呂紹芝,沈慶慶,饒席兵,錢禛鋒,張蓉瓊,何麗蓮,3,李富生,3

(1. 云南農業(yè)大學農學與生物技術學院,昆明 650201;2. 云南農業(yè)大學甘蔗研究所,昆明 650201;3. 云南省作物生產與智慧農業(yè)重點實驗室,昆明 650201)

【研究意義】甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是中國非常重要的能源作物和糖料作物。近幾年來,干旱嚴重制約了中國的甘蔗生產,國內旱地種植的甘蔗所占比例已達 85%以上[1]。割手密(SaccharumspontaneumL.)具有很多適應自然逆境的優(yōu)良性狀,一直被作為甘蔗雜交育種過程中最重要的野生親本,是抗逆基因的主要來源[2]。冬季和春季是種植甘蔗的季節(jié),而云南在冬春季常常會發(fā)生干旱,這將會直接影響甘蔗的萌芽與出苗,進而影響甘蔗的產量及糖分積累[3]。楊建波等[4]研究表明,在苗期對甘蔗進行反復干旱脅迫處理,將對植株的長勢產生較強的后續(xù)性效應,此效應對甘蔗生長發(fā)育的影響將會直接影響甘蔗產量。因此,綜合評價甘蔗野生種質資源親本苗期的抗旱性,對于優(yōu)良抗旱親本和抗旱基因的篩選與利用意義重大。【前人研究進展】在干旱脅迫條件下,作物能通過產生一系列生理生化變化(主要包括滲透調節(jié)、活性氧的清除和質膜透性的調節(jié)等方面)提高抗旱性,進而減輕干旱脅迫對其造成的傷害[5-7]。許文花等[8]研究發(fā)現(xiàn),在割手密的伸長期進行干旱脅迫,不同材料間各個指標的耐旱系數(shù)存在差異,各材料的抗旱性與葉面積之間呈顯著負相關。王天菊等[9]通過研究26份割手密種質材料伸長初期干旱脅迫前后的多項抗旱指標,發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫后抗旱性較強的種質材料可以通過提高丙二醛含量、質膜透性、過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量來提高抗旱性,并通過聚類分析和模糊隸屬函數(shù)分析法篩選出1份高度抗旱材料。桃聯(lián)安等[10]通過研究12份割手密F2代創(chuàng)新材料拔節(jié)初期干旱脅迫處理后的生理特性,發(fā)現(xiàn)干旱脅迫后材料的丙二醛含量增加、質膜透性增大,利用模糊隸屬函數(shù)法篩選出5份抗旱性較強的材料。田春艷等[11]研究認為在拔節(jié)初期不同程度的干旱脅迫會對割手密后代的SOD活性、葉綠素(CHL)含量和可溶性蛋白(Pr)含量等指標產生影響,且隨著脅迫程度的不斷加重,植株的缺水癥狀會更加明顯。經艷芬等[12]通過測定割手密及其F1代材料在干旱脅迫前后的多項指標,并通過模糊隸屬函數(shù)法從28份材料中篩選出4份抗旱性特強的材料?！颈狙芯壳腥朦c】近年來,已有眾多國內外學者從多個角度對割手密抗旱性的指標和評價方法進行了研究,然而針對國內外不同基因型割手密苗期抗旱性綜合評價的研究卻鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以30份不同基因型割手密種質為材料,在苗期對其進行干旱脅迫并測定其生理指標變化,結合主成分分析、模糊隸屬函數(shù)、系統(tǒng)聚類等方法綜合評價其抗旱性,旨在篩選出抗旱性較強的割手密種質,為甘蔗的抗旱性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇30份割手密無性系材料作為供試材料(表1)。割手密材料均取自于云南省省級甘蔗昆明種質資源圃(云南農業(yè)大學校園內,海拔1950 m)。

表1 供試材料基本情況Table 1 Basic information of test materials

1.2 試驗設計

本試驗于云南農業(yè)大學后山的塑料大棚內進行,首先將割手密種質材料均勻分兜,然后種植于塑料盆內,每份材料種植6盆。

于2022年5月4日供試材料處于苗期(大部分割手密幼苗具有5～6個葉片)時對割手密材料進行干旱脅迫處理。將每份材料隨機分為2組,每組3盆。一組作為對照(CK),正常供水,另一組作為干旱脅迫處理(DT),停止供水。于每天上午9:00觀察材料的生長情況,采用烘干法跟蹤測定盆內土壤的相對含水量,當干旱脅迫處理達到重度脅迫(9 d)時土壤中的相對含水量為7.5%～10.0%[13],此時停止干旱脅迫。

