楊 明,朱旭東,馬 波,盛夢(mèng)鈺,蔡曉清,李海濤,邵軼群,葉和松

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210017;2.沭陽(yáng)縣中醫(yī)院,江蘇 宿遷 223600;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437)

壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)臨床表現(xiàn)為腹壓增加時(shí)患者出現(xiàn)漏尿癥狀,發(fā)病人群主要為中老年女性。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),SUI影響著50%以上中老年女性的日常生活[1-2]。該疾病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給患者心理和生理造成沉重負(fù)擔(dān)[3-5]。SUI發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,目前認(rèn)為SUI的發(fā)生主要與尿道括約肌解剖結(jié)構(gòu)異常和功能障礙以及尿道周圍的支撐和附屬結(jié)構(gòu)缺陷有關(guān)[6-7]。研究提示,SUI患者盆腔支撐組織中存在線粒體DNA(mtDNA)缺失和重排的累積,且隨著SUI病程的加重而明顯累積[8-9]。同時(shí),線粒體質(zhì)控(MQC)高效運(yùn)行的前提需確保線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整,MQC通過協(xié)調(diào)線粒體動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定性以保障肌肉細(xì)胞的常規(guī)活動(dòng),因而MQC過程中斷是年齡或其他病因所致尿道括約肌功能障礙的潛在機(jī)制[10-11]。mtDNA突變和氧化損傷的累積,促進(jìn)機(jī)體的老化,引起尿道支持結(jié)構(gòu)解剖及功能的異常,最終導(dǎo)致SUI的發(fā)生[12]。大量研究報(bào)道,針刺干預(yù)對(duì)SUI有較好的臨床療效,同時(shí)相關(guān)機(jī)制研究亦是如火如荼開展中[13-15],但鮮有關(guān)于電針調(diào)節(jié)盆底組織線粒體動(dòng)力學(xué)從而治療SUI的作用機(jī)制研究。

課題組根據(jù)江蘇省名中醫(yī)顧兆軍主任創(chuàng)立的小腹三針(氣海、中極、關(guān)元穴)前期開展了大量的臨床和相關(guān)機(jī)制研究。臨床研究發(fā)現(xiàn),小腹三針治療可以協(xié)調(diào)SUI患者膀胱逼尿肌和尿道括約肌功能,提高尿道閉合壓[16-17]。根據(jù)代謝組學(xué)研究[18],推測(cè)電針氣海、中極、關(guān)元穴治療SUI的作用機(jī)制可能在于對(duì)線粒體功能的調(diào)控。為了進(jìn)一步明確電針氣海、中極、關(guān)元穴對(duì)SUI尿道括約肌線粒體功能的影響,擬通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究論證,探討電針改善SUI尿道括約肌病變的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠,雌性,SPF級(jí),重180～220 g,鼠齡6～8周,購(gòu)于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證:SCXK(浙)2019-0002,動(dòng)物飼養(yǎng)及操作按照南京市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定執(zhí)行,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2021-0007,飼養(yǎng)條件為自然光照,溫度25 ℃,相對(duì)濕度70%,上述操作通過該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施,倫理號(hào):QWSY-22144271。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab65354、ab118970);琥珀酸脫氫酶(SDH)ELISA試劑盒(百奧萊博公司,貨號(hào):SNM178);2.5%戊二醛(青島捷世康生物科技有限公司,貨號(hào):RY0404);線粒體分離、膜電位、ATP含量相關(guān)試劑盒(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab110171、ab112150和ab83355);RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab288006、ab102536);一抗:線粒體融合素1(Mfn1)、Mfn2、線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1(Drp1)、線粒體分裂因子(MFF)、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)和β-actin(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab221661、ab205236、ab184247、ab129075、ab110304、ab106814和ab8226);二抗:辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab172730)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:針灸針(型號(hào):0.25 mm×13 mm);電子針療儀(型號(hào):SND-Ⅲ);尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)儀(型號(hào):UDS94,加拿大Laborie公司);微量恒流泵(型號(hào):DP-S100,北京歐世盛科技有限公司);流式分析儀(型號(hào):Cytoflex,美國(guó)Thermo Scientific);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(型號(hào):Multiskan Sky High,美國(guó)Thermo Fisher Scientific);垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號(hào):1658033,美國(guó)BIO-RAD);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào):iBright CL1500,美國(guó)Thermo Fisher Scientific);透射電子顯微鏡(型號(hào):H-7650,日本日立)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠造模與分組:50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、假手術(shù)組、電針組、假針組,每組10只。模型組、電針組、假針組參照LIN等[19]造模標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大鼠陰道擴(kuò)張合并雙側(cè)卵巢切除造模,具體造模步驟:經(jīng)10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉成功后的大鼠,取仰臥位并進(jìn)行固定,向弗萊氏尿管球囊內(nèi)注入4 ml滅菌用水?dāng)U張陰道,導(dǎo)管深度為2～3 cm,行陰道縫合防止導(dǎo)尿管脫落,100 g重物進(jìn)行垂吊牽拉,持續(xù)4 h;第7天對(duì)該組大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除;觀察7 d后開展噴嚏試驗(yàn),鑒別模型效果。假手術(shù)組:麻醉后打開腹腔,游離組織并找到卵巢,但不予摘除,然后縫合腹腔,與模型組給予相同的條件飼養(yǎng)。

