劉龍江，劉瀟雨，程天印，段德勇，吳平順*

(1. 甘肅省迭部縣動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 迭部 747400；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

刻點血蜱(Haemaphysalispunctata)屬于硬蜱科、血蜱屬，常寄生于牛、馬、羊等家畜，廣泛分布于英國、美國、西班牙、意大利、以色列等國[1]，在我國其主要分布于新疆地區(qū)[2]。已有研究表明，刻點血蜱可傳播大巴貝斯蟲(Babesiamajor)、莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)、雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)、伯納特氏立克次氏體(Rickettsiaburneti)、斑點熱群立克次體(Spotted fever group rickettsiae)、羊泰勒蟲(Theileriasp.)等病原體[2-3]。由于雌、雄蜱生活習(xí)性、生活周期、吸血特性的不同，常導(dǎo)致由致病菌、共生菌組成的蜱菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)不同[4]，如Choubdar等[5]證實小亞璃眼蜱(Hyalommaanatolicum)雌蜱中腸菌群多樣性高于雄蜱；Kim等[6]發(fā)現(xiàn)不同性別長角血蜱(H.longicornis)體內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，其雌蜱體內(nèi)的柯克斯氏體共生菌(Coxiellaendosymbiont)相對豐度高于雄蜱。因此，了解不同性別蜱中腸菌群結(jié)構(gòu)及差異對防控蜱和蜱傳病意義重大。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們對不同蜱種的不同發(fā)育階段、不同組織器官、不同地域來源、不同飽血狀態(tài)中腸菌群結(jié)構(gòu)進行了大量研究[7-10]。Portillo等[11]利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，對來源于西班牙拉里奧哈地區(qū)不同性別刻點血蜱的中腸菌群結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)在雌、雄刻點血蜱中變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌門，埃立克體屬(Ehrlichia)為優(yōu)勢菌屬，宮本疏螺旋體(Borreliamiyamotoi)為優(yōu)勢菌種，且立克次體屬(Rickettsia)在雌蜱中腸內(nèi)的相對豐度高于雄蜱，埃立克體屬、沃爾巴克氏體屬(Wolbachia)在雄蜱中腸內(nèi)的含量高于雌蜱。但有研究證實，地域及宿主不同將影響蜱菌群結(jié)構(gòu)的組成[12-13]。因此，本研究運用Illiumina NovaSeq高通量測序技術(shù)對采自于我國新疆地區(qū)綿羊體表的不同性別刻點血蜱中腸菌群結(jié)構(gòu)進行分析，探究其特征和差異，為蜱和蜱傳病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

帶Barcode的細菌16S rDNA V3-V4區(qū)擴增引物，341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。DNA片段快速純化/回收試劑盒購自Qiagen公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京)；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix、NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit均購自New England Biolabs公司。

1.2 刻點血蜱樣本

20只飽血刻點血蜱雌蜱和30只刻點血蜱雄蜱采自于新疆沙灣市綿羊體表，并送至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院寄生蟲與媒介中心保存。

1.3 細菌DNA提取

取雌蜱5只、雄蜱10只，75%酒精對蟲體表面進行消毒，無菌水沖洗，去除體表雜質(zhì)。在超凈工作臺中用滅菌眼科剪沿蜱腹部剪開體壁，將雌蜱、雄蜱中腸內(nèi)容物分別收集至2個含有1 mL 3.8% 檸檬酸鈉無菌生理鹽水溶液的滅菌離心管中，800 r/min離心10 min；取上清液，12 000 r/min離心1 min；棄去上清液，將雌蜱和雄蜱中腸內(nèi)容物沉淀物分別編號為Hp.F和Hp.M。按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取各樣品細菌基因組DNA。

1.4 16S rDNA基因擴增及高通量測序

以雌、雄蜱中腸細菌總DNA為模板，以341F和806R為擴增引物擴增細菌16S rDNA V3-V4區(qū)。反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板1 μL，Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各2 μL，ddH2O 20 μL。擴增條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。將擴增片段經(jīng)NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit修飾、加測序接頭，并用Qubit@2.0 Fluorometer定量和qPCR檢測合格后，運用Illiumina NovaSeq平臺進行雙末端測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V1.2.11, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)軟件[14]對樣本的reads進行拼接，得到Raw Tags。隨后使用fastp軟件對Raw Tags進行質(zhì)控，得到Clean Tags。最后使用Vsearch軟件將Clean Tags與數(shù)據(jù)庫進行比對以檢測嵌合體并進行去除[15]，得到Effective Tags。

