張小雨 譚海波 黃敏儀 貝偉劍 楊祎琦 （廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣州 510006）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要病因［1］。近年來，糖尿病在我國的發(fā)病率急劇增加，這就導(dǎo)致了DKD的發(fā)病率也持續(xù)攀升［2］。2021年國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布全球糖尿病患者已突破5.73億，而中國已破1.4億成為世界之最，其中10%～40%的糖尿病患者會進(jìn)展為DKD，給我國國民健康帶來了巨大的威脅和挑戰(zhàn)［3］。DKD發(fā)生過程中會伴隨大量的CD4+T細(xì)胞水平升高和IL-17促炎因子的釋放，并刺激和趨化巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞向腎臟組織遷移，導(dǎo)致足細(xì)胞病變、腎小球硬化和蛋白尿的增加，最終導(dǎo)致DKD［4］。越來越多證據(jù)表明，T淋巴細(xì)胞激活和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和2型糖尿病及DKD密切相關(guān)［5］。機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞群，外周血成熟T細(xì)胞主要有CD4+T和CD8+T兩個亞群，其中CD4+T細(xì)胞識別主要是組織相容性復(fù)合物（MHC）Ⅱ遞呈的抗原肽，經(jīng)激活分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)或協(xié)助免疫反應(yīng)［6］。然而CD4+T細(xì)胞在DKD中是如何被激活的還有待進(jìn)一步研究［7］。由于DKD患者常伴隨脂代謝異常，因此本研究從細(xì)胞分選與非靶向脂質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的角度初步探討了db/db小鼠CD4+T細(xì)胞在脂代謝中的差異，明確了差異代謝產(chǎn)物的數(shù)量和種類，分析其可能的代謝途徑，以期揭示DKD的免疫細(xì)胞脂質(zhì)代謝特征，為以CD4+T細(xì)胞為靶標(biāo)的DKD臨床藥物研發(fā)提供新思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本研究采用SPF級BKS.Cg-Dock7m+/+Lepr db/J自發(fā)性DKD雄性小鼠為研究對象，設(shè)置正常組（m/m，25～30 g，10～12周齡）和DKD模型組（db/db，45～50 g，10～12周齡），飼養(yǎng)至12周，取小鼠脾臟備檢。小鼠均購自中國常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司［SCXK（蘇）2016-0010］，合格證號：NO.202006494。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（gdpulac2019180）。

1.1.2 試劑及耗材 耦聯(lián)大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體的磁珠（德國美天旎生物技術(shù)有限公司，140-005-121）；BSA（威佳科技，Y170720，批號：180728）；LS柱（5190923106）、MS柱（5191015024）、MidiMACSTMSeparator（5190814151）、MiniMACSTMSeparator（5190807507）、MACS MultiStand磁力架（50495） 均購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 BT125D精密電子天平（Sartorius）；Mithras LB940微孔板式多功能酶標(biāo)儀（Berthold technologies）；多光譜顯微鏡（Olympus）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特）；Centrifuge 5810R高速離心機(jī)（Eppendorf）；OPTION-S 7超純水儀（ELGA Lab Water）；8000直熱氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）；血糖儀（羅氏-卓越金采型）；LC-MS/MS（ExionLC AD UPLC-QTRAP，SCIEX）；離心機(jī)（5424R， Eppendorf）；電子天平（AS 60/220.R2，RADWAG）；球磨儀（MM400，Retsch）；離心濃縮儀（CentriVap，LABCONCO）；渦旋混合器（VORTEX-5，Kyllin-Bell）；超聲清洗儀（KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 db/db小鼠DKD特征檢測 檢測小鼠體質(zhì)量及空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）情況，當(dāng)FBG＞11.1 mmol/L時認(rèn)為糖尿病模型成功；通過試劑盒檢測尿白蛋白/肌酐比值（UACR），模型組UACR顯著高于正常組，則認(rèn)為DKD模型成功［7-8］。通過HE染色法檢測腎臟組織病理改變情況，當(dāng)腎小球體積變大，并呈現(xiàn)明顯的系膜擴(kuò)張，腎間質(zhì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，即可認(rèn)為DKD小鼠達(dá)到備檢要求［9-10］。

1.2.2 脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備 研磨脾臟，用70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，并收集單細(xì)胞懸液置于15 ml離心管中，將裝有細(xì)胞懸液的15 ml離心管置于離心機(jī)（4 ℃、300 g離心5 min），棄上清；加1 ml紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育10 min，400 g離心5 min，去上清，加1 ml PBS，400 g離心5 min，棄上清；然后重懸進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；并取適量懸浮液進(jìn)行CD4流式抗體標(biāo)記30 min，采用PBS洗滌2次，200 μl PBS重懸，采用流式細(xì)胞儀鑒定CD4+T細(xì)胞在分選前的比例。