1.2.2 干預(yù)方法:電針組選取氣海、中極、關(guān)元穴進(jìn)行電針治療,根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[20]定位。大鼠置于治療固定架上,針灸針(0.25 mm×13 mm)斜刺進(jìn)針3 mm,接電針儀,疏密波,電流強(qiáng)度1～3 mA,頻率2～10 Hz,30 min/次,1次/d,連續(xù)治療14 d,治療期間根據(jù)大鼠狀態(tài)進(jìn)行電流強(qiáng)度和電壓峰值調(diào)整。假針組:針刺氣海、中極、關(guān)元穴對(duì)照點(diǎn)(氣海、中極、關(guān)元穴旁開1 cm),電針條件同電針組。空白組、假手術(shù)組及模型組給予同等條件置于治療固定架,不進(jìn)行任何處理。各組均使用0.9%NaCl溶液進(jìn)行膀胱灌腸測(cè)定充盈性膀胱壓力。治療結(jié)束后取大鼠尿道括約肌組織。

1.2.3 尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè):麻醉成功后的大鼠進(jìn)行操作區(qū)域無(wú)菌消毒,排空大鼠膀胱,0.7 mm輸液導(dǎo)管潤(rùn)滑后插入膀胱,三通連接微量灌注泵(流量:0.3 ml/min)泵入滅菌用水和尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)儀開機(jī)檢測(cè)。記錄漏尿點(diǎn)壓力(Leak point pressure,LPP)、最大膀胱容量(Maximal bladder capacity,MBC)和腹腔漏尿點(diǎn)壓力(Abdominal leak point pressure,ALPP),重復(fù)2次操作,取平均值。

1.2.4 HE染色觀察尿道括約肌形態(tài):干預(yù)結(jié)束后處死大鼠,獲取尿道括約肌組織,部分組織進(jìn)行甲醛固定,制片。根據(jù)HE染色步驟按試劑盒逐步操作,顯微鏡下觀察尿道括約肌病理形態(tài)的改變。

1.2.5 尿道括約肌線粒體功能檢測(cè):干預(yù)結(jié)束后,大鼠麻醉后主動(dòng)脈放血處死,獲取尿道括約肌組織,制備組織勻漿,利用線粒體分離試劑盒提取純化尿道括約肌線粒體,并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)線粒體膜電位(ΔΨm)和ATP水平。

1.2.6 尿道括約肌氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè):取凍存尿道括約肌組織制備組織勻漿,取上清液經(jīng)ELISA試劑盒檢測(cè)SOD、MDA及SDH含量,觀察尿道括約肌的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

1.2.7 尿道括約肌線粒體形態(tài)觀察:尿道括約肌組織經(jīng)歷戊二醛固定、磷酸漂洗、鋨酸固定、脫水、包埋、固化、制片和染色等相關(guān)過程,電鏡觀察線粒體形態(tài)改變。

