馬書恒 繆林坪 陳荻秋 韓麗 張富凱 賀氣志

收稿日期：2023-09-11；修回日期：2023-09-27。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82100040）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（湘教通〔2022〕323號-22B0899）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（湘教通〔2021〕197號-3905）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)支持領(lǐng)域項(xiàng)目（湘教通〔2023〕237號-38）；長沙醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（長醫(yī)教〔2023〕51號-108）。

作者簡介：#表示為共同第一作者。

* 通信作者：賀氣志，副教授，主要從事中醫(yī)藥抗感染的相關(guān)研究及生物傳感器設(shè)計(jì)。E-mail： 314190831@qq.com。

摘 要：為研究隱丹參酮（cryptotanshinone）對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的生長和生物膜形成的影響及其機(jī)制，采用微量稀釋法測定隱丹參酮對銅綠假單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC），利用結(jié)晶紫染色法、倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響，再采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測隱丹參酮對銅綠假單胞菌生物膜形成相關(guān)基因LasI、LasR、RhlI和RhlR的表達(dá)的影響。隱丹參酮對銅綠假單胞菌的MIC為800.0 μg/mL；結(jié)晶紫染色后，隱丹參酮的質(zhì)量濃度為800.0 μg/mL時(shí)抑制菌膜效果最佳，且呈劑量依賴性（P<0.01）；利用激光共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對生物膜的形成和分布，200.0 μg/mL時(shí)抑菌效果顯著提升。在200.0～800.0 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，800.0 μg/mL的隱丹參酮對LasI、LasR、RhlI和RhlR基因的表達(dá)具有抑制作用（P<0.01）。隱丹參酮抑制銅綠假單胞菌生物膜形成機(jī)制可能是通過下調(diào)LasI等基因的表達(dá)。本研究表明，隱丹參酮可以作為群體感應(yīng)抑制劑干預(yù)銅綠假單胞菌的耐藥，為臨床多重耐藥銅綠假單胞菌（MDR-PA）的治療提供參考。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌；生物膜；隱丹參酮；群感系統(tǒng)；耐藥性

中圖分類號：R378.99+1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.01.011

Inhibitory Effect of Cryptotanshinone on Biofilm Formation of Pseudomonas aeruginosa

MA Shuheng1a#， MIAO Linping1b#， CHEN Diqiu1a， HAN Li1b， 2， ZHANG Fukai1b， HE Qizhi1b， 2*

（1. Changsha Medical University a. The First Clinical College， b. School of Basic Medical Science， Changsha 410219， China;

2. Hunan Provincial Key Laboratory of the Research and Development of Novel Pharmaceutical Preparations， Changsha 410219， China）

Abstract： To investigate the effects of cryptotanshinone on the growth and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and its mechanism， the minimum inhibitory concentration （MIC） of cryptotanshinone on P. aeruginosa was determined by microdilution， and the effect of cryptotanshinone on? P. aeruginosa biofilm formation was observed by crystal violet staining， inverted microscope and laser scanning confocal microscope， and the effect of cryptotanshinone on P. aeruginosa biofilm formation was measured by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The effect of cryptotanshinone on the expression of genes related to P. aeruginosa biofilm formation was detected by RT-qPCR. The MIC of cryptotanshinone on P. aeruginosa was 800.0 μg/mL; after crystal violet staining， the best inhibition of biofilm was observed at the mass concentration of cryptotanshinone of 800.0 μg/mL in a dose-dependent manner （P<0.01）. The formation and distribution of biofilm by cryptotanshinone were observed by confocal laser microscopy， and the inhibition effect was significantly enhanced at 200.0 μg/mL. In the range of 200.0～800.0 μg/mL mass concentration， cryptotanshinone at 800.0 μg/mL mass concentration inhibited the expression of LasI， LasR， RhlI and RhlR genes （P<0.01）. The mechanism of cryptotanshinone inhibition of? P. aeruginosa biofilm formation may be through the down-regulation of LasI and other genes expression. The present study suggests that cryptotanshinone can be used as a group-sensing inhibitor to intervene in the drug resistance of P. aeruginosa， which can provide a reference for the treatment of multi-drug-resistant P. aeruginosa （MDR-PA） in the clinic.