1.2.3 脾臟CD4+T細(xì)胞磁珠分選及純度鑒定 根據(jù)CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒進(jìn)行操作，首先將含1×107個脾臟單細(xì)胞懸液離心后棄上清，再加入90 μl緩沖液及10 μl CD4（L3T4）Microbeads（磁珠），充分混合，置于4 ℃冰箱中孵育10 min，進(jìn)行后續(xù)的磁性細(xì)胞分離。將LS柱置于適當(dāng)?shù)腗ACS分離器磁場中，用適量緩沖液沖洗柱（MS：500 μl，LS：3 ml），將細(xì)胞懸液涂在色譜柱上，收集含有未標(biāo)記細(xì)胞的流出物，即為CD4+T細(xì)胞部分。用適量的緩沖液洗滌色譜柱，收集流出的未標(biāo)記細(xì)胞，并與以上未標(biāo)記細(xì)胞的流出物混勻（MS：2×500 μl，LS：1×3 ml）。從分離器中取出色譜柱并將其放在合適的收集管中，用移液管將適量的緩沖液移到柱上，通過將柱塞牢牢地推入柱中，立即沖洗出磁性標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行純度鑒定［11］。

1.2.4 脾臟CD4+T細(xì)胞非靶向脂質(zhì)組學(xué)檢測前處理 取分選的細(xì)胞（8×106個），加入400 μl 80%甲醇溶液，放入預(yù)冷的-80 ℃凍干機(jī)中凍干；將凍干好的樣本取出，加入1 ml脂質(zhì)提取劑，渦旋5 min，4 ℃靜置15 min；加入200 μl超純水，渦旋3 min，4 ℃靜置分層；12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取200 μl上清液濃縮；向濃縮干的樣本中加入200 μl復(fù)溶劑，振蕩5 min，離心5 min；取150 μl上清液到進(jìn)樣瓶，并上機(jī)檢測。

1.2.5 脾臟CD4+T細(xì)胞非靶向脂質(zhì)組學(xué)檢測色譜質(zhì)譜采集條件 色譜采用超高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)［12］。色譜條件為：Thermo AccucoreTMC30 色譜柱（2.1×100 mm，2.6 μm），流動相A為乙腈/水（60/40，V/V）（含0.1%甲酸，10 mmol/L甲酸銨）；流動相B為乙腈/異丙醇（10/90，V/V）（含0.1%甲酸，10 mmol/L甲酸銨）；梯度系統(tǒng)：0～2 min，80%～70% A；2～4 min，70%～40% A；4～9 min，40%～15% A；9～14 min，15%～10% A；14～15.5 min，10%～5% A；15.5～17.3 min，5% A；17.3～17.5 min，5%～80%A；17.5～20 min，80% A；流速0.35 ml/min；柱溫45 ℃，進(jìn)樣量 2 μl。

質(zhì)譜采用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）系統(tǒng)［13］。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（ESI）500 ℃，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓-4 500 V，離子源gas 1（GS1）45 psi，gas 2（GS2）55 psi，簾氣（CUR）35 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（CAD）參數(shù)設(shè)置為Medium。在三重四極桿中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進(jìn)行掃描檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行峰識別、峰過濾等預(yù)處理，得到保留時間、離子檢測的離子流強(qiáng)度及峰面積。采用R軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）多元統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)VIP值，結(jié)合t檢驗(yàn)，篩選出“VIP≥1，P＜0.05”的差異代謝物?；谧越ò邢驑?biāo)品數(shù)據(jù)庫MWDB，根據(jù)檢測物質(zhì)的保留時間RT、子母離子對信息及二級譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，預(yù)測脂質(zhì)代謝信號通路。

2 結(jié)果

2.1 db/db小鼠DKD特征檢測結(jié)果 與正常組（m/m）相比，模型組（db/db）的體質(zhì)量和血糖顯著升高（P＜0.05），UACR、低密度脂蛋白（LDL-C）顯著增加（P＜0.01），高密度脂蛋白（HDL-C）顯著降低（P＜0.01），總膽固醇（TC）顯著增加（P＜0.01），且模型組小鼠腎臟腎小球體積變大、呈現(xiàn)明顯的系膜擴(kuò)張，并伴隨炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1。提示該db/db小鼠具有DKD表型。

