宋一曉，孫坤，劉學美，李子雁，隋智海*

（1.臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000；2.山東臨沂市河東區(qū)農(nóng)村農(nóng)業(yè)局，山東 臨沂 276034）

草魚（Ctenopharyngodon idellus），為典型的草食性淡水魚類，隸屬于鯉形目（Cypriniformes），雅羅魚亞科（Leuciscinae），草魚屬（Ctenopharyngodon）[1]，與青魚、鳙、鰱并稱為“四大家魚”，為中國養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的淡水經(jīng)濟魚類之一，2021 年養(yǎng)殖產(chǎn)量為557 萬t[2-3]。因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、價格低廉等，廣受消費者喜愛。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖密度的增加，草魚病害如草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）、柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）等頻發(fā)，造成了較大的經(jīng)濟損失，嚴重制約了草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[4-6]。

2022 年5 月，山東省臨沂市蒙陰縣某草魚養(yǎng)殖場暴發(fā)病害，病魚出現(xiàn)游動緩慢、覓食困難、口腔和體表出血、皮膚潰爛、脾臟腫大呈暗紅色和肝臟腫大充血等癥狀。為查明病因，從患病草魚脾肝腎混合組織中，分離純化出一株細菌，基于形態(tài)觀察、生理生化試驗、16S rRNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析等，進行了種類鑒定，并測定了其藥物敏感性。擬為草魚病害的有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2022 年5 月。試驗地位于臨沂大學膜蛋白與藥物工程實驗室。

1.2 材料

1.2.1 試驗魚從臨沂蒙陰縣某草魚養(yǎng)殖場收集瀕臨死亡的草魚，體長約25 cm，體質(zhì)量約1.5 kg。

1.2.2 試劑和儀器

LB 培養(yǎng)基（酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L）、瓊脂粉、瓊脂糖、2×Taq PCR Master Mix[生工生物工程（上海）股份有限公司]、細菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302）（天根生化科技（北京）有限公司）；革蘭染色液試劑盒（HB8278）、生理生化鑒定管（青島海博生物有限公司）；藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）；生物安全柜BSC-1304IIA（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、低速研磨器（天根生物有限公司）、臺式離心機Pico-21（Thermo Fisher）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)FR-1000（上海復日科技有限公司）、PCR 儀ETC 811（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、恒溫搖床QYC-200（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）、培養(yǎng)箱DMJM-358（寧波江南儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌分離與純化

用75%乙醇噴灑患病草魚體表并擦拭。用滅菌手術(shù)剪剖開魚腹部，采集病魚肝臟、脾、腎等組織，加入無菌PBS，采用低速組織研磨器，碾碎混勻。用接菌環(huán)，蘸取組織懸液，于LB 瓊脂培養(yǎng)基上劃線，置于28 ℃培養(yǎng)，選擇具有生長及生物學優(yōu)勢的菌株，在LB 瓊脂培養(yǎng)基上純化2 次。將處在生長對數(shù)期的菌株溶液，與同體積50%甘油混勻，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 病原菌形態(tài)學觀察

將細菌LB 液體培養(yǎng)至對數(shù)期，用接種環(huán)于LB固體平板上劃線，28 ℃過夜培養(yǎng)，觀測單菌落形態(tài)、大小和顏色等特征。取10 μL 對數(shù)期菌懸液，涂布在載玻片上，按照革蘭染色液試劑盒說明書，經(jīng)結(jié)晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脫色、沙黃復染和自然干燥后，用光學顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)特征。

1.3.3 病原菌生理生化試驗

將細菌LB 液體培養(yǎng)至對數(shù)期，向生理生化鑒定管加50 μL 菌懸液，用無菌封口膜封住管口，置于37 或42 ℃培養(yǎng)，完成MR-VP、賴氨酸脫羧酶肉湯、ONPG、尿酸酶、明膠、鳥氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對照、42 ℃生長試驗、不同濃度的胰胨水、糖類、醇類、精氨酸雙水解酶肉湯、氧化酶試紙等生理生化鑒定。試驗重復3 次。

1.3.4 16S rRNA 的PCR 擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析

取4 μL 菌液接種至新鮮的4 mL LB 液體中，過夜培養(yǎng)，將菌液12 000 g 離心5 min，收集1.5 mL菌體，用細菌基因組DNA 提取試劑盒，提取其基因組，作為PCR 擴增的模板。采用16S rRNA 基因通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’擴增目的片段，預期大小為1 500 bp。PCR 反應體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、基因組DNA1 μL、27F 2.5 μL、1492R 2.5 μL、無菌水19 μL。