Key words： Pseudomonas aeruginosa; biofilm; cryptotanshinone; quorum sensing; drug resistance

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（1）： 090-096）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是常見的條件致病菌，是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染和呼吸及相關(guān)性肺炎的主要原因，在囊性纖維化病人和免疫缺陷個(gè)體中引起的發(fā)病率和死亡率較高。PA對多種抗生素具有耐藥性，包括氨基糖苷類（aminoglycosides）、喹諾酮類（quinolones）和β-內(nèi)酰胺類（β-lactams）。PA產(chǎn)生多重耐藥性的原因主要是其具有多種內(nèi)生性、獲得性和適應(yīng)性抗生素耐藥機(jī)制。其中，生物膜介導(dǎo)的適應(yīng)性耐藥可以產(chǎn)生多重耐藥持久細(xì)胞，阻止抗生素治療靶點(diǎn)的合成，從而形成多重耐藥性［1-3］。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)是細(xì)菌之間通過自誘導(dǎo)信號分子進(jìn)行交流的信號通路，其通過監(jiān)測細(xì)菌密度和調(diào)控細(xì)菌行為調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜形成。PA的群感系統(tǒng)分別有Las、Rhl、PQS和IQS 4個(gè)系統(tǒng)，Las和Rhl系統(tǒng)是PA主要的2個(gè)QS系統(tǒng)。Las和Rhl系統(tǒng)都受到N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactone，AHL）自誘導(dǎo)信號分子調(diào)節(jié)，LasR和RhlR基因決定生成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，LasI和RhlI基因決定生成合成酶，產(chǎn)生AHL同系物3OC12-HSL和C4-HSL自誘導(dǎo)信號分子。隨著細(xì)菌密度的不斷增大，自誘導(dǎo)信號分子達(dá)到一定閾值，LasR和RhlR分別與3OC12-HSL和C4-HSL結(jié)合，Las和Rhl系統(tǒng)被激活，調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜的形成［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)可造成細(xì)胞凋亡從而破壞腸上皮屏障［6］。

隱丹參酮（cryptotanshinone）是一種二萜醌類化合物（圖 1），提取自植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge），具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用，同時(shí)還具有對人體毒副作用小的特點(diǎn)［7-8］。此外，隱丹參酮還可以抑制銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等浮游細(xì)菌 ［9-10］ 的生長。然而，對于隱丹參酮對生物膜抑制作用機(jī)制的研究還很缺乏。因此，我們假設(shè)隱丹參酮可能通過抑制Las和Rhl系統(tǒng)的表達(dá)抑制PA生物膜的形成。本研究采用體外觀察的方法檢測隱丹參酮對PA生物膜形成的抑制作用，為PA感染的治療和耐藥性的研究提供依據(jù)。

圖1 隱丹參酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig. 1 The chemical structure of cryptotanshinone

1 材料與方法

1.1 材料

隱丹參酮、1%結(jié)晶紫溶液購于北京索萊寶科技有限公司；甲醇購于北京蘭博康斯科技有限公司；PA為臨床分離菌，由長沙醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供；12孔板、96孔板、溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基、UNlQ-10柱式總RNA分離試劑盒等購于生工生物工程（上海）股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 隱丹參酮對PA最小抑菌濃度的測定

活化的PA接種至液體LB培養(yǎng)基，37℃搖床過夜培養(yǎng)8 h，取對數(shù)生長期的菌液，使用液體LB培養(yǎng)基稀釋至1.5×108 CFU/mL菌懸液備用。使用液體LB培養(yǎng)基將隱丹參酮稀釋至質(zhì)量濃度為0～800.0 μg/mL。在96孔板中，每個(gè)孔加入100 μL的菌懸液和100 μL稀釋后含隱丹參酮的培養(yǎng)液，混合后于37℃培養(yǎng)24 h，使用酶標(biāo)儀測定OD600 nm值（細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm波長處的吸光值）。液體LB培養(yǎng)基作空白對照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 結(jié)晶紫染色法觀察隱丹參酮對PA生物膜