2.2 CD4+T細(xì)胞分選及純度鑒定結(jié)果 與正常組（m/m）相比，db/db小鼠CD4+T細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），db/db小鼠分選后CD4+T細(xì)胞比分選前顯著升高（P＜0.01），m/m小鼠分選后CD4+T細(xì)胞比分選前顯著升高（P＜0.01），且CD4+T細(xì)胞在分選前后純度由10%提高至80%，見圖2。

圖2 CD4+T細(xì)胞分選流式結(jié)果Fig.2 Flow cytometry results of CD4+T cell sorting

2.3 非靶向脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果

2.3.1 代謝物定性定量分析結(jié)果 代謝物定量采用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）分析完成。并采用軟件Analyst 1.6.3進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過LC-MS法共檢測出463個代謝產(chǎn)物。見附圖1（www.immune99.com）。

2.3.2 主成分分析（PCA）結(jié)果 利用PCA了解各組樣本之間的代謝物差異大小。正常組（m/m）和模型組（db/db）在PCA二維結(jié)果，見圖3A。橫坐標(biāo)PC1表示第一主成分，占樣品差異的58.43%?？v坐標(biāo)PC2表示第二主成分，占樣品差異的16.42%，而在兩組PCA三維結(jié)果，見圖3B。橫坐標(biāo)PC3表示第三主成分，占樣品差異的8.87%。說明縱向分布顯著分開，但橫向仍有部分交叉，代謝組分能夠在兩組間實(shí)現(xiàn)有效分離。

圖3 主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis

2.3.3 正交偏最小二乘法判別（OPLS-DA）分析結(jié)果 為了更好地識別正常組和DKD組CD4+T細(xì)胞差異脂質(zhì)的變化，進(jìn)一步進(jìn)行兩組間OPLS-DA分析。為防止模型過擬合，進(jìn)一步采用200次置換檢驗(yàn)驗(yàn)證模型。OPLS-DA模型中R2X=0.808；R2Y=0.999，Q2=0.882，表明模型擬合度和預(yù)測能力良好。對463個代謝產(chǎn)物按照物質(zhì)一級分類，分別是甘油磷脂類、甘油脂類、鞘脂類、脂肪酰類以及異戊烯醇酯類。其中甘油磷脂類在代謝產(chǎn)物中的分類占比最大，有301個物質(zhì)，其中大部分是磷脂酰膽堿、其次是磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸以及磷脂酰肌醇等物質(zhì)。證明了磷脂酰膽堿是DKD組CD4+T細(xì)胞改變的關(guān)鍵差異脂質(zhì)，見圖4。

圖4 OPLS-DA分析圖及脂質(zhì)代謝物占比圖Fig.4 OPLS-DA analysis diagram and lipid metabolite proportion diagram

2.3.4 差異代謝物篩選結(jié)果 以差異倍數(shù)值（fold change）≥2和差異倍數(shù)值（fold change）≤0.5以及VIP≥1為條件篩選差異代謝物。差異代謝物火山圖顯示（圖5）：兩組共有439種代謝物無顯著性差異，一共有24個代謝物有顯著性，且上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物的定量差異倍數(shù)較大。db/db小鼠中，有15個差異代謝物下調(diào)，分別是磷脂酰膽堿_PC（18：2_18：2）、磷脂酰甘油_PG（18：1_22：5）、肉堿C12-OH、甘油二酯_DG（18：2_18：2）、甘油二酯_DG（18：2_20：4）、溶血磷脂酰膽堿_LPC（0：0/20：0）、溶血磷脂酰膽堿_LPC（20：0/0：0）、溶血磷脂酰膽堿_LPC（20：2/0：0）、磷脂酰膽堿_PC（17：1_18：1）、磷脂酰膽堿_PC（19：0_18：2）、磷脂酰膽堿_PC（17：0_20：3）、磷脂酰膽堿_PC（19：0_20：4）、磷脂酰乙醇胺_PE（17：1_18：1）、磷脂酰乙醇胺_PE（18：1_18：1）、磷脂酰乙醇胺_PE（19：0_18：2）等物質(zhì)；有9個差異代謝物上調(diào)，分別是磷脂酰乙醇胺_PE（18：1_22：5）、磷脂酰甘油_PG（18：0_20：4）、磷脂酰甘油_PG（18：1_20：4）、磷脂酰甘油_PG（18：1_20：5）、糖鞘脂_HexCer（d18：1/24：0）、溶血磷脂酰乙醇胺_LPE（P-18：1）、磷脂酰絲氨酸_PS（18：0_20：5）、磷脂酰絲氨酸_PS（18：1_22：6）、三酰甘油_TG（16：1_18：1_18：1）等物質(zhì)。見表1。