1.6 擴增子序列變異(ASVs)降噪和物種注釋

對以上得到的Effective Tags，使用QIIME2軟件中的DADA2模塊進行降噪，并過濾掉豐度小于5的序列[16]，獲得ASVs以及特征表。隨后，使用QIIME2軟件中的classify-sklearn[17-18]模塊將ASVs與數(shù)據(jù)庫比對，得到每個ASV的物種信息，并分別在不同分類水平上統(tǒng)計2個樣本的群落組成，以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標準進行均一化處理，進行Alpha 多樣性分析。

1.7 Alpha多樣性分析

使用QIIME2軟件計算Observed otus(直觀觀測到的物種數(shù)目)，Shannon(樣品中的分類總數(shù)及其占比)，Simpson(表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度)，Chao1(估計群落樣品中包含的物種總數(shù))，Goods coverage(覆蓋度)和Pielou_e(均勻度)指數(shù)，并繪制稀釋曲線。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理和ASVs統(tǒng)計

經(jīng)測序雌蜱樣本(Hp.F)獲得原始序列106 252條，雄蜱樣本(Hp.M)獲得原始序列114 803條。經(jīng)過質(zhì)控和去除嵌合體后，Hp.F和Hp.M 2組樣本獲得的有效序列分別為87 395條和98 740條，數(shù)據(jù)有效率分別達到82.3%和86.1%。將有效序列進行降噪后，Hp.F、Hp.M獲得的ASVs數(shù)分別為523和415個，其中219個為2個樣本所共有(圖1)。

圖1 刻點血蜱2個腸內(nèi)容樣本ASVs分布韋恩圖

2.2 細菌在門水平上的分布

獲得的ASVs 經(jīng)物種注釋后，在門水平上，Hp.F和Hp.M中共發(fā)現(xiàn)11個門，每個細菌門在2組樣品中的相對豐度見表1。從表1中可見，Hp.F與Hp.M中含有的共有菌門為8個，包括：變形菌門，厚壁菌門(Firmicutes)，異常球菌門(Deinococcota)，擬桿菌門(Bacteroid-ota)，放線菌門(Actinobacteriota)，藍細菌門(Cyanobacteria)，脫硫菌門(Desulfobacterota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)，其中變形菌門的相對豐度最高，且在Hp.M內(nèi)的含量(81.1%)高于Hp.F(65.2%)，為2組樣本的優(yōu)勢菌門；厚壁菌門、異常球菌門(Deinococcota)、擬桿菌門在Hp.F中的相對豐度(16.9%、10.5%、4.7%)高于Hp.M(13.0%、0.2%、2.3%)；放線菌門在Hp.M中的相對豐度(2.4%)高于Hp.F(1.1%)。除共有菌門外，彎曲菌門(Campilobacter-ota)和螺旋體門(Spirochaetota)為Hp.F特有菌門；梭桿菌門(Fusobacteriota)為Hp.M獨有菌門。