形成的影響

將100 μL 1.5×108 CFU/mL的 PA菌液接種到96孔板中，分別加入隱丹參酮（0～800.0 μg/mL）溶液，于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。吸出浮游菌，使用PBS緩沖液沖洗孔板3次，向每個(gè)孔中加入100 μL甲醇固定15 min，棄去甲醇溶液，使用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次。向每個(gè)孔中加入100 μL 1%結(jié)晶紫溶液，并在室溫下染色5 min。隨后吸出1%結(jié)晶紫溶液，用蒸餾水洗去多余的染液，自然風(fēng)干后，向各孔中加入100 μL 體積分?jǐn)?shù)為33%的冰醋酸溶液溶解5 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處測量培養(yǎng)孔中溶液的OD570 nm值（細(xì)菌培養(yǎng)液在570 nm波長處的吸光值），根據(jù)獲得的OD570 nm值測定生物膜形成的能力［11］，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 顯微鏡觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響

取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孔中放入無菌玻片，每孔分別加入1 mL菌液和1 mL各質(zhì)量濃度的隱丹參酮溶液（0～800.0 μg/mL），37℃靜止培養(yǎng)24 h后，吸出多余液體，使用PBS緩沖液洗滌3次，甲醇固定15 min后，生理鹽水洗滌3次，自然風(fēng)干。每孔加入500 μL配制好的結(jié)晶紫染色劑或SYTO9染色劑，避光染色15 min后，吸出染色液，使用生理鹽水洗滌3次。取出玻片，制片后放于倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察PA生物膜形成情況。

1.2.4 隱丹參酮對PA生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

將PA接種于96孔板，每孔加入200 μL LB培養(yǎng)基。每個(gè)孔中加入不同質(zhì)量濃度的隱丹參酮溶液（0～800.0 μg/mL），37℃靜置培養(yǎng)48 h。收集浮游細(xì)菌，離心，收集沉淀物，使用UNlQ-10柱式總RNA分離試劑盒提取沉淀物細(xì)胞的總RNA。按照生產(chǎn)廠家提供的程序?qū)ι锬ば纬傻南嚓P(guān)基因LasI、LasR、RhlI和RhlR進(jìn)行RT-qPCR，并從中獲得RT-qPCR數(shù)據(jù)。RT-qPCR分析所用引物見表1。重復(fù)試驗(yàn)3次。

表1 引物信息

Tab. 1 Primer information

Gene Primer sequence

LasI

F： GAAATCGATGGTTATGACGC

R： CGGCACGGATCATCATCTTC

LasR

F： ATGGCCTTGGTTGACGGT

R： TCAGAGAGTAATAAGACCCAAATTAACG

RhlI

F： TCAGGTCTTCATCGAGAAGC

R： CGTTGCGAACGAAATAGCG

RhlR

F： TGGATCCGGCGATCCTCAAC

R： GCTCTAGAGCTTCTGGGTCAGCAACT

注：引物序列來自文獻(xiàn)［12-13］ 。

Note： Primer sequences from the literature［12-13］.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，藥物干預(yù)組與空白對照組的差異采用單因素方差分析，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1 隱丹參酮對PA最小抑菌質(zhì)量濃度的測定

隨著隱丹參酮質(zhì)量濃度的增加，PA的生長顯著受到抑制（圖 2）。25.0 μg/mL的隱丹參酮對PA生長的抑制并不顯著；50.0 μg/mL的隱丹參酮對PA生長有顯著抑制（P<0.05）；800.0 μg/mL的隱丹參酮對PA的生長完全抑制（P<0.01）；隱丹參酮對于PA生長的MIC為800.0 μg/mL。這說明隱丹參酮對于PA有抑菌活性。

2.2 結(jié)晶紫染色法觀察隱丹參酮對PA生物膜

形成的影響

利用結(jié)晶紫染色法測定不同質(zhì)量濃度隱丹參酮對PA生物膜形成的影響（圖3）。由陰性對照孔3次OD570 nm值計(jì)算出平均值及標(biāo)準(zhǔn)差的3倍作為臨界值（optical delnsity critical，ODC），其大小為0.04，PA的OD570 nm為1.55，有很強(qiáng)的生物膜形成能力。加入100.0 μg/mL的隱丹參酮，PA的生物膜形成開始明顯減少（P<0.05），隨著隱丹參酮質(zhì)量濃度的增加，生物膜形成逐漸減少，當(dāng)加入質(zhì)量濃度為800.0 μg/mL的隱丹參酮時(shí)，生物膜形成被完全抑制（P<0.01）。結(jié)果證明，隱丹參酮能有效抑制PA生物膜的形成。

