反應(yīng)。Qin 等[25]從S.thermocarboxydus41291中分離出一種新型漆酶多銅氧化酶StMCO,發(fā)現(xiàn)ZEN可以被其氧化降解為低毒性的降解產(chǎn)物13-OH-ZEN-醌,這是漆酶對ZEN的直接氧化。同時(shí),添加介質(zhì)可以顯著促進(jìn)多銅氧化酶StMCO對ZEN的降解。
Elisavet 等[26]對酵母毛孢霉菌(Trichosporon mycotoxinivorans)降解ZEN 的機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該菌的降解機(jī)制是打開ZEN內(nèi)酯環(huán)末端羰基處的環(huán),通過在羰基旁邊插入氧來延長大環(huán),然后打開新形成的內(nèi)酯后得到產(chǎn)物ZOM-1。這是一種新的代謝產(chǎn)物;且在體外競爭結(jié)合試驗(yàn)中沒有與人雌激素受體相互作用,無毒性。但是,沒有后續(xù)研究報(bào)道相關(guān)的酶或基因。李晨亮等[27]從沙福芽孢桿菌中克隆出ZEN的關(guān)鍵酶phosphoenolpyruvate(PEP)-utilizing enzyme(BsaPUE),在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)并純化。重組酶BsaPUE具有磷酸轉(zhuǎn)移酶活性,在有腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和Mg2+存在的情況下,30 min 內(nèi)可將10 μg/mL ZEN 完全轉(zhuǎn)化為ZEN-P。ZEN 磷酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)物的穩(wěn)定性和毒性仍需要進(jìn)一步研究。
通過理性和非理性對酶進(jìn)行改造,能夠提高酶活性和抗逆性,是酶制劑工業(yè)化應(yīng)用過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié),目前僅內(nèi)酯水解酶ZHD101 的結(jié)構(gòu)解析及改造研究較為深入。內(nèi)酯水解酶不需要輔酶、輔基和輔助因子,能夠在復(fù)雜基質(zhì)中高效降解ZEN,是目前研究最多的ZEN脫毒酶,也是最具應(yīng)用前景的ZEN脫毒酶。ZHD101 是堿性酶,且pH 和溫度穩(wěn)定性較差,不能滿足工業(yè)化應(yīng)用。另外,ZHD101 以相同的機(jī)理水解ZEN 的衍生物玉米赤霉醇(ZOLs),但活性僅為降解ZEN 時(shí)的40%[28],底物適用性和酶活性都較差,削弱了其實(shí)際價(jià)值。因此,ZHD101 的結(jié)構(gòu)解析和改造受到了重視,并取得了一定進(jìn)展。ZHD101 的結(jié)構(gòu)改造分為3個(gè)方向:降低最適pH,提高pH 和溫度耐受性,提高對ZEN及其衍生物ZOLs的降解效果。
ZHD101 屬于α/β水解酶家族,其活性中心包含α/β水解酶典型的催化三聯(lián)體—酸-堿-親核三聯(lián)體,即S102-H242-G126,此催化三聯(lián)體殘基在一級序列中離得很遠(yuǎn),但在三維結(jié)構(gòu)中被折疊到一起,發(fā)揮催化活性[29]。除了催化核心結(jié)構(gòu)域外,ZHD101還包括一個(gè)α-螺旋帽結(jié)構(gòu)域[30]。ZEN結(jié)合到核心結(jié)構(gòu)域和帽結(jié)構(gòu)域之間的一個(gè)深口袋中,鄰近催化三聯(lián)體。由于該酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)位于口袋深處,形成了空間位阻,不利于ZEN的結(jié)合,從而限制了酶活性。為了增強(qiáng)該酶活性的同時(shí)提高其對ZEN衍生物或類似結(jié)構(gòu)底物的親和性,在后續(xù)的研究中可以對口袋區(qū)域周圍的殘基進(jìn)行改造,使其結(jié)合位點(diǎn)抬高,減小空間位阻。對酶結(jié)構(gòu)的解析為后續(xù)ZHD101的定向改造提供基礎(chǔ)。
Lin 等[31]通過在酶表面引入帶正電荷的賴氨酸突變,獲得了M2(D157K)和M9(E171K)兩個(gè)變異體。這兩個(gè)變異體在酸性條件下的催化效率略有提高。
陳權(quán)等[32]以ZHD101 為模式酶,發(fā)現(xiàn)其柔性區(qū)域和熱敏感區(qū)域高度重疊,對區(qū)域內(nèi)突變位點(diǎn)進(jìn)行虛擬飽和突變,結(jié)合構(gòu)象自由能變化和序列保守性進(jìn)行篩選,確定突變區(qū)域?yàn)槊弊訁^(qū)域、C 末端的α-螺旋區(qū)域和α-9 螺旋。針對這3 個(gè)區(qū)域進(jìn)行改造,并進(jìn)行迭代組合突變,使熱熔融溫度(Tm)提高了6.7 ℃,且酶活性與野生型類似(相對酶活為103.6%)。