表1 2組樣品在門水平上的物種相對豐度

2.3 細菌在屬水平上的分布

Hp.F和Hp.M 2組樣本共檢測到189個細菌屬，其中共有菌屬為119個，相對豐度前10的共有細菌屬在2組樣本中的分布特點見圖2，前50除前10 之外的其余40種共有細菌屬相對豐度見表2。從圖2可見，2組樣本中相對豐度較高的細菌屬主要為Schlegelella屬，不動桿菌屬(Acinetobacter)，擬桿菌屬(Bacteroides)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，短波單胞菌屬(Brevundimonas)和羅姆布茨菌屬(Romboutsia)等，且以上菌屬在Hp.F中的相對豐度均高于Hp.M。除上述豐度較高的菌屬外，在2組樣本中均檢測到了柯克斯體屬(Coxiella)，立克次體屬(Rickettsia)，寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，泛菌屬(Pantoea)，腸桿菌屬(Enterobacter)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)等相對豐度較低的共生菌和致病菌屬。另外，Hp.F內(nèi)特有菌屬39種，其中相對豐度較高的菌屬有：八疊球菌屬(Sarcina)，螺桿菌屬(Helicobacter)，RikenellaceaeRC9gutgroup屬，Quinella屬，PrevotellaceaeUCG-003屬和小桿菌屬(Dialister)等；Hp.M內(nèi)特有菌屬31種，其中相對豐度較高菌屬包括：CAG-352菌屬，巨單胞菌屬(Megamonas)，勞森菌屬(Lawsonia)，細桿菌屬(Microbacterium)，Rubellimicrobium屬和土地芽胞桿菌屬(Terribacillus)等，這表明雌、雄蜱中腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上存在較大差異。

表2 前50中40個共有菌屬(前10除外)的相對豐度

圖2 Hp.F(A)和Hp.M(B)樣品前10共有菌屬的相對豐度

2.4 細菌在種水平上的分布

注釋到種水平且Hp.F和Hp.M 2個樣本中共有的菌種有28個，各菌種相對豐度見表3。相對豐度較高的菌種包括：西爾瓦諾斯亞棲熱菌(Meiothermussilvanus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、柯克斯氏體共生菌(Coxiellaendosymbiont)、腸乳桿菌(Lactobacillusintestinalis)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、巴氏桿菌擬桿菌(B.barnesiae)等。除以上共有菌種外，2個樣本中還分別存在獨有菌種，如雙環(huán)瘤胃球菌(Ruminococcusbicirculans)、多氏擬桿菌(B.dorei)、糞便乳桿菌(Lactobacillusfaecis)、Butyricicoccussp.、Paenibacillusdarwinianus、Dialisterinvisus等僅在Hp.F被檢測到；類芽胞桿菌(Paenibacilluspasadenensis)、單形擬桿菌(B.uniformis)、馬葡萄球菌(S.equorum)、普通擬桿菌(B.vulgatus)、糞便擬桿菌(B.stercoris)、產(chǎn)黑素普氏菌(Prevotellamelaninogenica)等僅在Hp.M中被檢測到。

表3 2組樣品在種水平上的物種相對豐度

2.5 Alpha多樣性分析

對Hp.F和Hp.M 2個樣本的Alpha 多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果表明(表4)：2個樣本的Goods coverage均為1即100%，表明本研究的測序覆蓋率高，測序結(jié)果具有高精確性、高有效性和高可信度。Hp.F的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均大于Hp.M，表明雌蜱菌群多樣性大于雄蜱。

表4 樣品的Alpha多樣性分析指數(shù)

3 討論

本研究利用Illumina NovaSeq高通量測序技術(shù)，對刻點血蜱雌、雄蜱中腸菌群結(jié)構(gòu)進行了分析，發(fā)現(xiàn)2組樣本菌群結(jié)構(gòu)之間存在顯著差異，共鑒定到11個細菌門、189個細菌屬、28個細菌種。在門水平上，變形菌門為刻點血蜱雌、雄蜱中腸內(nèi)的優(yōu)勢菌門，這與微小扇頭蜱[10]、長角血蜱[19]、褐黃血蜱(H.flava)[20]的研究結(jié)果相一致。Portillo等[11]發(fā)現(xiàn)雌、雄刻點血蜱在屬水平上存在明顯差異，這與本研究的部分研究結(jié)果相一致，如本研究中的立克次體屬在刻點血蜱雌蜱體內(nèi)的相對豐度遠高于雄蜱。而立克次體屬中諸多菌種作為蜱傳病原，已在不同地域的革蜱屬(Dermacentor)、血蜱屬(Haemaphysalis)、硬蜱屬(Ixodes)、扇頭蜱屬(Rhipicephalus)、璃眼蜱屬(Hyalomma)等蜱中被相繼檢測到[21-22]。本研究中雌、雄刻點血蜱中腸內(nèi)均檢測到該菌屬，說明不同性別刻點血蜱可攜帶立克次體，但由于高通量測序技術(shù)的局限性，未能將該菌屬鑒定到種水平。

