■ 鄭國建 葉寅穎 雷 濤 曹 瑩

（1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233；2.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

血根堿和白屈菜紅堿是天然存在的苯駢菲啶類生物堿[1]，在博落回中含量豐富。飼糧中添加血根堿可以提高奶山羊產(chǎn)奶量，改善機體的抗氧化和免疫功能[2]，可以緩解斷奶仔豬免疫應(yīng)激導致的生長性能下降，增強免疫能力，并在一定程度上改善小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，改善斷奶仔豬的腸道健康[3]。血根堿還具有對人宮頸癌耐藥細胞增殖的抑制作用[4]。白屈菜紅堿具有抗腫瘤、抗菌和抗炎等藥理活性[1]，能夠抑制人高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系MHCC97-H 的生長、侵襲和遷移能力[5]。血根堿和白屈菜紅堿還具有抗白假絲酵母菌、新型隱球菌的作用[6]。

血根堿和白屈菜紅堿主要是以博落回散的形式添加到飼料中。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第246 號收錄了博落回散為藥物飼料添加劑，并規(guī)定了使用范圍和使用限量。

目前，測定血根堿和白屈菜紅堿的常用方法包括毛細管電泳法[7-8]、高效液相色譜法[9-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[11-12]。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第246 號規(guī)定，飼料中博落回散（規(guī)格為100 g：0.375 g）的添加量為0.2～0.6 g/kg。采用羅忠勇等[13]的方法測定博落回散（規(guī)格為100 g：0.375 g）中血根堿和白屈菜紅堿含量為0.6～1.4 g/kg，由此可知，飼料中血根堿和白屈菜紅堿的含量為0.1～0.8 mg/kg。而毛細管電泳法和高效液相色譜法的檢出限只能達到50 mg/kg 左右[7-10]，主要用于天然產(chǎn)物[7-8]和藥劑[10]等方面的研究，無法滿足飼料中血根堿和白屈菜紅堿的檢測需要。同時，飼料基質(zhì)相對復雜，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較強的抗干擾能力[11-12]， 因此，本研究建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測飼料中血根堿和白屈菜紅堿的方法，以期更加準確地測量飼料中血根堿和白屈菜紅堿的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血根堿標準品、白屈菜紅堿標準品，純度≥98%，購于上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司；甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，購于Fisher Scientific；鹽酸、乙醇、冰醋酸為化學純，購于國藥化學試劑有限公司；Agilent SCX（200 mg，6 mL）強陽離子交換柱，購于安捷倫公司；Waters MCX（60 mg，3 mL）混合型陽離子交換柱、HLB 固相萃取柱（500 mg，6 mL）、QuEChERS 凈化包1[50 mg PSA（乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠），100 mg C18，100 mg MgSO4]、QuEChERS 凈化包2（50 mg PSA，50 mg C18，100 mg MgSO4）、QuEChERS凈化包3[25 mg GCB（石墨化碳黑），50 mg PSA，50 mg C18，150 mg MgSO4]，購于沃特斯公司；超純水由Millipore Milli-Q超純水儀生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters XEVO TQXS 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI），美國Waters公司；Wiggens Votex 3000 渦旋振蕩儀，德國WIGGENS 公司；超聲波清洗機，上?？茖С晝x器有限公司；Eppendorf 5804離心機，德國艾本德公司；Millipore Milli-Q 超純水，美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters BEH C182.1 mm ×50 mm，1.7 μm。流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈溶液，梯度洗脫：0～1 min，10% B保持不變；1～6 min，10% B線性變化至100% B；6～8 min，100% B保持不變；8.1 min變化至10% B，平衡2 min。柱溫：35 ℃。流速：0.3 mL/min。進樣量：2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）為正電離模式，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，干燥氣溫度400 ℃，干燥氣流速800 L/h，錐孔反吹氣流速150 L/h，源溫150 ℃，離子對、碰撞能量見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 標準溶液的配制

1.3.3.1 標準儲備溶液（0.5 mg/mL）

稱取血根堿和白屈菜紅堿標準品各50 mg（精確至0.1 mg），分別置于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻。