官嬡林等[33]使用mTM-align算法,獲取了ZHD101對應(yīng)的蛋白質(zhì)文庫,其序列與ZHD101 相似性低于20%,但是結(jié)構(gòu)有97%的重合。通過熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)對文庫中的蛋白質(zhì)檢索,得到了6 個(gè)典型蛋白質(zhì)。通過MSTA 分析以及Consurf 序列保守性分析,確定了突變區(qū)域。由突變引起的構(gòu)象自由能變化(ΔΔG)得到了9 個(gè)突變體。將其導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)后,以熱穩(wěn)定性和酶活性為表征,確定了2 個(gè)優(yōu)勢突變體,其熱穩(wěn)定性相較野生型顯著提高。兩種突變體都在ZHD101 水解酶的局部柔性區(qū)域?qū)崿F(xiàn)了剛性化,以此實(shí)現(xiàn)了熱穩(wěn)定性的改善。
Xu 等[28]發(fā)現(xiàn),ZHD101 雖然能水解ZEN 及其衍生物玉米赤霉烯醇(ZOL),但是其更傾向于與ZEN 結(jié)合,對于毒性更高的ZOL,尤其是α-ZOL,效果較差。為了提高ZHD101對α-ZOL 的選擇性,Xu等[28]分析了ZHD101 與ZOL 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)α-ZOL 的內(nèi)酯環(huán)比ZEN的內(nèi)酯環(huán)結(jié)合在更靠內(nèi)的位置,并且脂肪族C8'原子可能以疏水力排斥親水性H242側(cè)鏈咪唑。因此,H242 的咪唑基通過側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)被推到一邊,無法介導(dǎo)S102-H242-E126 氫鍵網(wǎng)絡(luò),這直接破壞了催化三聯(lián)體的形成。而通過將內(nèi)酯環(huán)周圍的底物結(jié)合殘基V153 突變?yōu)闃O性殘基H153 后,α-ZOL 內(nèi)酯環(huán)可以通過H153 側(cè)鏈和α-ZOL 的C6'OH 原子之間的氫鍵固定,使得內(nèi)酯從口袋中移出,形成容納H242側(cè)鏈的空間,重新組成催化三聯(lián)體。該策略極大地減弱了α-ZOL 的內(nèi)酯環(huán)與ZHD101 的結(jié)合難度,使ZHD101對α-ZOL的特異性活性增加了3.7倍。
由于野生菌株的酶表達(dá)水平普遍偏低,大多難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要,而酶的異源表達(dá)通常能有效地解決此問題。迄今為止,已有許多ZEN脫毒酶基因在各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。如表1 所示,ZEN 脫毒酶的表達(dá)宿主包括大腸桿菌[19]、畢赤酵母[34]和枯草芽孢桿菌[35]等。
表1 ZEN脫毒酶的異源表達(dá)及發(fā)酵制備[41-44]
原核表達(dá)宿主大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用范圍最廣,已經(jīng)成功表達(dá)了數(shù)個(gè)ZEN脫毒酶基因。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前研究最為完善的原核表達(dá)系統(tǒng),具有操作簡單、遺傳背景清楚、繁殖快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)勢。
據(jù)報(bào)道,Zhang 等[19]將與ZHD101 氨基酸同源性分別為61%、63%和97%的三種新型ZEN內(nèi)酯水解酶CLA、EXO 和TRI 的編碼基因?qū)氲紼scherichia coliBL21,酶 活 性 分 別 為114.8、459.0、239.8 U/mg,而ZHD101的比酶活等為242.8 U/mg。Wang等[20]將中性ZEN脫毒酶HD518在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá),重組酶在pH 8.0、40 ℃下有最高比酶活,比酶活達(dá)到207.0 U/mg。此外,ZHD518 對ZEN 衍生物α-玉米赤霉醇(α-Zearalanol)也具有較高的降解活性,比酶活為119.8 U/mg。Azam 等[21]將具有雙功能活性(降解OTA 和ZEA)的重組融合酶(ZHDCP)在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá),100 μg純化的ZHDCP 融合酶可以在2 h 內(nèi)降解50 μmol/L ZEN。