2.3 結(jié)晶紫染色觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響

結(jié)晶紫染色后于倒置顯微鏡下觀察生物膜的形成情況（圖4）?？瞻讓φ战M形成的生物膜密集、均勻。隨著隱丹參酮質(zhì)量濃度增大，生物膜形成量呈現(xiàn)依賴性減少。隱丹參酮質(zhì)量濃度達(dá)到100.0 μg/mL時(shí)，生物膜顯著減少；質(zhì)量濃度達(dá)到800.0 μg/mL時(shí)，幾乎無生物膜生長。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響

使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察隱丹參酮對PA生物膜形成的影響（圖5）?？瞻讓φ战M的PA形成片狀的生物膜，均勻覆蓋在玻片上，浮游細(xì)菌較少。質(zhì)量濃度小于100.0 μg/mL的隱丹參酮作用于PA，生物膜形成時(shí)未有顯著的抑制效果，PA仍以生物膜形式集中黏附于玻片表面；隱丹參酮質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL時(shí)，PA形成的生物膜開始減少，分布較分散，生物膜周圍有少量的浮游細(xì)菌；隨著質(zhì)量濃度的增加，PA的數(shù)量及生物膜形成逐漸減少，隱丹參酮質(zhì)量濃度為800.0 μg/mL時(shí)，PA幾乎不形成生物膜，細(xì)菌比較分散。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果與倒置顯微鏡觀察的結(jié)果相同。

2.5 隱丹參酮對PA生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響

為探究隱丹參酮抑制PA生物膜形成的機(jī)制，在不同質(zhì)量濃度隱丹參酮作用下測定生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)。LasI、LasR和RhelI、RhlR基因分別組成Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)，可以調(diào)節(jié)PA的毒力因子和生物膜的形成。試驗(yàn)結(jié)果表明（圖6）：隱丹參酮可以抑制Las和Rhl系統(tǒng)中LasI、LasR、RhlI和RhlR基因的表達(dá)（P<0.05）；隱丹參酮質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL時(shí)，LasI基因表達(dá)量相較于對照組未有明顯差異，LasR、RhlI和RhlR基因的表達(dá)被顯著抑制（P<0.05）；隱丹參酮質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，4個(gè)基因表達(dá)量均顯著下降（P<0.05）；隱丹參酮質(zhì)量濃度為800.0 μg/mL時(shí)，4個(gè)基因的表達(dá)量下降50%以上（P<0.05）。由上述結(jié)果可以得出，隱丹參酮能夠通過抑制PA的Las和Rhl系統(tǒng)抑制生物膜的形成。

3 討論

PA是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的常見細(xì)菌之一，常見于燒傷及免疫低下相關(guān)患者的繼發(fā)感染中。在臨床應(yīng)用的抗感染治療過程中，由于PA本身存在較強(qiáng)的固有耐藥性，并且隨著抗生素的濫用，其產(chǎn)生了多重耐藥性。PA的感染治療成為了臨床工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。國內(nèi)外對PA的耐藥機(jī)制展開了大量的研究，研究結(jié)果表明，生物膜的形成是PA耐藥機(jī)制的主要原因之一［14-15］。因此，抑制PA的生物膜形成對解決其耐藥問題起著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，中草藥含有多種抑菌活性成分，且作用效果顯著。 Wang等［16］的研究證明，魚腥草酸鈉可以有效控制PA的生物膜分散能力，并可以通過藥物劑量依賴性的方法控制關(guān)鍵生物膜調(diào)控劑bdlA基因的表達(dá)及其有關(guān)蛋白質(zhì)的形成，也可以控制QS體系中的Las的表達(dá)；Guo等［17］證明，穿心蓮內(nèi)酯可以通過干擾QS系統(tǒng)降低雞致病性大腸桿菌的致病性。此外，中藥還具有價(jià)格低廉、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。丹參是天然的草本植物，有活血化瘀、鎮(zhèn)靜安神等藥效。研究發(fā)現(xiàn)，其有治療心血管疾病和惡性腫瘤的功效［18-19］，而對細(xì)菌感染的治療報(bào)道較少。隱丹參酮是提取自丹參的脂溶性物質(zhì)，具有抗菌抗炎，抗腫瘤、抗氧化等活性。薛明等［20］的研究顯示，隱丹參酮對于金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制生長作用。本研究通過試驗(yàn)測定隱丹參酮的MIC為800 μg/mL，表明其對PA的生長具有抑制作用，具有抗菌活性。