1.3 抗旱性指標測定

干旱脅迫結束后,對全部供試材料的+1葉進行取樣,迅速放置在封口袋中并帶回實驗室,將其放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。測定相同抗旱指標時剪取葉片的同一個部位,將葉片的主脈剪去。測定的抗旱指標包括丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、可溶性糖(SS)含量和過氧化氫酶(CAT)活性,以上指標均用蘇州格銳思生物科技有限公司生產的試劑盒進行檢測。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計軟件為Excel 2010和SPSS 25.0。

1.4.1 計算抗旱系數(shù) 抗旱系數(shù)=該指標干旱處理的指標值/該指標正常澆水的指標值。

1.4.2 計算隸屬函數(shù)值 隸屬函數(shù)值參照李曉君等[14]的方法計算,當所測指標與抗旱性呈正相關時按公式(1)計算,呈負相關時則按反隸屬函數(shù)即公式(2)計算。

R(Vi)=(Vi-Vmin)/(Vmax-Vmin)

(1)

R(Vi)=1-(Vi-Xmin)/(Vmax-Vmin)

(2)

式中,Vi表示某一材料的某一指標測定值,Vmax為所測指標的最大值,Vmin為所測指標最小值,為了判斷不同材料的抗旱性強弱,計算出苗期各材料隸屬函數(shù)值的平均值,隸屬函數(shù)值均值越大,抗旱能力越強。

1.4.3 計算綜合指標的權重 參照劉碩等[15]的方法計算各綜合指標的權重。

(3)

式中,Hj是指某一綜合指標的貢獻率。

1.4.4 計算參試材料的綜合評價值

(4)

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下割手密材料各指標的變異分析

由表2可知,干旱脅迫處理后,割手密材料的過氧化氫酶活性為166.59～1252.24 U/g,平均為706.10 U/g,較對照上升233.25 U/g;丙二醛含量為19.27～69.02 nmol/g,平均為35.99 nmol/g,較對照上升5.42 nmol/g。另外,過氧化物酶活性均值、超氧化物歧化酶活性均值、可溶性糖含量均值和脯氨酸含量均值較對照分別上升117.87 U/g、857.72 U/g、7.31 mg/g、321.46 μg/g。由此可見,不同的割手密材料,其抗旱性與多種指標相關,只運用單一指標難以對參試材料的抗旱性進行準確評價,因此需要對各項指標進行綜合評價。

表2 不同處理割手密苗期各指標的描述性統(tǒng)計Table 2 Descriptive statistics of the seedling stage for S. spontaneum under different treatments

2.2 干旱脅迫下割手密主要生理指標的相關性分析

由表3可知,在干旱脅迫下,30份割手密種質材料的過氧化氫酶活性和脯氨酸含量之間呈顯著正相關(P<0.05),超氧化物酶活性和脯氨酸之間呈極顯著正相關(P<0.01);過氧化物酶活性與超氧化物歧化酶活性之間、過氧化氫酶活性與丙二醛含量之間呈顯著負相關,其他指標之間無顯著相關性(P>0.05)。由此可見,在干旱脅迫下,不同割手密材料的各個抗旱指標之間存在一定的協(xié)同性和拮抗性。

表3 抗旱生理指標的相關系數(shù)矩陣Table 3 Correlation coefficient matrix of physiological indexes of drought resistance

2.3 割手密苗期的抗旱隸屬函數(shù)比較

通過模糊隸屬函數(shù)法計算出干旱脅迫下各性狀的隸屬函數(shù)均值,對抗旱性進行綜合評價(表4)。在干旱脅迫下,90-53是30份割手密材料中抗旱性最強的,最弱的是I91-61,其余材料的抗旱性由強到弱排序為 Ⅱ91-126>2015-22>I91-17>2015-50>90-33> IND81-138> IND81-164>2015-6>2015-83>89-2>90-37>88-301>87-13>84-260>82-25>90-22>90-15>84-261>88-284>2015-104>2015-89>2015-57>90-20>2015-88>2013-13>88-283>2013-26>I91-10>I91-10。

