趙東強,陳 樂,李萌萌,楊 兵

(1.天津市泰達醫(yī)院 口腔科,天津300450;2.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院 口腔科,天津300211;3.天津市第一中心醫(yī)院 口腔科,天津300192;4.天津市海河醫(yī)院 口腔科,天津300350)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)發(fā)病率呈上升趨勢,尤其是年輕的患者[1-3]。手術和放化療是OSCC的主要治療方法,但化療在OSCC的治療中起著重要作用[4]。盡管臨床方法有所進步,但OSCC的5年生存率仍然很低。MiRNAs是一組小的非編碼RNA,通過結合靶基因的3′-非翻譯區(qū)(UTR)也表現(xiàn)為基因表達的調(diào)控因子,已被發(fā)現(xiàn)在癌癥的細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[5-6]。此外,越來越多的證據(jù)表明,miRNAs在細胞發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用,如細胞生長和增殖,并參與包括OSCC在內(nèi)的癌癥進展[7-9]。證據(jù)也表明,miR-338-3p可抑制多種癌細胞的生物學功能[10]。蛋白磷酸酶 1B(protein phosphatase 1B,PPM1B)是金屬依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的成員,在細胞信號通路中具有重要的調(diào)控功能,PPM1B作為一個潛在的致癌基因也被證明通過負調(diào)控壞死細胞死亡來防止細胞死亡[11]。本實驗中,通過生物信息學軟件Target scan網(wǎng)站的預測和熒光素酶報告基因分析的驗證,探討OSCC中miR-338-3p與PPM1B的相互作用,報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

HGF與TSCCA,CAL-27,Tb3.1細胞均購自中科院上海細胞庫;膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清、Annexin V-FITC-PI 試劑盒、MTT溶液、BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天試劑有限公司);雙熒光素酶報告檢測試劑盒(Promega公司);miR-338-3p過表達物、PPM1B過表達物、PPM1B小干涉RNA(上海吉瑪基因公司);脂質(zhì)體2000試劑、TRIzolTM溶液、DMSO、逆轉錄試劑盒、RIPA裂解緩、ECL發(fā)光液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國賽默飛公司);兔抗剪切半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和兔抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)、兔抗蛋白磷酸酶1B蛋白(PPM1B)、HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗(上海艾博抗公司)。

1.2 病理標本

2020年3月至2021年3月,20例OSCC患者(男性10例;女性10例;平均年齡:55.05±9.65歲)手術后OSCC及相應的鄰近正常組織,入組患者術前均未接受過化療或放療。入組患者的病理分期由兩名以上的副高級病理學醫(yī)生共同復查和確認。OSCC組織與鄰近正常組織收集后立即保存在液氮中備用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準,所有參與者均簽署知情同意書。

1.3 細胞分組和轉染

HGF與TSCCA,CAL-27,Tb3.1細胞放入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37°C,5% CO2。培養(yǎng)基每2 d更換一次。將對數(shù)生長過程中的OSCC細胞接種于6孔板中。當細胞達到30%～50%時,根據(jù)脂質(zhì)體2000試劑說明書,轉染培養(yǎng)細胞,對miR-338-3p進行過表達,分為陰性對照組(NC組)、miR-338-3p模擬組(mimics-miR-338-3p組),對PPM1B進行過表達,分為陰性對照組(NC組)、PPM1B模擬組(轉染PPM1B模擬組),對PPM1B進行敲除,分為陰性對照組(NC組)、PPM1B小干涉RNA組(si-PPM1B組),各組轉染步驟嚴格按照說明書進行。

1.4 逆轉錄定量聚合酶鏈反應法檢測miR-338-3p與PPM1B mRNA的表達量

各組織和細胞中加入Trizol試劑按照試劑說明書提取總RNA。RNA被溶解在含有二乙基焦碳酸酯(DEPC)的超純水中。使用紫外分光光度計評價樣品的光密度OD(260 nm)/OD(280 nm)的比值,并對總RNA進行濃度測定和質(zhì)量鑒定。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA,用于后續(xù)的PCR反應。U6作為miR-338-3p的內(nèi)對照,使用以下引物:miR-338-3p(正向,5’-ATCCAGTGCGTGTCGTGG-3’;反向,5’-TGCTTCCAGCATCAGTGAT-3’);U6(正向,5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向,5’-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3’)。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量,實驗重復3次。

1.5 雙熒光素酶報告基因分析miR-338-3p和PPM1B潛在的靶向關系

將TSCCA細胞在含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為5% CO2,37℃。將miR-338-3p在PPM1B上的野生型(WT)與匹配的突變體(Mut)對接位點克隆到pGL3-basic載體中。將PPM1B-WT或PPM1B-Mut與miR-338-3p模擬物其相應的對照共轉染到TSCCA細胞中。轉染24 h后,使用雙熒光素酶報告檢測試劑盒按照制造商的協(xié)議測定TSCCA細胞的螢火蟲熒光素酶活性和海腎素熒光素酶活性,相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎素熒光素酶活性值,實驗重復3次。