PCR 反應程序：（1）95 ℃預變性10 min；（2）94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 次循環(huán)；（3）72 ℃保溫10 min。PCR 反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。采用在線BLASTN 程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast），進行序列同源性比對，下載同源性的16S rRNA 基因序列，采用MEGA-X軟件鄰接法（Neighborjoining method, NJ），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法進行藥敏特性測定。選用分別含一定濃度的羧芐西林、氨芐西林、米諾環(huán)素、頭孢唑啉、新霉素、紅霉素、頭孢拉定、丁胺卡那、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮、復方新諾明、頭孢曲松、克林霉素、諾氟沙星、呋喃唑酮、多黏菌素B、哌拉西林、麥迪霉素、氯霉素等20 種抗生素藥敏紙片。在無菌條件下，將60 μL 培養(yǎng)至對數(shù)期的新鮮菌液，均勻涂布在LB 瓊脂平板上，待瓊脂培養(yǎng)基表面基本干燥后，將藥敏紙片分別貼于瓊脂培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈并測量直徑大小，按照試劑盒說明書，判定其對藥物的敏感性。試驗重復3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)特征

從病魚肝脾腎混合組織中分離得到一株優(yōu)勢菌株，該菌株在LB 平板上形成表面光滑、邊緣整齊、不透明的圓形菌落[圖1（a）]。經(jīng)革蘭染色后，呈現(xiàn)紅色、短桿狀，表明該菌株為革蘭陰性菌[圖1（b）]。

圖1 病原菌形態(tài)特征

2.2 16S rRNA 基因序列擴增及進化樹分析

以該菌株基因組DNA 為模板，PCR 擴增16S rRNA 基因序列，擴增條帶單一，無非特異性擴增，位于1 000～2 000 bp 之間，符合預期大小，見圖2。經(jīng)BLASTN 序列比對后，發(fā)現(xiàn)其與魯氏耶爾森菌MYR-184（Yersinia ruckeriMYR-184）（GenBank No.MK290740.1）相似度高達100%。基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，該菌株與魯氏耶爾森菌親緣關(guān)系最近，聚在同一分支，表明該菌株可能為魯氏耶爾森菌，見圖3。

圖2 菌株16S rRNA 的PCR 擴增

圖3 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 生理生化特性

通過生理生化鑒定管試驗，測定菌株生理生化特征。結(jié)果表明，該菌株在1%～3%氯化鈉（NaCl）、42 ℃條件下均可生長，在鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、MR-VP、β-半乳糖苷酶、甘露糖、甘露醇試驗中，結(jié)果為陽性；在尿素酶、精氨酸雙水解酶、6%～10%NaCl、乳糖、纖維二糖、阿拉伯糖、蔗糖、氧化酶、明膠的試驗中，結(jié)果為陰性，見表1。該試驗結(jié)果與魯氏耶爾森菌標準菌株的生理生化特征相似。

表1 菌株生理生化特征①

2.4 菌株藥敏特性

通過紙片擴散法，檢測分離菌株對藥物的敏感性。結(jié)果表明，該菌株對環(huán)丙沙星、頭孢曲松、諾氟沙星等11 種藥物呈高度敏感；對四環(huán)素、米諾環(huán)素、呋喃唑酮藥物呈中度敏感；對萬古霉素、麥迪霉素、頭孢唑啉等6 種藥物呈耐藥性，見表2。

表2 菌株藥物敏感性測定①

3 討論

病原細菌感染的草魚，經(jīng)常引起腸炎、爛鰓、肝膽綜合征、出血癥等，導致其大量死亡[7]。其中，魯氏耶爾森菌（Yersinia ruckeri）是一種短桿狀的革蘭陰性病原菌，隸屬于腸桿菌科、耶爾森菌屬，易感染鮭、鱒類和溫水性魚類，可引起典型的紅口病，并伴有不同程度的內(nèi)臟發(fā)炎充血癥狀[8-10]。魯氏耶爾森菌具有較強的環(huán)境適應力和廣泛的宿主范圍，目前已從不同國家養(yǎng)殖的魚類如虹鱒、鰱、鳙、斑點叉尾等分離和鑒定出[11-15]。此外，耶爾森氏菌還可與其他病原菌如嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、柱狀黃桿菌（F.columnare）和殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）等混合感染魚類，引發(fā)病害[16-17]。本試驗從患病草魚內(nèi)臟組織內(nèi)分離純化出一株菌株，經(jīng)過形態(tài)學、生理生化、16S rRNA 序列分析等確定其為魯氏耶爾森菌，通過表型鑒定和分子遺傳學鑒定相結(jié)合，使鑒定結(jié)果更加準確可靠。

藥敏試驗結(jié)果表明，該菌株已具備多重耐藥性，但也存在對一定數(shù)量的抗生素敏感。這與其他的研究結(jié)果既有相似之處，也有不同之處。例如：與Y. ruckeriXB2 對麥迪霉素耐受結(jié)果一致[18]，與Y.ruckeriFF003 對新霉素中度耐受結(jié)果不一致[16]。

根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022 年2 號規(guī)定，今后可考慮適當使用硫酸新霉素粉（水產(chǎn)用）、維生素C 磷酸醋鎂鹽酸環(huán)丙沙星預混劑、鹽酸環(huán)丙沙星鹽酸小檗堿預混劑來防治魯氏耶爾森菌，避免濫用藥物導致耐藥菌加速進化。