鄭美麗 ，陳少康 ，孫建華 ，李 爽 ，郭 峰 ，王曉鳳

（1.北京市畜牧總站，北京 100107；2.北京市通州區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 101199）

內(nèi)皮特異性分子1（endothelialspecf ic molecule-1，ESM-1），最初是由Lassalle等發(fā)現(xiàn)的。 Bechard證實(shí)了ESM-1是作為一種可溶性的蛋白多糖-硫酸軟骨素分泌至血液中，又稱為Endocan。早期文獻(xiàn)報(bào)道了ESM-1基因的結(jié)構(gòu)與類胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白達(dá)到32%相同和55.3%相似，尤其是該基因N端結(jié)構(gòu)與IGFBP家族高度同源。而IGFBP家族作為IGF家族的構(gòu)成，已經(jīng)有多個(gè)成員被證明與機(jī)體的生長發(fā)育密切相關(guān)。筆者對(duì)ESM-1基因的結(jié)構(gòu)以及在不同豬種中的遺傳特性進(jìn)行了初步探究，以期為深入了解和研究ESM-1基因的結(jié)構(gòu)和功能，將該基因作為影響豬肌肉生長發(fā)育的關(guān)鍵基因的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

從實(shí)驗(yàn)室群體樣本中選取了三個(gè)國外代表性豬種（大白、長白、杜洛克），中國野豬（東北野豬）和中國地方豬種（二花臉、上高豬、民豬、內(nèi)江豬、香豬）5個(gè)代表性豬種，每個(gè)豬種選取的個(gè)數(shù)如表1，試驗(yàn)樣本為肌肉組織。

表1 樣品選取個(gè)數(shù)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ESM-1基因的完整mRNA序列的獲得

基于NCBI預(yù)測的ESM-1基因的CDS區(qū)序列，通過PCR和RACE試驗(yàn)獲得ESM-1基因的完整mRNA序列。試驗(yàn)中所用到的引物序列如表2。

表2 引物序列

1.2.2 外顯子SNPs的檢測

以克隆測序得到的ESM-1基因的mRNA序列為模板，利用軟件primer5.0設(shè)計(jì)引物如表3，引物位置編碼按照以CDS區(qū)的ATG為0，到TGA結(jié)束為552 bp，ATG之前為“-”TGA后為“+”。

表3 引物序列

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 豬ESM-1 基因的克隆

2.1.1 CDS區(qū)的克隆測序

根據(jù)NCBI上可查的豬ESM-1基因的預(yù)測CDS區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一明亮條帶，如圖1。將產(chǎn)物回收純化并連接轉(zhuǎn)化后，測序并將所得到的無載體序列與NCBI上序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得了豬ESM-1基因的CDS區(qū)準(zhǔn)確序列552 bp。

圖1 豬ESM-1 基因CDS 區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物

2.1.2 mRNA的克隆測序

利用RACE技術(shù)并結(jié)合試劑盒中的巢式引物獲得無載體序列的5'UTR和3'UTR序列，分別為439 bp和1 447 bp，如圖2。經(jīng)克隆測序及比對(duì)分析，確定為豬ESM-1基因的5'及3'UTR區(qū)域。結(jié)合前面試驗(yàn)得到的CDS區(qū)序列，經(jīng)DNAMAN及ChromaPro拼接，形成全長2 437 bp的豬ESM-1基因的mRNA序列。在NCBI上將所得序列與豬的基因組信息進(jìn)行了比對(duì)，序列全部符合，并且內(nèi)含子邊界符合“ GT-AG”法則。

圖2 豬ESM-1 基因5'RACE（左）及 3'RACE（右）擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 外顯子SNPs 的檢測

用3 中的7 對(duì)引物擴(kuò)增，以NCBI上公布的豬基因組序列為野生型，經(jīng)測序比對(duì)，在編碼區(qū)和外顯子發(fā)現(xiàn)了SNP位點(diǎn)，檢測到的SNP位點(diǎn)如表4。進(jìn)一步增加樣本數(shù)量，進(jìn)行群體驗(yàn)證，并通過酶切PCR產(chǎn)物，部分瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3，發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)SNP位點(diǎn)在不同豬種之間沒有顯著性突變差異，其CDS區(qū)無有意義突變。具體基因型及基因頻率如表5。