1.3.3.2 標準中間溶液（1 μg/mL）

分別準確移取0.2 mL標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，用0.2%鹽酸乙腈溶液稀釋并定容，混勻。

1.3.3.3 標準系列溶液

分別準確移取適量標準中間溶液于容量瓶中，用0.2%鹽酸乙腈溶液稀釋并定容，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL標準系列溶液。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取

平行進行兩個試驗。稱取試樣（添加劑預混合飼料、濃縮飼料、配合飼料、精料補充料和水產(chǎn)飼料）2 g（精確至0.1 mg），置于50 mL離心管中，加入15 mL鹽酸乙腈溶液，渦旋，超聲提取20 min，9 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中。重復提取2 次，合并上清液，用鹽酸乙腈溶液定容，混勻，備用。

1.4.2 凈化

吸取備用液約3 mL 過固相萃取柱及微孔濾膜，棄去約1 mL流出液，收集續(xù)濾液，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 監(jiān)測離子對的選擇及質(zhì)譜條件的確定

血根堿、白屈菜紅堿含有帶正電的氨離子，在質(zhì)譜分析中可使用正離子模式。用濃度為0.1 μg/mL 的血根堿、白屈菜紅堿標準溶液進行質(zhì)譜掃描，按照響應(yīng)最高選定2 個子離子進行監(jiān)測，質(zhì)譜優(yōu)化條件參數(shù)見表1，與鐘明等[14]的報道結(jié)果一致。

2.2 色譜柱的確定

血根堿和白屈菜紅堿為中等極性化合物，故采用C18色譜柱進行分離。以0.1%甲酸溶液和乙腈溶液為流動相，采用梯度洗脫。研究對比了HSS T3-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Tita-C18（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）、Eclipse-Plus RRHD-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Hypersil Gold-C18（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）作為目標物的預選分離柱。結(jié)果表明，血根堿和白屈菜紅堿在上述C18色譜柱上的洗脫效果差別不大，均能滿足檢測要求。選擇BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱進行下一步試驗分析，色譜圖見圖1。

圖1 飼料樣品中血根堿和白屈菜紅堿的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖

2.3 提取溶劑的選擇

血根堿和白屈菜紅堿易溶于甲醇、乙醇、乙腈等極性溶劑中，故在樣品提取過程中首先選用實驗室常用的甲醇、乙醇、乙腈作為提取溶劑。

稱取2 g 試樣，加入40 mL 提取溶劑，渦旋，超聲提取20 min，9 000 r/min 離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用提取溶劑定容，混勻。吸取備用液約3 mL 過固相萃取柱及微孔濾膜，棄去約1 mL流出液，收集續(xù)濾液，待測。

研究以豬預混合飼料為代表基質(zhì)，加標濃度為5 mg/kg，考察不同溶劑的提取效率，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溶劑提取結(jié)果

由圖2 可知，對于血根堿，乙腈和甲醇的提取效果較好；對于白屈菜紅堿，只有乙腈的提取效果較好。但使用乙腈提取血根堿和白屈菜紅堿時回收率也只有75%左右。

查閱相關(guān)文獻可知，酸性溶液有助于血根堿和白屈菜紅堿的提取[15]，因此為了提高回收率，考察在乙腈中加入甲酸、乙酸和鹽酸以提高提取效率，結(jié)果見圖3。

圖3 酸性提取溶劑提取結(jié)果

由圖3 可知，乙腈中加入鹽酸后提取效率有改進。因此繼續(xù)考察不同鹽酸濃度（0、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1.0%）對提取效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度鹽酸乙腈溶液對提取效率的影響

由圖4 可知，0.2%的鹽酸乙腈溶液提取效果最佳，單次提取回收率在90%以上。

急性扁桃體炎診斷標準參照《中醫(yī)病證診斷療效標準·乳蛾的診斷依據(jù)》[1]：①以咽痛、吞咽困難為主要癥狀，可伴有發(fā)熱。②起病急，病程短。③扁桃體充血腫脹、表面有膿點。④白細胞總數(shù)及中性粒細胞增高。