1.6 Western blot法檢測PPM1B與凋亡相關蛋白Bax和Claved-caspase 3、Bcl-2的表達

轉染48 h后,用胰蛋白酶從培養(yǎng)表面分離,PBS洗滌3次,收集,加入細胞裂解液。然后提取總蛋白,用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,煮沸至變性。制備了10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sdspage)用于蛋白質(zhì)分離。然后,用濕法轉移法將蛋白質(zhì)轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜2 h,用Tris-HCl緩沖鹽水洗滌3次(TBS,10 min/次)。將膜加入初級兔抗人單克隆抗體:PPM1B(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Claved-caspase 3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、FASL(ABP51328);然后用HRP標記的山羊抗兔IgG(稀釋1∶5 000)在室溫下培養(yǎng)2 h。用增強化學發(fā)光溶液檢測膜上的蛋白帶。以目標蛋白條帶與內(nèi)對照條帶的灰度值比值為相對蛋白表達量,每個實驗重復3次。

1.7 MTT法測定細胞增殖率

轉染后生長良好的細胞被分離以獲得單細胞懸液。將細胞接種到96孔板上,每組設置5個重復孔。調(diào)整細胞濃度至1×104細胞/孔,加入培養(yǎng)基。分別轉染細胞24 h、48 h和72 h后更新培養(yǎng)基,每孔加入20 μL MTT溶液。再孵育4 h后,棄用上清液,每孔加入100 μL甲瓚溶液。每孔用酶標儀在492 nm波長處測定OD值,每個實驗重復3次。

1.8 采用Transwell法檢測細胞的遷移能力

轉染后,將TSCCA細胞(1×105細胞/孔)重懸于無胎牛血清的培養(yǎng)基中,接種于上孔板,下室加入500 μL含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基,然后將細胞培養(yǎng)在含有5%的CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛在37℃下固定細胞30 min。輕輕去除濾膜上表面的剩余細胞,膜下表面的細胞用0.1%結晶紫染色10 min。用熒光顯微鏡在5個隨機視野中觀察并拍攝細胞。每個實驗重復3次。

1.9 采用流式細胞術檢測細胞凋亡率

收集各組細胞,用PBS洗滌細胞2次,用15 μL AnnexinV-FITC染色緩沖液在4℃下避光染色15 min,然后加入10 μL PI染色液染色10 min,混合均勻。1 h內(nèi),用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,實驗進行3次。

1.10 免疫組化法檢測OSCC組織與正常組織PPM1B蛋白相對表達量

將組織固定、石蠟包埋、切片。切片脫蠟,再水化,然后在檸檬酸鹽緩沖液中孵育20 min獲得抗原修復。隨后將組織用3%H2O2培養(yǎng)15 min,從而阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。此后,組織切片與兔抗PPM1B抗體(1∶200)在4℃下培養(yǎng)過夜。隨后,切片用PBS洗滌,用HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)在室溫下孵育10 min,并用DAB顯影。用1%蘇木精對細胞核進行二次染色,以胞質(zhì)染色呈棕褐色為陽性并使用光學顯微鏡拍照。免疫反應(IRS)評分:由2位病理學專家評分;染色強度0～3分:依次為陰性、淺黃色、淺褐色、深褐色;陽性范圍0～4分:依次為0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。免疫反應評分=染色強度評分×陽性范圍。實驗重復進行3次。

1.11 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 miR-338-3p與PPM1B在OSCC組織中表達

結果顯示,與相鄰的正常組織樣本相比,OSCC組織中miR-338-3p的表達顯著降低(圖1A,P<0.05),而PPM1B mRNA表達上調(diào)(圖1B和1C,P<0.05),見圖1。

2.2 OSCC細胞中miR-338-3p與PPM1B的表達量

與對照細胞HGF相比,OSCC細胞系TSCCA,CAL-27,Tb3.1中miR-338-3p mRNA表達均下降(圖2A,P<0.05),PPM1B mRNA與蛋白表達均增加(圖2B和2C),證明miR-338-3p 在TSCCA細胞中較HGF細胞與其他兩株OSCC細胞表達最少,PPM1B表達最多,因而選擇了TSCCA細胞作為OSCC的細胞實驗研究對象。

圖2 HGF與OSCC細胞株中miR-338-3p與PPM1B的mRNA表達量(*P<0.05)

2.3 miR-338-3p調(diào)節(jié)TSCCA 細胞增殖、凋亡和遷移

與對照組相比,mimics-miR-338-3p組細胞增殖顯著增強(圖3A,P<0.01)。Western blot檢測顯示,過表達miR-338-3p可以促進Bax和Claved-caspase 3并抑制PPM1B、Bcl-2的表達(圖3C和3D,P<0.05)。與對照組相比,mimics-miR-338-3p組顯著抑制細胞遷移,而si-miR-338-3p組顯著促進細胞遷移(圖3B,P<0.05)。

圖3 miR-338-3p對TSCCA細胞增殖、凋亡和遷移的影響(*P<0.05)