Qin 等[24]將過氧化物酶基因BsDyP 在大腸桿菌BL 21/pG-Tf 2 中進(jìn)行了表達(dá)。BsDyP 能氧化多種底物,在Mn2+存在的條件下孵育48 h,對黃曲霉毒素(AFB1)、ZEN和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的降解率分別為76.93%、84.65%和78.42%。Qin等[25]將新的多銅氧化酶StMCO在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),該酶在有效介體乙酰丁香酮和ABTS存在下,可以在1 h內(nèi)完全降解ZEN。Wang 等[36]將一種新型漆酶(BsCotA)在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),通過對該酶的研究發(fā)現(xiàn),丁香酸甲酯是協(xié)助BsCotA 降解黃曲霉毒素B1(AFB1)(98.0%)和ZEN(100.0%)的最有效介體。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最為廣泛的真核表達(dá)宿主。該系統(tǒng)具有遺傳背景清晰、發(fā)酵工藝成熟、產(chǎn)物易分離純化等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于外源蛋白的異源表達(dá)。
劉海燕等[34]將粉紅黏帚霉中提取的新型內(nèi)酯水解酶Zlhy-6在畢赤酵母GS115中成功表達(dá),重組菌在甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d,表達(dá)的酶液能夠完全降解液體中的ZEN。Bi等[18]將新的ZEN內(nèi)酯水解酶基因ZENC在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)。該酶在搖瓶發(fā)酵中活性達(dá)到40.0 U/mL,隨后在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵,最大酶活性達(dá)到290.6 U/mL。Xiang 等[37]在巴斯德畢赤酵母GS115 中表達(dá)了基于天然ZHD 編碼基因ZHD101合成的密碼子優(yōu)化的ZHD 基因,分別構(gòu)建了含有1~4拷貝ZHD101的質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)3拷貝的重組畢赤酵母蛋白表達(dá)量最高。重組的畢赤酵母在搖瓶中的酶活性為22.5 U/mL,在5 L發(fā)酵罐中達(dá)到了150.1 U/mL,比搖瓶發(fā)酵提高了6.7 倍。Yu 等[22]在畢赤酵母中表達(dá)了一種新的嗜溫內(nèi)酯水解酶ZHD607。重組菌發(fā)酵后的酶液在35 ℃和pH 8.0下酶活性最高,最高比酶活達(dá)到4 940 U/mg。王義春等[38]對ZEN脫毒酶基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,通過酶切酶鏈構(gòu)建含1~6 個(gè)表達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌中,獲得ZEN脫毒酶Zlhy-6 多拷貝重組菌株。其中,4 拷貝的轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平最高,搖瓶水平下最高達(dá)到了10 U/mL。1 g 玉 米 渣 中 加 入0.1~0.5 mL 發(fā) 酵 上 清 液,24 h 后ZEN降解率可達(dá)到44.08%~75.51%。
枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌,遺傳背景清晰,無明顯密碼子偏好性,基因操作技術(shù)成熟。此外枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)還具有無內(nèi)毒素生成,有強(qiáng)大的蛋白分泌能力、產(chǎn)物易純化等優(yōu)勢,非常適合食品和飼料用酶的異源表達(dá)。
符浩東等[35]將內(nèi)酯水解酶Zlhy-6 采用一步克隆及重疊延伸PCR 的方法構(gòu)建了單啟動子和包含HpaⅡ和P43 的雙啟動子的表達(dá)質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中,獲得重組菌株168/pMA5-Zlhy-6 和168/pMA5-P43-Zlhy。并將Zlhy-6基因整合到枯草芽孢桿菌168 的基因組中,通過Cre/lox 系統(tǒng)敲除抗生素抗性基因,獲得整合了P43-Zlhy表達(dá)盒的食品級重組枯草芽孢桿菌BZ-zlhy。3 個(gè)重組菌株都顯示了ZEN 降解活性。其中,雙啟動子重組菌株取得了最高酶活性2.2 U/mL,而重組枯草芽孢桿菌BZ-Zlhy效果最差,酶活性僅為0.4 U/mL。
