孫曉東 謝麗霞 杜凱麗 許倩倩 桑明

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，襄陽 441000）

微小RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其編碼基因通常位于結(jié)構(gòu)基因之間或內(nèi)含子區(qū)域，成熟的miRNA長約22 nt。它們在細胞生長發(fā)育、免疫反應(yīng)、腫瘤生長等生理、病理過程及疾病治療中發(fā)揮重要作用［1-2］。人miR-155基因定位于第21號染色體，是一個古老的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子，同物種中的序列保守性較強，被普遍認(rèn)為參與機體造血細胞和免疫細胞的發(fā)育分化、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、肌肉發(fā)育及脂肪分化等生物過程［3-5］。既往研究證實，miR-155對于維持機體正常的免疫功能必不可少［6］。已有研究證實，miR-155在乳腺癌中是上調(diào)最明顯的miRNA之一，普遍認(rèn)為其是一種促進腫瘤生長、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移的致癌miRNA［7-9］。大量研究提示miR-155表達水平與多種實體腫瘤的預(yù)后相關(guān)，亦可用于腫瘤診斷［8-13］。說明miR-155對免疫細胞和腫瘤細胞的調(diào)控作用不一致。那么，機體的miR-155表達水平對腫瘤免疫監(jiān)視及腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成發(fā)揮何種作用？本研究利用miR-155基因敲除（miR155-/-）小鼠構(gòu)建乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，從外周血免疫分型方面比較miR155-/-小鼠與野生型（wide-type，WT）小鼠存在的差異，旨在為腫瘤免疫相關(guān)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 雌性C57BL/6J小鼠，6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］；B6.Cg-Mir155tm1Rsky/J（miR155-/-）小鼠（The Jackson Laboratory，Stock No.007745）由湖北醫(yī)藥學(xué)院李平飛博士惠贈。小鼠飼養(yǎng)于20～22 ℃、相對濕度50%～60%的無特定病原體（specific-pathogen free，SPF）飼養(yǎng)間［SCXK（鄂）2017-0093］，隨意喂食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和凈化滅菌水。按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷，所有動物實驗均通過湖北醫(yī)藥學(xué)院動物倫理委員會審批（XYYYE20210007）。小鼠乳腺癌細胞系E0771購自湖南豐匯生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 細胞培養(yǎng)及研究所用的DMEM（11965-092）、胰酶（25300054）購自Gibco公司（美國）；二甲基亞砜（DMSO，D2650）購自Sigma-Aldrich公司（美國）；鼠尾直接PCR試劑盒（快速基因型鑒定，B40015）購自Bimake公司（上海）；流式檢測抗體（FITC-B220/CD4/Gr-1、PE-CD49b/CD8/CD11b、Percp·CY5.5-CD3、PE·CY7-Ly-6C/CD25、APC-Ly-6G/FOXP3、APC·CY7-CD45）均購自BD公司（BD，F(xiàn)ranklin Lakes，USA）；BD FACSAria Ⅱ流式細胞儀購自BD公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 公共數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析 利用Cancer-MIRNome數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo.jialab-ucr.org/CancerMIRNome/#tab-1929-4）比較miR-155在乳腺癌組織、外周循環(huán)中的表達差異，進行ROS曲線、Kaplan Meier生存分析。利用miRactDB數(shù)據(jù)庫（https：//ccsm.uth.edu/miRactDB）對miR-155在不同病理級別乳腺癌組織中的表達進行分析。

1.2.2 快速基因型鑒定 按照鼠尾直接PCR試劑盒提取小鼠DNA。剪取小鼠尾尖0.3～0.5 cm，每個樣本加入100 μl新鮮組織消化液，55 ℃消化15 min，每5 min振蕩混勻1次。95 ℃孵育5 min滅活消化液中的蛋白酶。12 000 r/min離心5 min，取上清作為PCR模板。引物由金凱瑞生物科技有限公司合成（武漢），引物序列如下：miR-155-WT F-5'-AATCATTCCTGAGGGCTACC-3'；miR-155-Mut F-5'-GCCTGAAGAACGAGATCAGC-3'；Common：5'-GGAAACGTGGGTCTCCTTAC-3'。PCR反應(yīng)體系為20 μl：2×M-PCR OPTITM Mix 10.0 μl，正反向引物各0.5 μl，模板DNA 1.0 μl，ddH2O 8.0 μl；采用降落PCR程序（表1）。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用Bio-Rad凝膠分析系統(tǒng)拍照觀察。