表4 試驗材料各指標的模糊隸屬函數(shù)值比較Table 4 Comparison of fuzzy membership function values for indicators of the test materials

2.4 割手密種質材料的抗旱性綜合評價

2.4.1 主成分分析 以30份割手密材料所有指標的抗旱系數(shù)為基礎進行主成分分析,計算出各主成分的特征向量和貢獻率(表5)。前3個主成分的累積貢獻率達74.72%,因此原來的6個抗旱指標能夠轉換成另外3個綜合抗旱性指標,分別用P1、P2、P3表示。在第一主成分中,SOD活性和脯氨酸含量的系數(shù)較大,故該主成分代表了SOD活性和脯氨酸含量;第二主成分代表了CAT活性、POD活性和可溶性糖含量;第三主成分代表了MDA含量。表明6個生理生化指標均可作為評價割手密抗旱性的指標。

表5 主成分的特征向量及其貢獻率Table 5 Eigenvectors and eigenvalues of principal components

2.4.2 模糊隸屬函數(shù)分析 首先計算出3個主成分綜合指標所對應的隸屬函數(shù)值,基于3個指標的貢獻率可得到3個指標的權重(Ej),然后通過公式(4)計算出割手密抗旱性評價的綜合評價值(D),最后對D值進行排序(表6)。根據(jù)綜合D值排名前5的割手密依次為90-53、2015-22、88-301、II91-126、2015-50,僅90-53、2015-22、II91-126、2015-50還位居前5,這個結果與僅根據(jù)各項生理指標計算出的隸屬函數(shù)均值進行評價的結果存在一定差異。以生理指標計算出的隸屬函數(shù)均值為依據(jù)評價上述5份材料,其抗旱性強弱為90-53>II91-126>2015-22>I91-17>2015-50。說明,僅憑借一種方法對割手密的抗旱性進行評價容易造成誤判,需結合多種方法進行綜合性評價。

表6 參試材料的綜合指標值、隸屬函數(shù)值和D值Table 6 The values of comprehensive index, membership function and D value of the test materials

2.4.3 聚類分析 采用系統(tǒng)聚類法對所有參試材料的綜合D值進行聚類分析,由圖1可知,在歐氏距離7處可以將30份割手密材料劃分為高度抗旱、中高度抗旱、中度抗旱、低度抗旱4類,90-53自成一類,可列為高度抗旱型材料,占供試材料的3.33%;2015-22、88-301聚為一類,為中高度抗旱型材料,占供試材料的6.67%;I91-17、II91-126、2015-50、2013-26、88-283、90-37、IND81-138、2015-6、I91-10、2015-57、87-13、2015-83、90-22、90-33共14份材料聚為一類,為中度抗旱型材料,占供試材料的46.67%;低度抗旱類型的13份材料聚為一類,分別為90-15、2015-89、82-25、84-261、88-284、2013-13、90-20、2015-88、I91-61、84-260、89-2、IND81-164、2015-104,占供試材料的43.33%。

圖1 30份割手密材料的系統(tǒng)聚類圖Fig.1 System cluster of fuzzy subordination values of thirty S. spontaneum materials