PA的多重耐藥性與生物膜的形成密切相關(guān)。一些研究表明，隱丹參酮對金黃色葡萄球菌具有抗生物膜活性［21］。在本研究中，我們進(jìn)一步研究了隱丹參酮對PA的抗生物膜活性。在結(jié)晶紫染色法中，隨著隱丹參酮質(zhì)量濃度的增加，OD570 nm值呈劑量依賴性減少。當(dāng)使用800 μg/mL的隱丹參酮時(shí)，PA的生物膜形成完全被抑制。激光共聚焦掃描顯微鏡和倒置顯微鏡結(jié)果顯示，隱丹參酮能顯著降低生物膜的分布和形成。這些結(jié)果表明，隱丹參酮可以通過破壞生物膜干預(yù)PA多重耐藥性的產(chǎn)生。

PA生物膜的形成受多種因素的調(diào)節(jié)。QS系統(tǒng)依靠細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)節(jié)，是調(diào)控生物膜形成的關(guān)鍵因素之一。PA主要依賴于Las和Rhl兩個(gè)LuxI/R群體感應(yīng)系統(tǒng)。LasI產(chǎn)生自誘導(dǎo)信號分子3OC12-HSL，LasR與信號分子結(jié)合成為LasR：3OC12-HSL復(fù)合體，激活包括RhlR在內(nèi)的許多基因的轉(zhuǎn)錄。RhlR被激活后，RhlR結(jié)合RhlI產(chǎn)生的自誘導(dǎo)因子C4-HSL形成RhlR：C4-HSL復(fù)合物，調(diào)節(jié)生物膜的形成［22］。在過去的十幾年中，人們針對研制PA的群感效應(yīng)研發(fā)了不同的抑制劑，通過干擾Las和Rhl系統(tǒng)或拮抗LasR和RhlR的方式使生物膜的結(jié)構(gòu)被破壞或形成受阻。Ishida等［23］的研究利用一種合成的群體感應(yīng)抑制劑，N-?；h(huán)戊酰胺（C15H29NO），抑制3OC12-HSL和C4-HSL與其同源受體的結(jié)合，干擾Las和Rhl系統(tǒng)，導(dǎo)致PA生物膜的形成受損。G?kalsin等［24］的研究證明，在植物、藻類和地衣中常見的類胡蘿卜素玉米黃質(zhì)，通過結(jié)合群體感應(yīng)信號受體LasR和RhlR來阻斷毒力基因LasB和RhlA的表達(dá)，減少了PA生物膜的形成。楊磊等［25］研究了大葉桉揮發(fā)油對PA生物膜抑制效果以及相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)植物相關(guān)提取物可以對PA生物膜形成的相關(guān)基因產(chǎn)生作用。為了研究隱丹參酮抑制PA生物膜形成的機(jī)制，我們選擇Las和Rhl系統(tǒng)相關(guān)基因作為藥物干預(yù)研究的候選基因。隨著隱丹參酮質(zhì)量濃度的增加，這4個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量逐漸降低。當(dāng)隱丹參酮質(zhì)量濃度達(dá)到800 μg/mL時(shí)，相對表達(dá)量下降到50%以下，說明隱丹參酮可以通過抑制Las和Rhl系統(tǒng)抑制PA生物膜的形成。AHL是Las和Rhl系統(tǒng)的自誘導(dǎo)信號分子，由LasI和RhlI產(chǎn)生。因此可以推測，AHL的產(chǎn)生可能受到隱丹參酮的抑制，從而導(dǎo)致生物被膜形成的減少。

綜上所述，本研究表明，隱丹參酮對PA生物膜的形成具有抑制作用，為治療PA的感染和干預(yù)其多重耐藥性的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。隱丹參酮抑制PA生物膜的形成機(jī)制可能是隱丹參酮抑制Las和Rhl系統(tǒng)的相關(guān)基因，進(jìn)而影響PA的群體感應(yīng)系統(tǒng)以及生物膜的形成。因此，隱丹參酮作為PA生物膜形成的群體感應(yīng)抑制劑具有良好的研發(fā)潛力。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ PANG Z， RAUDONIS R， GLICK B R. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa： mechanisms and alternative therapeutic strategies［J］. Biotechnology Advances， 2019， 37（1）： 177-192.