Gao 等[39]將綠色熒光蛋白:內(nèi)酯水解酶(EGFP:ZHD101)[40]在水稻T0葉片中成功表達(dá),并且評估了利用后代植物脫除ZEN的可行性,發(fā)現(xiàn)當(dāng)來自T1葉片的蛋白質(zhì)提取物與ZEN 共同溫育時(shí),ZEN 的毒素量顯著降低。ZEN 脫毒能力也在轉(zhuǎn)基因T2種子中體內(nèi)檢測到。通過基因工程手段選育具有ZEN 脫毒酶活性的新品種,能夠在源頭上對ZEN 的污染進(jìn)行控制,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
微生物的發(fā)酵過程是一個(gè)復(fù)雜的過程,培養(yǎng)基的成分以及發(fā)酵過程中的各種條件與重組菌株產(chǎn)酶的水平息息相關(guān)。為了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)對培養(yǎng)基的需求,郝小龍[45]在搖瓶水平上,通過響應(yīng)面法從BSM 培養(yǎng)基出發(fā),使用酵母提取物代替PTM1、硫酸銨代替蛋白胨,獲得了一種適合Zlhy-6-畢赤酵母工程菌NZPP11 高密度生長的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基與BMGY 培養(yǎng)基效果相當(dāng),解決了BMGY 營養(yǎng)過剩、無法高溫滅菌、配制操作繁瑣和成本過高的問題。向臘[46]在發(fā)酵罐中對高產(chǎn)ZHD101蛋白的重組酵母菌株X3c進(jìn)行了高密度發(fā)酵,酶活性最高達(dá)到了150.1 U/mL,是搖瓶水平的6.7 倍。徐榮榮[47]在搖瓶水平上對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)酵上清液的降解率提高了18.54%。吳梓鳳[48]在搖瓶水平上對表達(dá)ZPF1 的乳酸克魯維酵母重組菌的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最佳誘導(dǎo)條件為25 ℃下誘導(dǎo)72 h,培養(yǎng)基中含40.0 g/L 半乳糖、0.5 mmol/L MnSO4和0.2 mmol/L 氯化血紅素。肖俊梅[49]發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加小分子氨基酸甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和賴氨酸(Lys),對提高重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx 表達(dá)ZEN 脫毒酶A4-Prx有顯著作用。在甲醇濃度0.5%、pH 7.0、Gly 濃度0.11%、溫度為30 ℃時(shí)獲得了最大表達(dá)量,蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到130.39 mg/L,蛋白質(zhì)含量和降解效果分別比優(yōu)化前提高了72.3%和77.0%。
ZEN 脫毒酶需要作用的環(huán)境比較復(fù)雜,ZEN 酶和底物的結(jié)合會受到其他物質(zhì)和環(huán)境條件的干擾??梢詫EN 的作用場景分為體外和體內(nèi)兩種。ZEN 脫毒酶的應(yīng)用研究集中在對兩種場景下ZEN 脫毒酶的有效性評估上。
畢可[50]選擇了4 種固定化載體來固定化ZENC酶,結(jié)果表明,活化NH2瓊脂糖糖珠固定化率最高。而且,活化NH2瓊脂糖糖珠可以賦予ZENC 酶新的特性,即耐酸性和熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)。He 等[51]采用稻殼固定化ZEN 脫毒酶ZDE,制備了一種新型酶制劑,使得ZDE 的穩(wěn)定性和催化活性都有很大提高,在90 ℃下保留了70%的ZEN 去除率;另外,固定化ZDE 在4 ℃和25 ℃下保存一個(gè)月后,仍然保持了初始活性的90%和70%。