2.4 超聲時間考察

一般情況下，超聲有助于提高提取效率，延長超聲時間有助于提高目標化合物的回收率，因此考察了不同超聲時間對回收率的影響，結(jié)果見圖5。超聲10 min基本能將血根堿和白屈菜紅堿提取完全，為了保證提取效率，將超聲時間設(shè)為20 min，此時的回收率達到95%以上。

圖5 不同超聲時間對提取效率的影響

2.5 提取次數(shù)考察

為了進一步提高提取效率，對提取次數(shù)進行考察，加標濃度為5 mg/kg。

取2 g樣品置于50 mL離心管中，分別進行1、2、3次提?。看?5 mL），超聲時間為20 min，以9 000 r/min離心取上清，最終用0.2%鹽酸乙腈溶液定容至50 mL。通過計算回收率，比較不同提取次數(shù)時的差異，結(jié)果見圖6。由圖6 看出，提取1 次的回收率達到90%以上，提取2 次的回收率達到95%以上，能提取完全。綜合考慮工作效率等問題，確定提取次數(shù)為2次。

圖6 不同提取次數(shù)對提取效率的影響

2.6 凈化方法考察

為了保護色譜柱和質(zhì)譜系統(tǒng)，需對提取液進行凈化處理。

2.6.1 QuEChERS凈化

QuEChERS 凈化技術(shù)具有快速、簡便、廉價、有效、穩(wěn)定和安全等特點[16]。試驗用了3 種配方的QuEChERS 凈化包，分別為凈化包1、凈化包2、凈化包3。

吸取1 mL 提取液加入到凈化包中，渦旋30 s 后9 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜后進樣分析，結(jié)果見圖7?？梢奊CB（凈化包3）對血根堿和白屈菜紅堿具有非常強的吸附作用，導致提取液經(jīng)凈化包3 凈化后回收率非常低。此外，含PSA 和C18的凈化包也會對目標化合物有吸附，回收率不理想。

圖7 QuEChERS凈化效果

2.6.2 陽離子交換柱

選取Agilent SCX（200 mg，6 mL）強陽離子交換柱進行試驗。使用前先用5 mL 甲醇和5 mL 水進行活化，吸取1 mL提取液和9 mL水混合后上樣，用5 mL水和5 mL 甲醇淋洗，負壓抽干后用6 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫。進行分步收集，每試管收集1 mL 洗脫液。對上樣后的流出液和淋洗液進行檢測，未檢出血根堿和白屈菜紅堿，說明SCX 能很好地吸附目標化合物。但收集到的6 管洗脫液中都含有血根堿和白屈菜紅堿，第5 管洗脫液中仍有8 ng/mL 左右的目標化合物。可見SCX 固相萃取柱對血根堿和白屈菜紅堿的吸附能力較強，結(jié)果見圖8。

圖8 固相萃取柱凈化后回收率

2.6.3 MCX混合型陽離子交換柱

選取Waters MCX（60 mg，3 mL）混合型陽離子交換柱繼續(xù)進行試驗。使用前先用3 mL 甲醇和3 mL水進行活化，吸取1 mL 提取液和9 mL 水混合后上樣，用3 mL 水和3 mL 甲醇進行淋洗，負壓抽干后用5 mL 5%氨水甲醇溶液進行洗脫。進行分步收集，每試管收集1 mL 洗脫液。對上樣后的流出液和淋洗液進行檢測，未檢出血根堿和白屈菜紅堿，說明MCX 也能很好地吸附目標化合物。但收集到的5 管洗脫液中也都含有血根堿和白屈菜紅堿，在5 mL 洗脫液中仍有2 ng/mL 左右的目標化合物。說明MCX 固相萃取柱對血根堿和白屈菜紅堿的吸附能力也較強，結(jié)果見圖8。

為了增加洗脫強度，提高氨水濃度至10%和20%。由結(jié)果可知增大氨水濃度對洗脫效果基本無影響。說明可能是由于陽離子交換柱中的填料本體對血根堿和白屈菜紅堿有較強的吸附，導致目標化合物洗脫不完全。