不動桿菌屬為革蘭陰性菌，已被正式命名的菌種達38個，其中大部分為非致病菌，常分布于潮濕的土壤和水域中；少部分菌種為條件性致病菌，可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等的感染[23]。該菌屬已在長角血蜱雌蜱中被檢測到，且為優(yōu)勢菌屬[24]，這與本研究結(jié)果相一致。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)刻點血蜱雌蜱中腸內(nèi)的不動桿菌屬相對豐度(8.1%)高于雄蜱(1.3%)。有研究表明[25]，不動桿菌廣泛存在于土壤中，其在蜱體內(nèi)的出現(xiàn)通常是由于蜱長時間暴露于宿主體表所致，這與雌蜱寄生在宿主體表至飽血的時間遠大于雄蜱的生活習(xí)性相一致。

鞘氨醇單胞菌屬為好氧型革蘭陰性桿菌，包括103余種菌種，廣泛分布于各種水體、沉積物和土壤中，對重金屬環(huán)境的生物修復(fù)與多環(huán)芳烴的生物降解具有一定作用[26]。少動鞘氨醇單胞菌(S.paucimobilis)是一種條件致病菌，由其污染的水體或土壤可引發(fā)社區(qū)及醫(yī)院內(nèi)感染，常引起關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、敗血癥及局部化膿性潰瘍等病癥，該菌種已在西方蜜蜂(Apismellifera)體內(nèi)被檢測到[27]。本研究雖未檢測到少動鞘氨醇單胞菌，但發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬在刻點血蜱雌、雄蜱中腸內(nèi)均存在，說明刻點血蜱可攜帶該菌屬，這與在微形血蜱(H.wellingtoni)、豪豬血蜱(H.hystricis)、二棘血蜱(H.bispinosa)中的發(fā)現(xiàn)相一致[28]。

與Portillo等[11]未檢測到葡萄球菌屬的研究結(jié)果不同，本研究在雌、雄刻點血蜱中皆檢測到了葡萄球菌屬，且其在雄蜱中腸內(nèi)的相對豐度高于雌蜱。葡萄球菌屬中的菌種多為條件性致病菌，是臨床上最常見的革蘭陽性菌，其中金黃色葡萄球菌(S.aureus)是一種能引起肺炎、菌血癥等多種感染性疾病的化膿性病原菌[29]，且已在黃粉蟲(Tenebriomolitor)[30]，黑水虻(Hermetiaillucens)[31]，大蠟螟(Galleriamellonella)[32]等昆蟲體內(nèi)被檢測到。本試驗檢測出的葡萄球菌為馬葡萄球菌，且該菌種只在刻點血蜱雄蜱中存在，該菌種同樣被報道在微小扇頭蜱(R.microplus)和一些血蜱屬、璃眼蜱屬蜱體內(nèi)存在[33]。

本研究將刻點血蜱雌、雄蜱中腸內(nèi)的柯克斯體屬注釋為柯克斯氏體共生菌，且雌蜱中腸內(nèi)的相對豐度大于雄蜱?？驴怂故象w共生菌已在微小扇頭蜱[34]，Amblyommanuttalli[35]，Ornithodorosmaritimus，邊緣革蜱(D.marginatus)和六角硬蜱(I.hexagonus)[36]等蜱種體內(nèi)被檢測到。有研究表明[37-38]，蜱在寄生吸血過程中，由于進食條件不平衡，導(dǎo)致其體內(nèi)缺乏部分必需營養(yǎng)元素，如B族維生素，而柯克斯氏體共生菌正好可為蜱提供 B族維生素，從而促進蜱的生長發(fā)育，發(fā)揮互利共生的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，柯克斯氏體共生菌在刻點血蜱雌蜱中的含量遠高于雄蜱，可能是由于雌蜱生長發(fā)育速度較雄蜱快，且與雌蜱在新陳代謝、生理活動時物質(zhì)消耗量高于雄蜱有關(guān)[39]。

綜上，通過對比不同性別刻點血蜱中腸菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其在門、屬、種水平上存在較大差異，這可能與雌、雄蜱吸血及生理特性不同有關(guān)。