圖3 部分PCR 產(chǎn)物酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖

表4 檢測到的突變信息

表5 各基因型及基因頻率（1）第一外顯子第8 位堿基突變位點(diǎn)

3 討論與分析

目前豬的ESM-1基因在NCBI上只有預(yù)測的CDS區(qū)序列，而在本研究中，筆者利用了RACE技術(shù)，首次得到了豬ESM-1基因的完整mRNA序列，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所得到的序列全部符合，進(jìn)一步分析該基因的結(jié)構(gòu)，可知豬ESM-1基因由三個(gè)外顯子組成，CDS區(qū)為552 bp，5'UTR和3'UTR序列，分別為439 bp和1 447 bp，如圖4。

圖4 豬ESM-1 基因mRNA 的結(jié)構(gòu)示意圖

筆者針對(duì)基因的三個(gè)外顯子進(jìn)一步做了遺傳多態(tài)性分析，希望為該基因的功能研究提供一定的分子基礎(chǔ)。單核苷酸的多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。在基因組的DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上。據(jù)目前研究可知，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（coding SNP，cSNP）比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅僅是周圍序列的1/5，但它在遺傳學(xué)方面的研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。另一方面，從對(duì)生物的遺傳性狀影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP（synonymous cSN），即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。

雖然ESM-1基因在人和小鼠上的研究比較多，但目前針對(duì)ESM-1基因的遺傳多態(tài)性研究幾乎為空白，NCBI的數(shù)據(jù)庫中也未查到相關(guān)記錄。而筆者第一次針對(duì)豬的ESM-1基因進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，并在外顯子上發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)堿基突變位點(diǎn)。筆者根據(jù)1986年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所張仲葛主持編寫的《中國豬品種志》，從中國六大地方豬（華北型、華中型、華南型、江海型、西南型、高原型）中盡量選取了代表性豬種，同時(shí)也選取東北野豬作為中國野豬的代表，大白、長白和杜洛克三種國外代表性豬種，對(duì)ESM-1基因在不同豬種中的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，試驗(yàn)檢測到的兩個(gè)突變位點(diǎn)分別位于5'UTR和CDS區(qū)上，但對(duì)后者分析，其突變并不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的改變，為同義突變，因此認(rèn)為豬ESM-1基因的CDS區(qū)具有較高的保守型，最后通過對(duì)兩個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行群體驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩處突變都沒有明顯的品種間差異。

4 研究進(jìn)展與展望

ESM-1是作為一種可溶性的蛋白多糖-硫酸軟骨素分泌至血液中，又稱為Endocan。ESM-1由單一基因編碼，定位在人的第5號(hào)常染色體上，mRNA全長2 090 bp，共由3個(gè)外顯子組成。其中外顯子2編碼一個(gè)富含基因F（113FPFFQY I 18）結(jié)構(gòu)的特殊區(qū)域，該區(qū)域可能是ESM-1基因的功能區(qū)域。最大的外顯子3編碼ESM-1蛋白C端33個(gè)氨基酸區(qū)域，該區(qū)域含有提前終止密碼子和137位Ser O糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)以共價(jià)鍵的形式連接一條黏多糖單鏈，也稱GAG鏈或DS單鏈，該黏多糖單鏈與ESM-1的多種生物學(xué)功能緊密相關(guān)。目前的研究表明，ESM-1基因的mRNA能編碼兩種不同的蛋白，如圖5。一種是ESM-1，該蛋白是一種相對(duì)分子質(zhì)量為50×1 000的可溶性蛋白聚糖，是一條成熟的包含165氨基酸的核心蛋白，包含一個(gè)F113和F116的苯丙氨酸富集區(qū)，以及以共價(jià)鍵的形式連接在第137絲氨酸殘基上的一條黏多糖單鏈。