1.2.8 Western blot檢測(cè)線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白:取尿道括約肌組織制備組織勻漿,RIPA混合裂解液裂解、分離,收集上清液。BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度,主要步驟如下:20 μg蛋白孔上樣,凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離2 h,分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂牛奶封閉、TBST漂洗,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h。顯影,采集圖片并使用Image J對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 空白組和假手術(shù)組大鼠ALPP、LPP、MBC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、假針組和電針組大鼠上述三項(xiàng)指標(biāo)顯著降低(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述三項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠上述三項(xiàng)指標(biāo)水平顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠尿道括約肌組織形態(tài)變化 HE染色結(jié)果見圖1。假手術(shù)組大鼠尿道括約肌肌纖維排列有序、完整,周圍組織排列連續(xù)、致密;模型組肌纖維數(shù)量減少、變薄、排列無(wú)序,周圍組織顯著增多且疏松;假針組與模型組肌纖維及周圍組織形態(tài)無(wú)差異;電針組肌纖維增多、變厚、排列較有序,周圍組織減少,排列較致密,基本恢復(fù)正常。

圖1 各組大鼠尿道括約肌組織病理學(xué)改變(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠尿道括約肌ATP含量及線粒體膜電位比較 空白組與假手術(shù)組大鼠尿道括約肌ATP含量和線粒體膜電位比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、電針組、假針組大鼠上述兩項(xiàng)指標(biāo)顯著降低(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述兩項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠ATP含量及線粒體膜電位顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠尿道括約肌ATP含量及線粒體膜電位比較

2.4 各組大鼠尿道括約肌氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 空白組與假手術(shù)組大鼠尿道括約肌SDH和SOD活性及MDA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、電針組、假針組大鼠SDH和SOD活性顯著降低(均P<0.05),MDA水平顯著升高(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述三項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠SDH和SOD活性顯著升高(均P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠尿道括約肌SDH、SOD和MDA含量比較

2.5 各組大鼠尿道括約肌線粒體超微結(jié)構(gòu)改變 電鏡下各組大鼠尿道括約肌線粒體結(jié)構(gòu)顯示,手術(shù)解剖操作并未對(duì)尿道括約肌線粒體形態(tài)有任何影響,SUI可顯著導(dǎo)致尿道括約肌線粒體形態(tài)腫脹紊亂和部分空泡化。電針氣海、中極、關(guān)元穴可顯著改善SUI尿道括約肌線粒體形態(tài)腫脹紊亂和部分空泡化情況。見圖2。

圖2 各組大鼠尿道括約肌線粒體形態(tài)(×100)

2.6 各組大鼠尿道括約肌線粒體生物發(fā)生信號(hào)分子表達(dá)比較 空白組與假手術(shù)組大鼠尿道括約肌Mfn1、Mfn2、Drp1、MFF、SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、假針組和電針組大鼠Mfn1、Mfn2、SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05),Drp1和MFF蛋白顯著升高(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠尿道括約肌Mfn1、Mfn2、SIRT1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.01),Drp1和MFF蛋白顯著降低(均P<0.01)。見表4(圖3)。

A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:假針組;E:電針組圖3 電針對(duì)SUI環(huán)境下尿道括約肌PGC-1α、SIRT1、Mfn1、Mfn2、Drp1和MFF蛋白表達(dá)的影響

表4 各組大鼠尿道括約肌PGC-1α、SIRT1、Mfn1、Mfn2、Drp1和MFF蛋白表達(dá)比較

3 討 論

在古籍中,并沒有關(guān)于SUI的確切名稱,但從腹壓增大時(shí)出現(xiàn)尿液漏出的癥狀來(lái)看,SUI可歸類為“小便不禁”“遺溺”“膀胱咳”等[21]。SUI多發(fā)生在中老年女性人群,故該病機(jī)多為脾腎不足,肺氣虛弱,膀胱氣化失司,其病位主要在腎、膀胱,與脾肺相關(guān)。顧兆軍教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn),基于“固本培元、溫腎止遺”理論創(chuàng)立小腹三針(氣海、中極和關(guān)元穴)[22]。中極穴下方散布著髂腹下神經(jīng)分支,髂腹下神經(jīng)對(duì)膀胱和直腸有著重要的支配作用,因此,針刺該穴位能夠改善膀胱功能,緩解小便功能障礙[23]。