2.4 miR-338-3p和PPM1B有潛在的靶向關系

Target scan的生物信息學數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址www.targetscan.org/vert_72/)預測出PPM1B可能是miR-338-3p的靶基因(圖4A)。為了進一步證實PPM1B是miR-338-3p的靶基因,結果發(fā)現(xiàn),miR-338-3p和PPM1B-Wt共轉染組的熒光素酶活性低于NC組(圖4B,P<0.05),而PPM1B-Mut的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(圖4B,P>0.05)。

圖4 miR-338-3p和PPM1B結合位點(*P<0.05)

2.5 miR-338-3p通過PPM1B調(diào)節(jié)TSCCA細胞增殖、凋亡和遷移

與對照組相比,轉染PPM1B小干涉RNA后,si-PPM1B組顯著抑制細胞增殖(圖5A,P<0.05);si-PPM1B組顯著增強細胞凋亡率(圖5C)。與對照組相比,si-PPM1B組顯著抑制細胞遷移(圖5B,P<0.05)。與單獨過表達miR-338-3p組相比,同時過表達miR-338-3p與PPM1B后,部分逆轉了miR-338-3p對OSCC細胞增殖(圖6A,P<0.05)、遷移(圖6B,P<0.05)、凋亡(圖6C)作用。

圖5 下調(diào)PPM1B后對TSCCA細胞增殖、凋亡和遷移的影響(*P<0.05)

圖6 miR-338-3p通過PPM1B調(diào)節(jié)TSCCA細胞增殖、遷移和凋亡(*P<0.05)

3 討論

在過去的20年里,手術技術和化療-放療方案已經(jīng)取得的進展,然而OSCC的生存率并沒有明顯下降[12]。先前的研究表明,miRNAs可以在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮“抑癌基因”或“致癌基因”的功能,并在OSCC進展中調(diào)節(jié)多個細胞過程[13-15]。本研究的目的是弄清楚miR-338-3p影響OSCC細胞生物學功能的機制。據(jù)報道,miR-338-3p參與了各種類型癌癥的進展和發(fā)展。miR-338-3p被認為在腫瘤抑制中發(fā)揮重要作用,其在食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中的低表達已被證實[16];miR-338-3p的失調(diào)可作為上皮性卵巢癌的預后生物標志物[17];同時,miR-338-3p通過下調(diào)Wnt家族成員2B(WNT2B)增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[18]。然而,miR-338-3在OSCC中的細胞功能及其分子機制尚不清楚。本研究評估了miR-338-3p在OSCC細胞中的功能以及miR-338-3p與PPM1B之間的相互作用。結果表明,miR-338-3p在OSCC組織中的表達顯著下調(diào)。在OSCC中,miR-338-3p可能作為一種腫瘤抑制因子,通過靶向抑制OSCC的進展。當過表達miR-338-3p可抑制OSCC細胞增殖與遷移并誘導細胞凋亡。Western blot檢測顯示,過表達miR-338-3p可以促進Bax和Claved-caspase 3并抑制PPM1B、Bcl-2的表達,這些結果提示,miR-338-3p可能作為腫瘤抑制因子,參與了OSCC的進展。

生物信息學研究顯示,PPM1B的高表達與骨肉瘤的復發(fā)呈正相關[19]。PPM1B可能通過調(diào)節(jié)TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)的磷酸化水平參與腎癌的進展[20]。同時,PPM1B在胃癌和結直腸癌中發(fā)揮關鍵作用[21-22]。本研究檢測了PPM1B在OSCC中的表達,發(fā)現(xiàn)OSCC組織和細胞株中PPM1B蛋白的表達水平明顯高于鄰近的正常組織和HGF細胞。并通過體外實驗進一步檢測了PPM1B對OSCC細胞的影響,用PPM1B小干涉RNA處理的TSCCA細胞中,觀察到細胞增殖、細胞遷移能力變?nèi)鯗p少,細胞凋亡率增加。生物信息學數(shù)據(jù)庫和雙熒光素酶報告基因檢測進一步證實了PPM1B是miR-338-3p的靶基因。由于miR-338-3p與PPM1B具有靶向關系,miR-338-3p能夠調(diào)節(jié)TSCCA細胞的生物學行為,故而通過下調(diào)PPM1B表達驗證其對TSCCA細胞的生物學行為影響。在本研究中,轉染PPM1B小干涉RNA后,與對照組相比,si-PPM1B組顯著抑制細胞增殖和遷移并誘導細胞凋亡。與單獨過表達miR-338-3p組相比,當同時過表達miR-338-3p與PPM1B后,PPM1B部分逆轉了miR-338-3p對OSCC細胞增殖、凋亡、遷移作用。

綜上所述,與鄰近正常組織樣本相比,OSCC組織中miR-338-3p的表達顯著降低,而PPM1B的表達顯著增加。PPM1B是miR-338-3p的直接靶基因。過表達miR-338-3p可抑制OSCC細胞的增殖和遷移,并誘導細胞凋亡。這些結果表明,miR-338-3p可能通過直接靶向PPM1B來調(diào)控OSCC的進展。