表1 降落PCR程序Tab.1 Procedure of touchdown PCR

1.2.3 動物分組及干預(yù) 取WT和miR155-/-小鼠各10只，其中各5只用于制備乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型后進行外周免疫細胞檢測，另外各5只用于直接進行外周免疫細胞檢測。

1.2.4 細胞培養(yǎng) E0771細胞置于添加10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。消化對數(shù)增長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5 小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型 取6周齡左右的WT和miR155-/-小鼠各5只，每只小鼠尾靜脈注射1×105個/200 μl E0771細胞，2個月后，記錄體質(zhì)量，0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（50 mg/kg），心臟采血（EDTA-K3抗凝）后，脫頸處死小鼠，取小鼠肺部稱重并計算臟器指數(shù)，置于4%多聚甲醛固定、石蠟包理，5 μm連續(xù)切片。HE染色檢測后進行全片掃描。

1.2.6 外周血淋巴細胞亞群檢測 對EDTA抗凝小鼠外周血進行多色抗小鼠單克隆抗體試劑和匹配的同型對照進行染色，80 μl/管，第1管加入FITCB220、PE-CD49b、Percp·CY5.5-CD3、PE·CY7-Ly-6C、APC-Ly-6G、APC·CY7-CD45；第2管加入FITC-CD4、PE-CD8、Percp·CY5.5-CD3、PE·CY7-CD25、APCFOXP3、APC·CY7-CD45；第3管加入FITC-Gr-1、PECD11b、PE·CY7-Ly-6C、APC-Ly-6G、APC·CY7-CD45，于室溫避光孵育30 min，裂解紅細胞后用PBS洗滌，使用BD流式細胞儀檢測，并應(yīng)用FlowJo軟件進行分析。主要檢測B淋巴細胞（B220+）、T淋巴細胞（CD3e+）、輔助T（Th）細胞（CD4+）、細胞毒T（Tc）細胞（CD8a+）、自然殺傷（NK）細胞（CD49b+）、單核細胞（Ly-6C）、中性粒細胞（Ly-6G）、調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞（CD25+/FOXP3+）、髓源性抑制細胞（MDSCs）（Gr1+/CD11b+）及MDSCs中的單核細胞亞群（M-MDSCs）（Ly-6C）和粒細胞亞群（G-MDSCs）（Ly-6G）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異比較采用t檢驗，差異顯著性水平設(shè)為α=0.05，應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 公共數(shù)據(jù)庫中miR-155的表達與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 對TCGA數(shù)據(jù)庫中已有測序數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-155在乳腺癌組織中相對高表達（P＜0.000 1，圖1A）；ROC曲線下面積（AUC）為0.84（圖1B）；Kaplan Meier生存分析顯示miR-155的預(yù)后價值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1C），表明miR-155在乳腺癌組織中高表達，但與預(yù)后無明顯相關(guān)性。通過GSE73002數(shù)據(jù)集分析在外周循環(huán)中miR-155的水平與乳腺癌是否有相關(guān)性［14］，miR-155在乳腺癌及良性乳腺疾病患者外周血清中的含量與正常對照相比均有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1D）；前瞻性研究GSE44281數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果顯示miR-155不能作為乳腺癌的預(yù)測分子（圖1E）［15］；對miRactDB數(shù)據(jù)庫中不同病理分期乳腺癌組織中miR-155的表達水平進行分析，結(jié)果顯示miR-155在所有級別的乳腺癌中均高表達（P＜0.000 1，圖1F）。

圖1 hsa-miR-155在乳腺癌組織及循環(huán)中的表達水平及其與預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Expression level of hsa-miR-155 in breast cancer tissues and its relationship with prognosis

2.2 小鼠基因型鑒定正確 B6.Cg-Mir155tm1Rsky/J小鼠是C57背景的轉(zhuǎn)基因小鼠，因此本實驗中以C57BL/6J為WT對照。根據(jù)WT小鼠DNA的PCR產(chǎn)物大小為165 bp，miR155-/-PCR產(chǎn)物大小為226 bp，miR155-/+PCR產(chǎn)物大小為165 bp和226 bp［16］，結(jié)果如圖2所示，除5號和9號小鼠為雜合子，其余小鼠均為純合子，說明本實驗使用的miR-155基因敲除小鼠的基因型是正確的。

圖2 小鼠miR-155 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of miR-155 in mice