［2］ TUON F F， DANTAS L R， SUSS P H， et al. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm： a review［J］. Pathogens， 2022， 11（3）： 300.

［3］ 朱雄林， 馮顯紅， 楊梅， 等. 醫(yī)院銅綠假單胞菌感染分布及耐藥機(jī)制研究［J］. 中國病原生物學(xué)雜志， 2022， 17（4）： 446-450.

ZHU Xionglin， FENG Xianhong， YANG Mei， et al. Study on infection distribution and drug resistance mechanism of Pseudomonas aeruginosa in hospital［J］. Journal of Parasitic Biology， 2022， 17（4）： 446-450.

［4］ RUTHERFORD S T， BASSLER B L. Bacterial quorum sensing： its role in virulence and possibilities for its control［J］. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine， 2012， 2（11）： a012427.

［5］ 歐興坤， 李文桂. 銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)Las/Rhl蛋白的研制現(xiàn)狀［J］. 中國病原生物學(xué)雜志， 2021， 16（8）： 988-992.

OU Xingkun， LI Wengui. Advance in studies on Las/Rhl of Pseudomonas aeruginosa［J］. Journal of Parasitic Biology， 2021， 16（8）： 988-992.

［6］ TAO S， XIONG Y， HAN D， et al. N-（3-oxododecanoyl）-L-homoserine lactone disrupts intestinal epithelial barrier through triggering apoptosis and collapsing extracellular matrix and tight junction［J］. Journal of Cellular Physiology， 2021， 236（8）： 5771-5784.

［7］ 汪麗佩， 金超英， 王一奇， 等. 隱丹參酮抑制STAT3磷酸化改變彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤腫瘤微環(huán)境作用的研究［J］. 中國藥學(xué)雜志， 2023， 58（8）： 683-688.

WANG Lipei， JIN Chaoying， WANG Yiqi， et al. Effect of cryptotanshinone on tumor microenvironment of diffuse large B cell lymphoma xenograft model mice by inhibiting STAT3 phosphorylation［J］. Chinese Pharmaceutical Journal， 2023， 58（8）： 5771-5784.

［8］ 劉航， 夏麗潔， 李金耀， 等. 隱丹參酮對乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞的生長抑制作用與機(jī)制研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 57（9）： 2751-2758.

LIU Hang， XIA Lijie， LI Jinyao， et al. Inhibitory effects and mechanisms of cryptotanshinone on the growth of tamoxifen resistant breast cancer cells［J］. Acta Pharmaceutical Sinica， 2022， 57（9）： 2751-2758.

［9］ FENG C， HUANG Y， HE W， et al. Tanshinones： first-in-class inhibitors of the biogenesis of the type 3 secretion system needle of Pseudomonas aeruginosa for antibiotic therapy［J］. ACS Central Science， 2019， 5（7）： 1278-1288.

［10］ 易輝， 祖瑞鈴， 易玉玲， 等. 隱丹參酮對表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用［J］. 中國感染控制雜志， 2017， 16（9）： 798-803.

YI Hui， ZU Ruiling， YI Yuling， et al. Inhibitory effect of cryptotanshinone on biofilm of Staphylococcus epidermidis［J］. Chinese Journal of Infection Control， 2017， 16（9）： 798-803.

［11］ 易彩虹， 劉德夢. 大腸埃希菌生物被膜形成能力測定及其耐藥性分析［J］. 山東醫(yī)藥， 2016， 56（2）： 62-63.

YI Caihong， LIU Demeng. Determination of biofilm formation ability and drug resistance analysis of Escherichia coli［J］. Shandong Medical Journal， 2016， 56（2）： 62-63.

［12］ STEINDLER L， BERTANI I， DE SORDI L， et al. LasI/R and RhlI/R quorum sensing in a strain of Pseudomonas aeruginosa beneficial to plants［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2009， 75（15）： 5131-5140.

［13］ 張峰領(lǐng)， 安琳， 李進(jìn)， 等. 銅綠假單胞菌LasR基因反義肽核酸序列篩選及其抑制生物被膜形成的研究［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 39（6）： 529-535.

