林麒，張群，張繼一，賈新傲，唐玉嬌

1.長春科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（長春 130600）；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（長春 130118）

過多飲酒會增加相關(guān)肝[1]、腎[2]疾病產(chǎn)生的可能。人體通過肝和腎將酒精代謝[3]，在代謝過程中，乙醇所產(chǎn)生的代謝反應(yīng)及醇反應(yīng)為醛進(jìn)一步代謝過程中所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥與炎癥因子等多因素相互作用，最終可令肝腎產(chǎn)生炎癥[4-7]、臟器纖維化[8-10]等一系列問題。西醫(yī)在治療酒精引起的肝腎疾病時(shí)，常用的治療藥物多伴隨其他不良反應(yīng)及影響，而近來利用小分子活性物質(zhì)嘗試治療的趨勢逐漸增大，其可通過加快影響活性氧及炎癥水平的速度，從而減少肝腎疾病的產(chǎn)生或是減緩疾病的惡化[11-15]。對此國內(nèi)學(xué)者嘗試?yán)弥胁菟幪崛∥镔|(zhì)，對酒精造成的損傷進(jìn)行防治工作的建立[16]。梅花鹿作為國內(nèi)中醫(yī)長期使用的珍貴藥用動物[17]，其功能藥效在歷代醫(yī)學(xué)典籍與現(xiàn)代藥典中均有詳細(xì)記載，而鹿心也已證實(shí)具有一定抗氧化的功能藥效[18-20]。借助小分子肽具有易轉(zhuǎn)化吸收、活性高、易直接進(jìn)入細(xì)胞等一系列特殊生物學(xué)特性，通過提取鹿心小分子物質(zhì)能加速人類啟動自我修復(fù)的過程，更利于人體吸收、轉(zhuǎn)化和利用[21]，使鹿心的有效物質(zhì)更有效地預(yù)防并作用于酒精對肝腎的損傷。鹿心提取物對急性酒精損傷是否有保護(hù)及預(yù)防作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，因此試驗(yàn)采取由鹿心中提取的小分子肽對酒精造成的肝腎疾病進(jìn)行干預(yù)，并基于對服用鹿心肽的試驗(yàn)動物進(jìn)行急性酒精肝腎損傷模型的建立[22]，檢測小鼠肝腎臟生化指標(biāo)及血液中分子水平，以討論鹿心肽對小鼠急性酒精性肝腎損傷的干預(yù)作用及預(yù)防機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙醛脫氫酶（ALDH）試劑盒（A075-1-1）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（A001-3-2）、丙二醛（MDA）試劑盒（A003-1-2），均購自南京建成生物工程研究所有限公司；鹿心（吉林省東鰲鹿業(yè)科技開發(fā)有限公司）；木瓜蛋白酶（P64463-100 g，上海阿拉丁生物科技公司）；紅星二鍋頭56°（北京紅星股份有限公司）；Universal qPCR Master Mix M3003L（10193699，上海金畔生物科技有限公司）；Cycle-Script RT Premix（dT20），2204211J，Bioneer。

1.2 儀器與設(shè)備

漩渦混合器（XH-C，金壇市白塔新寶儀器廠）；恒溫振蕩器（THZ-98AB，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50A，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；冷凍干燥機(jī)（17-0618，寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速離心機(jī)（JIDI-20D，廣州吉迪儀器有限公司）；-80 ℃低溫冰箱（DW-SGL388A，青島海爾特種電器有限公司）；Thermal Cycler Dice TP850（Takarabio Inc.，Shiga，Japan）；數(shù)顯恒溫四孔水浴鍋（BHS-4，寧波市鄞州群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電子天平[AL204，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.3 動物

試驗(yàn)采用C57BL/6J健康昆明種小鼠（SPF級）20只，雄性，體重25～30 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，在GB 14925—2010《實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施》飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，室溫25±1 ℃，相對濕度50%～60%。動物試驗(yàn)在長春科技學(xué)院動物倫理福利委員會監(jiān)督下開展，遵守國家及長春科技學(xué)院對于試驗(yàn)動物倫理福利的要求，CKARI202302。

1.4 基因序列（表1）

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 方法

1.5.1 鹿心肽提取方法

將鹿心和已對比最適用分解蛋白的酶（木瓜蛋白酶）混合[23]，調(diào)制成pH 7的溶液，放入溫度調(diào)至55 ℃恒溫培養(yǎng)箱酶解。待酶解7 h后，取出反應(yīng)物并將其放入100 ℃水浴鍋中滅活10 min，在冷卻后混合物調(diào)pH 7[24]，離心、抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥至粉末狀[25]，再通過透析將小分子的鹿心肽成功提取，并再次進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥，將鹿心肽以固體的形式儲存。