2.3 miR-155基因敲除對小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型建立的影響 從臟器系數(shù)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射E0771細胞2個月后，WT小鼠和miR155-/-小鼠肺組織外觀無明顯肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶（圖3A），肺重量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）；HE病理切片結(jié)果顯示，尾靜脈注射1×105個E0771細胞2個月時，WT小鼠僅有1只肺部成瘤，其余小鼠肺部有炎癥浸潤現(xiàn)象；所有miR155-/-小鼠肺部均能觀察到較小的轉(zhuǎn)移灶，且充血和炎癥浸潤情況更明顯。典型對比圖如圖3C所示。

圖3 小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型病理結(jié)果Fig.3 Pathological results of mouse model of lung metastasis of breast cancer

2.4 miR-155基因敲除對小鼠外周血免疫分型的影響 流式圖分析外周血免疫細胞分型的圈門策略如圖4A、圖5A、圖6A所示。淋巴細胞分型結(jié)果如圖4B所示，相對于WT型小鼠，miR155-/-小鼠T淋巴細胞百分比顯著降低［WT：（21.76±3.17）%，miR155-/-：（11.86±2.09）%，P＜0.05］；B淋巴細胞、NK細胞、中性粒細胞百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；單核細胞百分比顯著降低［WT：（21.76±3.17）%，miR155-/-：（11.86±2.09）%，P＜0.05］。T細胞分型結(jié)果如圖5B所示，相對于WT型小鼠，miR155-/-小鼠Th細胞占T淋巴細胞亞群的百分比明顯降低［WT：（49.84±4.26）%，miR155-/-：（26.74±4.29）%，P＜0.05］，Tc細胞占T淋巴細胞亞群的百分比亦明顯降低［WT：（17.12±3.43）%，miR155-/-：（11.78±1.98）%，P＜0.05］；Treg細胞占Th的百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MDSC細胞分型結(jié)果如圖6B所示，MDSCs百分比顯著升高［WT：（6.27±1.84）%，miR155-/-：（11.05±1.17）%，P＜0.01］；MDSCs中M-MDSCs占比顯著降低［WT：（19.28±5.11）%，miR155-/-：（12.76±3.55）%，P＜0.05］；MDSCs中G-MDSCs占比顯著升高［WT：（46.40±8.23）%，miR155-/-：（66.84±5.89）%，P＜0.05］。

圖4 野生型小鼠和miR155-/-小鼠外周免疫細胞分型分析Fig.4 Analysis of peripheral blood immune cell typing between miR155-/- and WT mice

圖5 野生型小鼠和miR155-/-小鼠外周T淋巴細胞分型分析Fig.5 Comparison of peripheral T lymphocytes typing between miR155-/- and WT mice

圖6 野生型小鼠和miR155-/-小鼠外周MDSCs細胞分型分析Fig.6 Analysis of peripheral MDSCs typing between miR155-/- and WT mice

2.5 miR-155基因敲除對小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型外周免疫細胞分型的影響 小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型的淋巴細胞分型結(jié)果如圖4C所示，相對于WT小鼠，miR155-/-小鼠B淋巴細胞和單核細胞的百分比均無明顯差異；T淋巴細胞的百分比明顯升高［WT：（40.94±3.18）%，miR155-/-：（46.36±2.59）%，P＜

0.05］；NK細胞百分比顯著降低［WT：（5.936±2.14）%，miR155-/-：（3.956±1.57）%，P＜0.05］；中性粒細胞百分比顯著降低［WT：（8.254±0.23）%，miR155-/-：（4.16±1.53）%，P＜0.001］；小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型的T淋巴細胞分型結(jié)果如圖5C所示，相對于WT小鼠，miR155-/-小鼠Th細胞占T淋巴細胞亞群的百分比明顯降低［WT：（25.672±3.31）%，miR155-/-：（14.99±3.19）%，P＜0.01］，Tc細胞占T淋巴細胞亞群的百分比無顯著差異，Treg細胞占Th的百分比無顯著變化。小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型的MDSCs分型結(jié)果如圖6C所示，相較于WT小鼠，miR155-/-小鼠MDSCs百分比顯著升高［WT：（6.27±1.84）%，miR155-/-：（11.05±1.17）%，P＜0.01］；MDSCs中M-MDSCs占比顯著降低［WT：（17.16±3.11）%，miR155-/-：（7.61±3.77）%，P＜0.01］，而GMDSCs占比顯著升高［WT：（74.04±3.08）%，miR155-/-：（87.78±7.52）%，P＜0.01］。