前期研究結(jié)果提示,針灸治療參與調(diào)控SUI患者線粒體代謝平衡。線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力工廠,是一種雙膜細(xì)胞器,為細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)提供ATP,線粒體功能的平衡對(duì)于肌肉功能的維持尤為重要[24]。首先,肌肉維持節(jié)律性收縮需要線粒體持續(xù)地提供足夠的ATP為其發(fā)揮生理功能;此外,肌肉細(xì)胞根據(jù)外界細(xì)胞因子或信號(hào)刺激迅速調(diào)節(jié)代謝功能狀態(tài),這需要線粒體保持穩(wěn)定的功能[25]。尿道括約肌屬于人體骨骼肌的一部分,其線粒體功能對(duì)肌肉功能的維持具有顯著的影響。但研究表明,骨骼肌損傷后,線粒體自噬通量減少,這會(huì)導(dǎo)致蛋白損傷和細(xì)胞器的累積,誘發(fā)過度炎癥[26]。由此可以推斷,尿道括約肌線粒體功能障礙或許與SUI病變的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

線粒體功能障礙的主要表現(xiàn)之一為線粒體膜電位的破壞,其膜電位的消散一般早于其他凋亡表現(xiàn),標(biāo)志著細(xì)胞凋亡事件的早期啟動(dòng),一旦細(xì)胞開始進(jìn)入凋亡狀態(tài),就會(huì)導(dǎo)致大量的能量損傷,從而促發(fā)線粒體膜電位顯著降低[27]。中醫(yī)藥調(diào)控線粒體功能障礙的研究亦取得顯著臨床療效和機(jī)制研究成果[28]。本次研究結(jié)果顯示,模型組中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)較空白組顯著改善,結(jié)果提示,氧化應(yīng)激啟動(dòng)細(xì)胞凋亡促進(jìn)SUI疾病的發(fā)生。與模型組比較,電針組線粒體膜電位、SDH、SOD活性及MDA水平顯著升高,提示電針能改善SUI環(huán)境下尿道括約肌細(xì)胞的線粒體功能障礙,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激,抑制細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果提示,SUI環(huán)境下尿道括約肌細(xì)胞的線粒體功能障礙,促進(jìn)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡啟動(dòng),而電針可部分逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。

線粒體動(dòng)力學(xué)主要的調(diào)控因子包括Mfn1、Mfn2、Drp1、MFF、SIRT1和PGC-1α等,上述調(diào)控因子共同調(diào)控線粒體的分裂和融合,進(jìn)而調(diào)控線粒體功能和形態(tài)的改變[29]。本研究通過電鏡觀察尿道括約肌線粒體微觀結(jié)構(gòu)改變,手術(shù)解剖并未對(duì)線粒體形態(tài)有明顯影響,而SUI模型中線粒體形態(tài)腫脹嚴(yán)重,線粒體內(nèi)間隙顯著增寬、嵴走向明顯不規(guī)則,PGC-1α和Mfn1、Mfn2和SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低,而Drp1和MFF蛋白表達(dá)顯著升高;電針組線粒體腫脹程度顯著改善,線粒體內(nèi)間隙增寬、嵴走向不規(guī)則情況顯著降低,模型組上述6種蛋白的表達(dá)得到部分逆轉(zhuǎn);上述研究結(jié)果提示,電針可改善SUI環(huán)境下尿道括約肌細(xì)胞的線粒體形態(tài)的病理學(xué)改變與功能損傷。

綜上所述,SUI可導(dǎo)致尿道括約肌細(xì)胞的線粒體形態(tài)的病理學(xué)改變與功能損傷。電針可通過改善SUI尿道括約肌線粒體功能和形態(tài)的相關(guān)表達(dá)因子和蛋白,從而改善線粒體的形態(tài)與功能障礙,進(jìn)而改善SUI尿道括約肌病變。