1.5.2 動物模型的建立

小鼠適應(yīng)性飼喂1周后，將其隨機(jī)分為4組，即空白組、對照組、鹿心肽低劑量、高劑量組，在13～14 d對對照組及鹿心肽高低劑量組建立急性酒精肝腎損傷模型[26]。其間每組小鼠分別記錄當(dāng)日采食量、飲水量并定期記錄排便量。鹿心肽高低劑量組1～13 d每日固定時(shí)間灌胃組內(nèi)小鼠相應(yīng)濃度的鹿心肽水溶劑（鹿心肽低劑量采用鹿心肽100 mg/kg，鹿心肽高劑量采用鹿心肽200 mg/kg），空白組和對照組1～13 d灌胃對應(yīng)量雙蒸水。對照組、鹿心肽高低劑量組從13～14 d開始灌胃白酒酒精（56°二鍋頭12 mL/kg），連續(xù)2 d。具體給藥情況如表2所示。末次給酒后24 h（需禁食12 h）稱取體重，注射0.7～0.8 mL麻醉劑，采用心臟采血[27]并在采血后將其處死。

表2 急性酒精性肝腎損傷模型建造

1.5.3 指數(shù)計(jì)算

在末次給酒后24 h（需禁食12 h）稱取小鼠體重，對小鼠進(jìn)行麻醉，通過心臟采血獲取血清，隨后處死。取出小鼠肝臟、腎臟，用冰生理鹽水沖盡殘血，稱量器官濕重，計(jì)算小鼠的肝臟指數(shù)[28]（肝臟質(zhì)量/小鼠體重×100%）及腎臟指數(shù)[29-30]（腎臟質(zhì)量/小鼠體重×100%），肝臟指數(shù)（hepatosomatic index，HIS）按式（1）計(jì)算，腎臟指數(shù)（Kidney index）按式（2）計(jì)算。

式中：WL為小鼠肝臟濕重，g；WK為小鼠腎臟濕重，g；Wt為小鼠終末體重，g。

1.5.4 鹿心肽對小鼠MDA、ALDH、SOD含量影響檢測

解剖前獲取血清；解剖后獲取肝、腎勻漿，并通過血清檢測過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物MDA、ALDH、SOD等含量。以上檢測盒及檢測方法皆由南京建成生物制品工程公司提供。

1.5.5 qPCR檢測IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平

利用Trizol從小鼠冷凍肝腎臟中分離出總RNA。通過制造商提供的說明進(jìn)行常規(guī)定量后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并根據(jù)金畔生物科技有限公司提供的基因序列，對目標(biāo)基因進(jìn)行定量PCR檢測。最終將基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH，對mRNA的相對定量分析。

1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以“”表示，組間差異比較分析采用單因素方差分析，P＜0.01或P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟指數(shù)及腎臟指數(shù)

如表3所示，各組小鼠的肝臟指數(shù)較空白組小鼠的肝臟指數(shù)皆有顯著變化，在鹿心肽不同劑量藥物注入小鼠體內(nèi)后，小鼠的肝臟指數(shù)對比對照組有顯著下降。依據(jù)4組小鼠的肝臟指數(shù)，推測小鼠在酒精刺激后除生理食欲等影響外，肝臟質(zhì)量本身也受到酒精的一定影響，可能出現(xiàn)腫大或炎癥等癥狀的發(fā)生。結(jié)果說明小鼠在經(jīng)過鹿心肽藥物的提前保護(hù)后對酒精性肝損傷有一定保護(hù)與緩解作用。

表3 肝腎指數(shù)

在腎臟指數(shù)的數(shù)據(jù)方面顯示，對照組與空白組和加入鹿心肽藥物的2組均有顯著差異，而與鹿心肽低劑量組有著極顯著差異，表明低劑量的鹿心肽在與降低酒精損傷效果上比高劑量的更佳。

2.2 鹿心肽對酒精損傷后小鼠的SOD含量和MDA含量影響

為探究小鼠在灌胃酒精后體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，試驗(yàn)通過測量小鼠血清中SOD和MDA的含量予以對比分析。如圖1所示，經(jīng)酒精灌胃后，對照組小鼠血清中SOD含量與空白組相比有極顯著的降低，而獲得鹿心肽藥物的2組小鼠相對于空白組的表現(xiàn)水平雖有不同程度的降低，但于對照組都更為接近健康水平。同時(shí)經(jīng)過試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在酒精的損傷后對照組的MDA含量有顯著上升。此外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高劑量灌胃鹿心肽后的小鼠在MDA含量上與對照組相比，更接近空白組的含量。通過這兩項(xiàng)數(shù)據(jù)表明鹿心肽具有提高酒精性損傷后的抗氧化能力，并減少其他氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生。

圖1 鹿心肽對酒精性損傷小鼠SOD、MDA的檢測結(jié)果

2.3 ALDH活性的測定

酒精在進(jìn)入人體后主要通過血液循環(huán)進(jìn)入臟器，而乙醇代謝主要發(fā)生在肝臟中，而乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶作為關(guān)鍵酶，因此兩個(gè)酶的活性在乙醇代謝途徑中起著重要作用，很大程度上表示著肝臟分解酒精的能力。試驗(yàn)通過血清檢測（圖2）發(fā)現(xiàn)，對照組的ALDH活性是顯著低于其他組的，而鹿心肽高低劑量組的ALDH活性也與空白組相對接近。說明鹿心肽在一定程度上能夠幫助使用者解酒水平在酒后依然更接近正常值。