3 討論

近年來，大量研究表明miR-155在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，miR-155在激活的免疫細胞中高表達，是自身免疫病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子［3，6，17］。RODRIGUEZ等［3］發(fā)現(xiàn)，miR155-/-小鼠的T淋巴細胞、B淋巴細胞及樹突狀細胞的功能都遭到破壞，說明miR-155對于維持機體正常的免疫功能必不可少。本文通過生物信息學(xué)方法分析TCGA和mi-RactDB數(shù)據(jù)庫中乳腺癌miRNA芯片及測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-155在乳腺癌組織及不同病理級別的乳腺癌組織中的表達均顯著升高，但預(yù)后分析及血清中miR-155的水平無顯著差異［15-16］。提示miR-155在實體腫瘤與免疫系統(tǒng)中可能發(fā)揮不同作用。T淋巴細胞是機體抵御腫瘤形成的主要成員，其中Th細胞可識別腫瘤細胞表面的抗原肽，進而激活其他具有抗腫瘤功能的免疫細胞，Th細胞和Tc細胞的不足是腫瘤免疫逃逸的重要原因［18-20］。MDSCs是未成熟骨髓細胞的異質(zhì)群體，包含M-MDSC和G-MDSC兩個亞群，都顯示出免疫抑制效應(yīng)，并通過多種機制參與腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成［21-25］。實驗結(jié)果顯示，miR155-/-小鼠外周T淋巴細胞、單核細胞和MDSCs占外周血白細胞的比例顯著低于WT小鼠；T細胞中Th細胞和Tc細胞的占比均顯著低于WT小鼠，MDSCs中M-MDSC顯著低于WT小鼠，G-MDSC顯著高于WT小鼠。說明miR-155基因缺失使小鼠外周血中與腫瘤細胞識別和殺傷相關(guān)的免疫細胞減少，而與腫瘤免疫抑制相關(guān)的細胞增多。

包括乳腺癌在內(nèi)的眾多腫瘤類型中，轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要誘因，90%的腫瘤患者死亡是癌細胞轉(zhuǎn)移所致［26］。惡性細胞轉(zhuǎn)移是一個早期的過程，大多數(shù)轉(zhuǎn)移的細胞在循環(huán)中被清除或在包括骨髓在內(nèi)的遠處器官中保持休眠，極少數(shù)細胞最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶［27］。在尾靜脈注射少量小鼠乳腺癌細胞制造肺轉(zhuǎn)移模型后，miR155-/-小鼠外周T細胞較荷瘤的WT小鼠顯著升高，這可能與乳腺癌細胞進入機體后引起的免疫反應(yīng)有關(guān)，但Th細胞和NK細胞的占比相對荷瘤的WT小鼠顯著降低。NK細胞是一類無需預(yù)先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細胞的淋巴細胞［28］。這一結(jié)果提示miR155-/-小鼠由于免疫系統(tǒng)的失調(diào)不能及時識別并清除腫瘤細胞，使循環(huán)中的腫瘤細胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。有文獻報道，MMDSCs通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和促進腫瘤干細胞表型的增強促進腫瘤細胞從原發(fā)部位擴散；而肺組織中G-MDSCs表現(xiàn)出促進細胞增殖的現(xiàn)象［21］。MMDSC占比升高與不良預(yù)后相關(guān)，是腫瘤免疫逃逸的參與者［29］；循環(huán)和腫瘤G-MDSCs在不同的腫瘤類型中呈現(xiàn)升高狀態(tài)［30］。在本實驗中，與WT小鼠比較，miR155-/-小鼠外周血中G-MDSC占比顯著升高（P＜0.05）；在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型中，這一差異更為顯著（P＜0.01）。提示miR-155可能參與調(diào)控MDSCs的分化，miR-155基因的缺失導(dǎo)致MDSCs增加，促進了腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成，特別是G-MDSC亞群的顯著增加可能促進了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

綜上所述，miR-155對于正常的免疫系統(tǒng)發(fā)育和維持至關(guān)重要，在腫瘤免疫監(jiān)視過程中亦發(fā)揮重要作用，miR-155缺失會導(dǎo)致機體免疫功能紊亂，失去腫瘤免疫監(jiān)視機制，同時G-MDSCs比例的增高為腫瘤的肺轉(zhuǎn)移提供了有利條件。本研究的局限在于實驗動物的生物學(xué)重復(fù)較少，實體腫瘤中miR-155的高表達與機體免疫反應(yīng)及腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系仍需深入研究。