表1 差異代謝物篩選結(jié)果Tab.1 Screening results of differential metabolites

圖5 差異代謝物火山圖Fig.5 Volcano map of differential metabolites

差異代謝物小提琴圖利用violin plot分析比較單個脂質(zhì)差異代謝物在兩組中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：在正常組（m/m）和模型組（db/db）中磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿等脂質(zhì)差異代謝物的表達(dá)量差異較大（圖6）。說明了磷脂類代謝與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖6 差異代謝物小提琴圖Fig.6 Violin chart of differential metabolites

2.3.5 差異代謝物KEGG分類以及富集分析圖7A結(jié)果顯示：差異代謝物KEGG分類主要分為有機(jī)系統(tǒng)類、代謝類、人類疾病相關(guān)類、環(huán)境信息處理類以及細(xì)胞進(jìn)程類。其中差異代謝物屬于甘油磷脂代謝通路以及代謝途徑通路占比最大，分別占84.21%和78.96%。該結(jié)果證明了正常組（m/m）和模型組（db/db）的CD4+T細(xì)胞的脂質(zhì)差異代謝物在甘油磷脂代謝通路和代謝途徑通路上有顯著差異。對KEGG通路進(jìn)行富集分析，結(jié)果表明正常組（m/m）和模型組（db/db）的CD4+T細(xì)胞的脂質(zhì)差異代謝物主要涉及甘油磷脂代謝、癌癥中的膽堿代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、甘油脂代謝、磷酸肌醇代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等代謝途徑。其中甘油磷脂代謝的點(diǎn)顏色最紅，表示參與其中的代謝物或代謝通路發(fā)生的變化越明顯。其次是癌癥中的膽堿代謝也較為顯著，見圖7B。說明了DKD CD4+T細(xì)胞甘油磷脂類代謝通路的紊亂與DKD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖7 差異代謝物KEGG分類以及富集分析Fig.7 KEGG classification and enrichment analysis of differential metabolites

3 討論

DKD是慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因［14］。大量研究顯示CD4+T細(xì)胞與ESRD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［15-16］。CD4+T淋巴細(xì)胞的募集和浸潤可能參與了DKD進(jìn)展過程中免疫發(fā)病機(jī)制的啟動和進(jìn)展［17-18］。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DKD患者常伴有脂代謝紊亂，然而具體機(jī)制及內(nèi)在聯(lián)系仍未十分明確［19-20］。本文主要通過對DKD小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞脂質(zhì)代謝差異進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)正常組（m/m）和模型組（db/db）小鼠內(nèi)源性脂質(zhì)代謝產(chǎn)物差異主要為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺等物質(zhì)的改變。有研究表明，甘油磷脂代謝通路與機(jī)體脂代謝和糖代謝紊亂密切相關(guān)，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺都是甘油磷脂的代謝產(chǎn)物，糖尿病與慢性腎病等代謝性疾病的患者血清中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量均有異常改變，且這兩類脂質(zhì)中間產(chǎn)物與糖尿病并發(fā)的炎癥、氧化應(yīng)激和動脈硬化等密切相關(guān)［21］。溶血磷脂酰膽堿是磷脂酰膽堿合成的中間產(chǎn)物，同時也是細(xì)胞膜與介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本組成部分，而磷脂酰膽堿是細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的主要成分［22］。在細(xì)胞膜融合、胞飲作用、膜運(yùn)轉(zhuǎn)作用及膜中酶的催化活性等方面起重要的作用。能使血漿中膽固醇水平降低20%［23-24］。本研究結(jié)果顯示溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿在db/db脾臟CD4+T細(xì)胞中顯著下調(diào)，且主要涉及甘油磷脂代謝通路紊亂，可能是DKD進(jìn)展的潛在新機(jī)制。

綜上所述，脂質(zhì)代謝組學(xué)是脂代謝疾病生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的新方法［25］。由于DKD患者常伴隨脂代謝異常［26］。因此本研究從細(xì)胞分選及脂代謝組學(xué)相結(jié)合的角度初步探討了DKD小鼠CD4+T脂代謝中的差異，通過PCA、OPLS-DA分析、差異代謝物篩選、KEGG功能注釋及富集分析，完成了組間的區(qū)分和對差異代謝物的篩選，明確了差異代謝產(chǎn)物的數(shù)量和種類［27］。篩選得到的差異代謝物主要參與甘油磷脂代謝途徑，提示磷脂類代謝與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果為以CD4+T細(xì)胞為靶標(biāo)的DKD臨床藥物研發(fā)提供新思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。