圖2 ALDH活性的測定

2.4 鹿心肽對酒精性肝腎損傷小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

圖3和圖4顯示，對照組的肝腎勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平相對于空白組有顯著升高，在小鼠進(jìn)行鹿心肽灌胃后TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平對于對照組有顯著下降。綜上，鹿心肽可能通過調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)水平影響急性酒精對小鼠肝腎臟的損傷、減輕炎癥反應(yīng)的程度，長期食用鹿心肽能夠?qū)凭該p傷起到一定的預(yù)防及保護(hù)作用。

圖3 小鼠肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平

圖4 小鼠腎臟IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平

3 結(jié)論與討論

鹿心具有抑制炎癥并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，而酒精性肝腎損傷主要是由酒精分解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物引起的代謝紊亂所造成[31]，并且刺激肝細(xì)胞上游NF-κB通路激活，通過誘導(dǎo) TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)進(jìn)一步引起炎癥而造成肝腎的損傷[32]。故試驗(yàn)主要圍繞利用鹿心功能以減少氧化應(yīng)激及炎癥的目的，探究并驗(yàn)證鹿心對酒精性肝腎損傷的預(yù)防及保護(hù)作用功效。采用建造動物急性酒精損傷模型，并在處死小鼠后采得血清及肝腎勻漿，通過血清檢測SOD及MDA有關(guān)氧化應(yīng)激的標(biāo)志物的含量[33-36]，利用肝腎勻漿測得炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平[37-40]，并檢測ALDH活性值以便確保鹿心的針對性作用及驗(yàn)證模型是否成功建立。

在動物情況觀察方面，研究發(fā)現(xiàn)在動物行為上鹿心肽高低劑量組的小鼠在給酒后的醒酒時(shí)間及酒后所出現(xiàn)的類似于精神萎靡及飲食量減少的情況都顯著優(yōu)于對照組。通過大致比對四組小鼠的建模期間的體重變化發(fā)現(xiàn)，鹿心肽低劑量組與空白組的體重變化曲線最為接近，而鹿心肽高劑量組及對照組都受到不同程度的飲食欲望影響。試驗(yàn)在臟器外觀上，觀察比對肝腎的生理解剖外觀圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組的肝臟在酒精的危害下已出現(xiàn)輕微的膠原、糖蛋白堆積和輕微的纖維化及脂肪肝前期癥狀，顏色發(fā)暗等。臟器指數(shù)方面，試驗(yàn)通過測量肝臟和腎臟兩個(gè)臟器指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在酒精作用下，對照組在肝腎指數(shù)上顯著大于其他3組，預(yù)測該組發(fā)生腫脹或者炎癥反應(yīng)導(dǎo)致指數(shù)升高。在指數(shù)上，鹿心肽高低劑量組也有一定差異，鹿心肽低劑量組更接近于空白組。試驗(yàn)數(shù)據(jù)說明鹿心肽具有預(yù)防及保護(hù)肝腎的作用，但其作用及效果與藥物劑量有著聯(lián)系。

在抗氧化及炎癥因子表達(dá)的指標(biāo)中，通過對小鼠進(jìn)行的血清檢測顯示，鹿心肽對酒精性損傷小鼠的SOD含量及MDA含量上有明顯影響。在SOD含量上的表現(xiàn)空白組優(yōu)于鹿心肽高劑量組、鹿心肽低劑量組、對照組3組，呈現(xiàn)階梯式的表現(xiàn)，且在統(tǒng)計(jì)方面也具有極顯著性。而在MDA的表現(xiàn)水平上鹿心肽高劑量組同樣作為其他3組中最好的1組，更接近于健康水平，數(shù)據(jù)再次表明鹿心肽具有提高酒精性損傷的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)藥物的劑量也與預(yù)防及保護(hù)的作用有著極大的關(guān)聯(lián)。對照組中急性酒精建模的小鼠相較于空白組在TNF-α、IL-1β、IL-6水平上表達(dá)更加顯著，鹿心肽高低劑量小鼠在TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)水平上皆有極顯著性降低。同時(shí)此次試驗(yàn)關(guān)于ALDH活性的結(jié)果顯示，對照組ALDH活性顯著低于空白組，且鹿心肽高低劑量組在ALDH活性數(shù)值上皆于對照組及空白組之間，通過這樣的結(jié)果不僅代表整個(gè)試驗(yàn)建模的成功，且再次表明鹿心肽存在抗氧化作用，對酒精性肝腎損傷具有一定的預(yù)防及保護(hù)作用。

綜上所述，證明鹿心肽對酒精性小鼠肝腎損傷具有一定的預(yù)防及保護(hù)作用，其主要機(jī)制可能是通過在減少炎癥和抗氧化等方面發(fā)揮作用。然而，鹿心肽作用于酒精的詳細(xì)機(jī)制以及劑量對其影響的確切確定還需要進(jìn)一步研究加以闡明。