圖5 豬ESM-1 基因mRNA 的結(jié)構(gòu)示意圖

ESM-1基因目前的研究主要集中人和鼠上。首先早期試驗(yàn)證明該基因有助于血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，并在內(nèi)皮細(xì)胞依賴性病理過程中起一定的作用。Mark Aitkenhead等發(fā)現(xiàn)ESM-1基因在血管生成過程中發(fā)揮著重要的作用。一些涉及生長和血管生成的因子已經(jīng)顯示對(duì)ESM-1基因的表達(dá)有影響，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道指出肝細(xì)胞生長因子（HGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）共同作用會(huì)導(dǎo)致該基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)上調(diào)。有研究證明HHEX對(duì)血管的增生以及塑形都有著重大的作用，HHEX能通過減少血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor-1，VEGFR）如VEGFR-1、VEGFR-2等和血管生成相關(guān)的一些重要因子的表達(dá)來參與血管生成的調(diào)節(jié)，而研究者同時(shí)發(fā)現(xiàn)同源異形框因子（HHEX）可通過一個(gè)高度保守的HHEX反應(yīng)元件直接抑制ESM-1的表達(dá)。那么，HHEX 對(duì)VEGFR-1和VEGFR-2等血管增生中重要因素的抑制作用是否與其直接抑制ESM-1的表達(dá)有關(guān)，這還有待進(jìn)一步研究。

也有相關(guān)文獻(xiàn)指出ESM-1基因與胰島素樣生長因子相關(guān)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。在文獻(xiàn)中Philippe Lassalle等指出，該基因的N端與類胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白達(dá)到32%相同和55.3%相似。而IGFs生長因子在血清，細(xì)胞外液及細(xì)胞培養(yǎng)液中都與特異性的結(jié)合蛋白（Binding Proteins，BPs）結(jié)合以無活性的復(fù)合物形式存在，具有延長循環(huán)水平的IGFs半衰期和穩(wěn)定IGFs血清濃度的作用，因此進(jìn)一步推測ESM-1基因?qū)ιw的生長發(fā)育有影響。

最后ESM-1研究比較多的一方面即其與各種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。一些腫瘤如腎、乳腺、子宮以及直腸等腫瘤組織中存在內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子（ESM-1）表達(dá)的上調(diào)，ESM-1基因在腫瘤血管生產(chǎn)和腫瘤生長過程中發(fā)揮著重要作用。該基因能通過腫瘤相關(guān)性的炎癥、血管增生、淋巴管增生、腫瘤細(xì)胞本身等方面對(duì)腫瘤進(jìn)行調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)探究了ESM-1基因在肝癌發(fā)生中，影響腫瘤細(xì)胞的存活、遷移和遷徙。而腫瘤的產(chǎn)生本身就是一種細(xì)胞的異常增生現(xiàn)象，這也進(jìn)一步證明ESM-1基因?qū)?xì)胞的生長具有重要的作用。Grigoriu 等的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清中的ESM-1濃度，不僅與腫瘤的類型、分期和患者的預(yù)后、腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，更能在一定程度上指導(dǎo)肺癌的治療。同樣，Leroy 等發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌患者血清中，ESM-1的濃度可作為腎透明細(xì)胞癌患者術(shù)后治療和抗血管增生治療的一個(gè)有效監(jiān)測指標(biāo)。在諸如肺癌、乳腺癌、子宮癌、腎癌、涎腺腺樣囊性癌、肝癌、腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等許多人體實(shí)體腫瘤中ESM-1都高表達(dá)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該因子的高表達(dá)與腫瘤的預(yù)后、轉(zhuǎn)移、血管增生等因素有關(guān)。ESM-1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素（如慢性炎癥、腫瘤細(xì)胞本身、血管增生、淋巴管增生等）都有著重要的關(guān)聯(lián)。如果能有效地抑制ESM-1的表達(dá)，就有可能從多方面對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行抑制。因此，開發(fā)針對(duì)ESM-1的靶向治療藥物有可能開拓腫瘤治療的一個(gè)新篇章。

目前，對(duì)于ESM-1基因表達(dá)的研究還處于資料積累的階段，關(guān)于其對(duì)家畜尤其是豬的肌肉生長影響的研究還較少，該基因是否可以調(diào)控豬的肌肉生長發(fā)育，影響豬的生產(chǎn)性狀，仍需進(jìn)一步研究。