楊宗英，李裕衛(wèi)，曾柳根*，楊移斌，嚴(yán)保華，姚毅

（1.南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330038；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223）

1 材料與方法

1.1 時(shí)間與地點(diǎn)

2023 年3 月20 日。試驗(yàn)地點(diǎn)為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.2 樣品來源

病魚樣品取自武漢江夏區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)。臨床癥狀主要為反應(yīng)遲鈍，食量減少，部分病魚漂浮池邊。查看發(fā)現(xiàn)，其體表潰爛，出現(xiàn)不規(guī)則圓形、橢圓形或卵圓形紅斑，邊緣充血，類似于“打印病”。解剖發(fā)現(xiàn)，病魚腸中無食，肝臟略腫大，色略淡，膽囊膨大充盈，膽汁豐富，呈墨綠色，見圖1（a）（b）（c）（d）。攻毒試驗(yàn)用天峽紅來自同一養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為（500±6）g。

圖1 發(fā)病天峽紅

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原分離鑒定

挑選顏色、形態(tài)、大小一致的優(yōu)勢(shì)單菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)。將純化后的菌株加入25%甘油，混勻后于-20 ℃保存[4]。

（2）分離菌人工感染及細(xì)菌再分離。將分離株再次在腦心浸出液瓊脂平板上劃線，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；用無菌生理鹽水洗下菌苔，參照麥?zhǔn)媳葷岱捌桨逵?jì)數(shù)法，調(diào)整菌懸液濃度為1.0×108cfu/mL。

1.3.2 病原菌鑒定

（1）生理生化鑒定。將分離株接種于腦心浸出液瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，對(duì)平板上的菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)進(jìn)行革蘭染色，并利用VITEK 2 compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀與革蘭陰性菌鑒定卡（GN），測(cè)定該菌及標(biāo)準(zhǔn)嗜水氣單胞菌[5]。

（2）基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析。將分離株L1，接種于腦心浸出液培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，經(jīng)12 000 r/min 離心收集菌體，用試劑盒提取DNA作為PCR 模板備用。分離株16S rDNA 序列，利用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增[4]，擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢擎科生物公司測(cè)定序列。

將分離株L1 16S rDNA 序列，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性檢索，選取同源性較高的嗜水氣單胞菌、部分其他種屬及水產(chǎn)常見病原菌16S rDNA序列，用漸進(jìn)的多序列比對(duì)方法，進(jìn)行序列在線比對(duì)?；谛蛄斜葘?duì)結(jié)果，用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[6]。

1.3.3 藥敏特性

分離株藥敏特性分析，采用k-B 藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作[7]。取單個(gè)分離株接種于腦心浸出液培養(yǎng)基中，經(jīng)200 r/min、恒溫28 ℃震蕩培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水調(diào)整分離株濃度為106cfu/mL。取200 mL 菌液，均勻涂布于水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，貼上不同種類的藥敏紙片，各紙片的中心距離≥24 mm，紙片距離培養(yǎng)皿邊緣的距離≥15 mm，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測(cè)量抑菌直徑，根據(jù)藥敏紙片說明書，判定分離株對(duì)不同藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離

表1 優(yōu)勢(shì)菌回感健康天峽紅試驗(yàn)結(jié)果

?

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

形態(tài)學(xué)觀察可見，分離菌株L1 為革蘭陰性短桿菌，菌落形態(tài)特征為：呈半透明的淡黃色，菌落圓形、邊緣整齊、表面凸起且光滑濕潤(rùn)，菌落直徑1～2 mm。

生理生化反應(yīng)顯示，菌株L1 的丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺、β-半乳糖苷酶、β-N—乙酰氨基葡糖苷酶、脂肪酶及酪氨酸芳胺酶等反應(yīng)呈陽(yáng)性；能分解利用D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露糖及D-甘露醇、蔗糖、D-海藻糖等，不能分解利用古老糖、塔格糖及D-山梨醇等，能生成H2S。該菌生化特征和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）一致[8]，生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 菌株L1 的生理生化試驗(yàn)結(jié)果①

2.2.2 基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育

基于菌株L1 與其他菌株的16SrDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2 可見，分離株L1 與嗜水氣單胞菌聚為一支，因此綜合判定病原菌L1 是嗜水氣單胞菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3 可見，該分離株對(duì)氟苯尼考、阿奇霉素、左氧氟沙星等11 種抗生素高度敏感；對(duì)紅霉素中度敏感；對(duì)利福平、阿莫西林、新霉素等抗生素耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果①

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過剖檢病魚并顯微鏡觀察，排除了寄生蟲感染的可能?；貧w感染試驗(yàn)結(jié)果表明，引起天峽紅大面積發(fā)病死亡的病原菌，是分離出的優(yōu)勢(shì)菌株L1。PCR 擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)致病菌16S rDNA 基因并測(cè)序，通過NCBI 的Blast 比對(duì)顯示，與嗜水氣單胞菌的相似性最高。綜合分析可以確定，嗜水氣單胞菌為致病菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)氟苯尼考、阿奇霉素、左氧氟沙星等11 種抗生素高度敏感；對(duì)利福平、阿莫西林、新霉素等抗生素耐藥。