ZEN脫毒酶的應(yīng)用首先要證明其安全性,Bampidis等[52]評估了含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌DSM32731表達(dá)的ZenA飼料添加劑,結(jié)果表明,首先添加劑中所含的ZenA對所有陸生物種都是安全的,最高使用水平為肉雞100 U/kg;蛋雞、肉火雞、家兔150 U/kg;豬200 U/kg;奶牛250 U/kg;肉牛、綿羊、山羊、馬和貓400 U/kg;狗為450 U/kg。其次,已有研究表明,脫毒酶可以在體內(nèi)作用,削減ZEN 的危害。王相生[53]將由枯草芽孢桿菌表達(dá)的ZEN-jjm 和與含ZEN 的飼料混合作為妊娠母豬日糧,發(fā)現(xiàn)該酶能夠有效緩解ZEN對母豬繁殖性能的危害。Gruber-Dorninger 等[54]在模擬牛瘤胃環(huán)境的發(fā)酵系統(tǒng)中研究了ZenA 降解ZEN 的效果,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器中的ZEN 及代謝產(chǎn)物的濃度在添加酶10 min 后顯著降低。繼而將ZenA 以128 U/kg的濃度添加到含10 mg/kg ZEN的污染精料中,飼喂瘤胃瘺牛,發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀瘤胃3 個(gè)位置的ZEN 及其代謝產(chǎn)物的α-ZEL、β-ZEL 濃度都出現(xiàn)大幅度下降,ZEN 殘留幾乎降為0,同時(shí)檢測出降解產(chǎn)物HZEN。目前,內(nèi)酯水解酶的應(yīng)用評估研究比較系統(tǒng),其過瘤胃后可以在體內(nèi)發(fā)揮作用,降低ZEN對動物的危害。
毒素污染原料的體外處理是非常重要的應(yīng)用場景,對糧油加工企業(yè)意義重大。Bi 等[18]將800 U ZENC分別添加到玉米酒糟(DDGS)、玉米副產(chǎn)物和玉米麩皮中,ZEN 的含量降低了70.9%、88.9%和94.7%。郝小龍[45]使用純化Zlhy 酶液分別在玉米醪、玉米干酒糟及其可溶物中測試了其降解效果,發(fā)現(xiàn)該酶能將ZEN 完全降解,而且乳化處理可以大幅度提高降解效率。王義春[55]用Zlhy-6 酶發(fā)酵液對玉米渣和玉米蛋白粉進(jìn)行了ZEN 的脫毒研究,經(jīng)過24 h 處理,可以使得兩種物料種的ZEN 低于我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的限量。Bi 等[18]將800 U ZENC 分別添加到玉米酒糟(DDGS)、玉米副產(chǎn)物和玉米麩皮中,ZEN 的含量降低了70.9%、88.9%和94.7%。Chang 等[56]首次報(bào)道了在玉米油生產(chǎn)過程中用酶去除ZEN,原油中的ZEN 經(jīng)中和以及Zlhy-6酶解毒后,濃度由1 257.3 μg/kg降低到13.0 μg/kg,同時(shí)對總生育酚和甾醇含量無影響。肖俊梅[49]將重組蛋白A4-Prx 粗酶液用于玉米粉、燕麥片、山西陳醋、黃豆醬油、酒精糟等原料中ZEN 的脫毒,發(fā)現(xiàn)ZEN 殘余量均顯著降低,而且ZEN 含量越高的樣品降解效果越好。Zhao 等[57]通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了水解酶脫除脫膠玉米油(DCO)中ZEN的工藝,在溫度39.01 ℃、pH 8.08、時(shí)間3.9 h、酶用量44.7 mg/kg的條件下,ZEN的降解率可達(dá)94.66%。
ZEN 對人體和家畜健康毒害很大。隨著公眾對糧食安全越來越重視,ZEN 的脫毒技術(shù)和應(yīng)用研究受到了重視。
通過自然選育和基因改造育種的方法獲得了具有一定應(yīng)用潛力的ZEN脫毒酶基因,并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了其異源表達(dá)。ZHD101表達(dá)的酶制劑能夠在體內(nèi)和體外的復(fù)雜環(huán)境中降解ZEN,降低ZEN 對動物的危害,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。但是相關(guān)脫毒酶的最適作用條件偏堿性,溫度和pH 耐受性較差無法適應(yīng)復(fù)雜基質(zhì)中的苛刻環(huán)境。此外, ZEN 脫毒酶種類仍然較少,且對工程菌的發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究較少,表達(dá)酶活性較低,最高發(fā)酵水平僅能達(dá)到150.1 U/mL[37]。而對于ZEN 脫毒酶的應(yīng)用研究仍然停留在效果試驗(yàn)上,缺少量化指標(biāo)的優(yōu)化。
為了提高ZEN脫毒酶的應(yīng)用效果,需要加強(qiáng)以下幾方面的研究:①繼續(xù)從惡劣環(huán)境中挖掘不同來源微生物中的ZEN 脫毒酶編碼基因,豐富ZEN 脫毒酶資源;②由于脫毒酶的使用環(huán)境大多是酸性和高溫環(huán)境,因此需要進(jìn)一步降低酶制劑的最適pH,提高pH和溫度耐受性;③系統(tǒng)優(yōu)化ZEN脫毒酶工程菌的發(fā)酵工藝;④加強(qiáng)酶制劑的應(yīng)用研究、加強(qiáng)酶制劑在復(fù)雜基質(zhì)中的量化應(yīng)用研究,對酶制劑進(jìn)行固定化研究[50],以適應(yīng)復(fù)雜基質(zhì)中的環(huán)境,開發(fā)復(fù)合脫毒劑[51]。