ZHANG Fengling， AN Lin， LI Jin， et al. Screening of antisense peptide nucleic acid sequence targeting LasR gene of Pseudomonas aeruginosa and its inhibition on biofilm formation［J］. Bulletin of the Third Military Medical College， 2017， 39（6）： 529-535.

［14］ 陳興英， 張能華， 袁春妹， 等. 黃芩苷聯(lián)合妥布霉素對耐碳青霉烯銅綠假單胞菌的生物膜抑制作用分析［J］. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2023， 33（9）： 1071-1074.

CHEN Xingying， ZHANG Nenghua， YUAN Chunmei， et al. Inhibitory effect of baicalin combined with tobramycin on biofilm of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa［J］. Chinese Journal of Health Laboratory Technology， 2023， 33（9）： 1071-1074.

［15］ ?IEMYT? M， CARDA-DIEGUEZ M， RODR?GUEZ-DIAZ J C， et al. Real-time monitoring of Pseudomonas aeruginosa biofilm growth dynamics and persister cells eradication［J］. Emerging Microbes & Infections， 2021， 10（1）： 2062-2075.

［16］ WANG T， HUANG W， DUAN Q， et al. Sodium houttuyfonate in vitro inhibits biofilm dispersion and expression of bdlA in Pseudomonas aeruginosa［J］. Molecular Biology Reports， 2019， 46（1）： 471-477.

［17］ GUO X， ZHANG L Y， WU S C， et al. Andrographolide interferes quorum sensing to reduce cell damage caused by avian pathogenic Escherichia coli［J］. Veterinary Microbiology， 2014， 174（3/4）： 496-503.

［18］ WANG X， MORRIS-NATSCHKE S L， LEE K H， et al. New developments in the chemistry and biology of the bioactive constituents of tanshen［J］. Medicinal Research Reviews， 2007， 27（1）： 133-148.

［19］ 郝紅， 李方， 王志， 等. 隱丹參酮對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用［J］. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2021， 37（3）： 250-254.

HAO Hong， LI Fang， WANG Zhi， et al. Effects of cryptotanshinone on the apoptosis of neurons after cerebral ischemia reperfusion injury［J］. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology， 2021， 37（3）： 250-254.

［20］ 薛明， 崔穎， 汪漢卿， 等. 隱丹參酮及其代謝物在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 1999（2）： 2-5.

XUE Ming， CUI Ying， WANG Hanqing， et al. Pharmacokinetic study of cryptotanshinone and its metabolites in pig［J］. Acta Pharmaceutical Sinica， 1999（2）： 2-5.

［21］ 李昌勤， 趙琳， 薛志平， 等. 隱丹參酮抑菌作用機(jī)制研究［J］. 中國藥學(xué)雜志， 2012， 47（21）： 1706-1710.

LI Changqin， ZHAO Lin， XUE Zhiping， et al. Antibacterial mechanism of cryptotanshinone［J］. Chinese Pharmaceutical Journal， 2012， 47（21）： 1706-1710.

［22］ OLOUGHLIN C T， MILLER L C， SIRYAPORN A， et al. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2013， 110（44）： 17981-17986.

［23］ ISHIDA T， IKEDA T， TAKIGUCHI N， et al. Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa by N-acyl cyclopentylamides［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2017， 73（10）： 3183-3188.

［24］ G?KALSIN B， AKSOYDAN B， ERMAN B， et al. Reducing virulence and biofilm of Pseudomonas aeruginosa by potential quorum sensing inhibitor carotenoid： zeaxanthin［J］. Microbial Ecology， 2017， 74（2）： 466-473.

［25］ 楊磊， 黃慶， 高興新， 等. 大葉桉揮發(fā)油對銅綠假單胞菌的體外抑菌效果及生物膜抑制作用［J］. 廣西醫(yī)學(xué)， 2023， 45（1）： 56-59， 66.

YANG Lei， HUANG Qing， GAO Xingxin， et al. Effects of bacteriostasis in vitro and biofilm inhibition of Eucalyptus robusta-derived volatile oil on Pseudomonas aeruginosa［J］. Guangxi Medical Journal， 2023， 45（1）： 56-59， 66.