3 討 論

3.1 干旱脅迫對割手密生理指標的影響

割手密的抗旱性是一個比較復雜的綜合性狀表現(xiàn),其反應在一系列的生理變化上。在植物遭受干旱脅迫時會導致活性氧(ROS)生成增加[16],這些ROS會對細胞膜、蛋白質、酶活性、RNA 和 DNA 造成氧化損傷[17]。本研究表明,割手密種質材料的SOD、POD、CAT活性在干旱脅迫后均有不同程度上升,說明植物通過抗氧化酶系統(tǒng)有效提高植物抗氧化能力并對ROS進行有效清除來減輕其對植物細胞造成的損傷[5],本研究結果與彭云玲等[18]認為干旱脅迫處理后這3種抗氧化酶活性均會增加的結果一致。脯氨酸積累可以減少細胞損傷、增加細胞滲透潛力、促進水分吸收。而在脅迫期間,可溶性糖也可維持液泡和細胞質之間的滲透平衡,從而保證植物細胞可以正常進行一系列的代謝活動[19]。本研究發(fā)現(xiàn),割手密材料干旱脅迫后的可溶性糖和脯氨酸含量均有不同程度的上升,說明不同的滲透調節(jié)物質對其在干旱脅迫條件下對滲透調節(jié)作用的貢獻存在差異。前人研究表明,干旱脅迫會導致植物脂質過氧化作用增加,而脂質過氧化作用是以 MDA 含量來衡量的,MDA 是一種眾所周知的氧化損傷標記物[20]。本研究表明,干旱脅迫后MDA 含量也有一定程度的增加,但其增加幅度低于本研究中測定的其余5個指標,這可能是因為MDA 含量增加使植株的細胞膜受到損傷的同時,抗氧化酶系統(tǒng)可以迅速清除有害物質,進而減輕脂質過氧化對細胞造成的損傷,使細胞能夠正常地發(fā)揮其生理功能[21]。

3.2 干旱脅迫下各生理指標之間的相關性分析

本研究中,干旱脅迫后割手密材料的各生理指標之間存在一定的協(xié)同性和拮抗性,其中SOD活性和POD活性之間呈顯著負相關,這與李曉君等[14]研究發(fā)現(xiàn)甘蔗苗期干旱脅迫處理后SOD活性和POD活性呈正相關的結果不一致,這可能是因為所選取的材料及材料受干旱脅迫的時間和程度不同,導致酶活性的變化趨勢出現(xiàn)差異。在王立偉等[22]的研究中,燕麥幼苗的SOD活性隨著干旱脅迫時間的延長呈先升高后降低趨勢。不同割手密種質材料對干旱脅迫的響應機制不盡相同,干旱脅迫后所產生的生理變化也存在差異。只運用某一單一指標的評價結果與多個指標綜合評價得出的結果并不完全一致,因此為了得到更加準確可靠的評價結果,需采用多個指標進行綜合性評價[23]。

3.3 割手密抗旱性綜合評價

將主成分分析、模糊隸屬函數(shù)和系統(tǒng)聚類這3種方法結合運用到割手密種質材料的抗旱性綜合評價中,可消除單一指標帶來的偏差、區(qū)分出各種質的抗旱等級,使得評價的結果與實際的結果較接近[24]。本研究結合這3種方法,對30份割手密種質材料的6個生理生化指標進行綜合評價,比較這些材料的抗旱能力,結果表明90-53的抗旱性最強,其次為2015-22和88-301,而2015-104的抗旱性最弱,聚類分析可以將30份割手密種質材料劃分為高度抗旱、中高度抗旱、中度抗旱、低度抗旱4類。前人研究表明基于主成分分析和模糊隸屬函數(shù)分析計算出的D值進行系統(tǒng)聚類分析的方法,結果與各材料田間表現(xiàn)出的實際抗旱性更接近[15, 25],這與本研究得到的結果一致。

經艷芬等[12]研究認為割手密及其血緣材料的抗旱性較復雜,植株在生長發(fā)育過程中所表現(xiàn)出的抗旱性強弱和遺傳機理會因時期不同而產生差異。另外,抗旱性評價結果的差異也與供試材料、評價指標和評價方法的不同有很大關系,因此應該從多角度出發(fā)分析割手密的抗旱性,本研究僅根據(jù)苗期的生理指標進行抗旱性的綜合評價,具有一定的局限性。為了對割手密種質進行更加全面的抗旱性評價,需要對多個關鍵的生育時期進行干旱脅迫,并結合多種抗旱指標與多種評價方法,建立一套標準的綜合評價體系。

4 結 論

割手密在干旱脅迫條件下可以通過提高CAT、SOD、POD活性以及積累可溶性糖和脯氨酸來減輕植株中MDA含量增加而導致的細胞膜脂質過氧化對細胞造成的損傷。通過主成分分析、模糊隸屬函數(shù)和系統(tǒng)聚類相結合的方法對供試的30份材料的抗旱性進行綜合評價,其中90-53的抗旱性最強,2015-22、88-301次之,2015-104的抗旱性最弱。