2.6.4 多用途親水-親脂平衡反相吸附固相萃取柱

HLB（Hydrophile Lipophilic Balance）固相萃取柱是一種多用途親水-親脂平衡反相吸附固相萃取柱，適用于酸、堿和中性化合物的凈化，可去除95%的常見基質(zhì)干擾物，例如蛋白質(zhì)、鹽類、磷脂等。

取6 mL提取溶液，通過Waters HLB（500 mg，6 mL）固相萃取柱，分步收集5 mL 通過液，并進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。由檢測結(jié)果可知，只要棄去前面1 mL，血根堿和白屈菜紅堿就有較好的回收率，回收率在95%以上，結(jié)果見圖8。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）主要是由質(zhì)譜檢測器的離子化過程產(chǎn)生，在電噴霧時，基質(zhì)內(nèi)的組分與目標化合物共同流出噴霧針，對電荷產(chǎn)生競爭，將產(chǎn)生的霧滴牢牢吸在一起，改變了帶電霧滴的表面張力，影響目標物的霧化、揮發(fā)、分裂、化學反應(yīng)以及帶電過程，致使進入質(zhì)譜的離子減少或增加，從而影響定量分析的可靠性和準確性。

基質(zhì)效應(yīng)可通過公式ME（%）=基質(zhì)溶液中標準曲線斜率/純?nèi)軇┲袠藴是€斜率×100 來評價[17]。ME 為85%～115%時，一般認為不存在基質(zhì)效應(yīng)；當ME＜85%時，則認為基質(zhì)對目標化合物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；當ME＞115%時，則認為基質(zhì)對目標化合物的響應(yīng)存在增強作用。血根堿和白屈菜紅堿基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果ME 為92.6%～103.0%，可見基質(zhì)對血根堿和白屈菜紅堿都無基質(zhì)效應(yīng)。

2.8 線性關(guān)系和檢出限

對血根堿、白屈菜紅堿標準工作溶液濃度為1～100 ng/mL 時進行儀器測定，以化合物濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性相關(guān)系數(shù)（r）≥0.999。

使用3 倍信噪比作為方法的檢出限，10 倍信噪比作為方法的定量限。因此方法檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.005 mg/kg。

2.9 回收率和精密度

在5 種基質(zhì)中（添加劑預混合飼料、濃縮飼料、配合飼料、精料補充料和水產(chǎn)飼料）進行加標回收試驗。加標濃度的低點為方法定量限（0.005 mg/kg），第二點在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第246號規(guī)定的最低點附近（0.1 mg/kg），第三點在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第246 號中規(guī)定的中間濃度附近（5 mg/kg），最高點在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第246號中規(guī)定的最高濃度附近（10 mg/kg）。每種基質(zhì)每個加標水平進行6 次重復，總體回收率為91.9%～101.0%，相對標準偏差為2.00%～7.96%，結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率、精密度（n=6，%）

2.10 試樣測定

在市面上購買畜添加劑預混合飼料、畜濃縮飼料、畜配合飼料各2 批次，作為試驗實際樣品，用建立好的方法對其進行檢測，測定結(jié)果見表3。由表3 可以看出，飼料中血根堿、白屈菜紅堿的濃度范圍為0.2～10.0 mg/kg。

表3 實際樣品檢測結(jié)果（mg/kg）

3 結(jié)論

本研究建立了一種使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中血根堿和白屈菜紅堿的方法。該方法具有良好的線性范圍，在質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL 范圍內(nèi)其線性相關(guān)系數(shù)≥0.999；定量限為0.005 mg/kg；方法在添加劑預混合飼料、濃縮飼料、配合飼料、精料補充料和水產(chǎn)飼料基質(zhì)中的四個濃度水平具有非常好的加標回收率和精密度，回收率為91.9%～101.0%，相對標準偏差為2.00%～7.96%。使用該方法對實際樣品進行檢測，證明該方法適用于飼料中血根堿和白屈菜紅堿的測定。