王婷婷,魏淑紅,宋 波,董潤鑫,許有嬪

(西華師范大學生命科學學院,四川 南充 637000)

【研究意義】小麥(TriticumaestivumL.)是全球重要糧食作物,其可持續(xù)發(fā)展是關乎國計民生的大事[1]。然而,小麥生產(chǎn)過程中常常會受到非生物(如干旱、高溫、鹽度、寒冷等)和生物脅迫(病毒、細菌、真菌、昆蟲等),導致各種病害發(fā)生[2]。其中由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)被稱為小麥的“癌癥”,近年來該病害在我國各地頻繁發(fā)生[3],據(jù)統(tǒng)計,2012—2018年,每年有超過4×106hm2的小麥發(fā)生赤霉病,約占小麥產(chǎn)區(qū)總面積的23%,給農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟損失,對糧食生產(chǎn)安全構成了嚴重威脅[4]。為防治赤霉病,人們長期使用殺菌劑,使得菌株對殺菌劑的敏感性逐漸降低,因此,迫切需要尋找一種新穎有效的赤霉病防治措施。生物防治成本低、環(huán)境友好且具有可持續(xù)防治的特點[5],彌補了化學防治帶來的環(huán)境污染和抗藥性產(chǎn)生等問題,目前備受關注。因此,分離出1株對赤霉病具有高效防治效果的生防菌以防控赤霉病害具有很好的科研及應用價值?！厩叭搜芯窟M展】生防菌可來源于植物體內(nèi)、昆蟲共生以及與生物相關的其他各種環(huán)境[6]。目前能夠防治小麥赤霉病的生防菌涵蓋了細菌、真菌等多個種屬,如芽孢桿菌、霉菌和放線菌等[7]。當前研究認為,生防菌主要通過競爭性作用、產(chǎn)生生物活性物質(zhì)、誘導植物防御等機制來發(fā)揮生防作用[8]。芽胞桿菌作為生防菌的一大類別,具有抗逆性強和抑菌譜廣等特點,被廣泛應用于植物病蟲害防治[9]。目前國內(nèi)外已分離出一些對小麥赤霉病有防治效果的芽孢桿菌,如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XG-7對赤霉病有良好的抑菌性[10];D1/2[11]、DZSG23[12]能夠抑制菌絲生長,減緩孢子萌發(fā)、使孢子畸形;Z54[13]、AF0907[14]、B-30210[15]、RC218[16]等能降低赤霉病發(fā)病;SG6抑制菌絲生長、產(chǎn)孢量及DON生產(chǎn)[17]。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)YN201732[18]、XS-2[19]和AX-3[20]等對小麥赤霉病具有明顯的防治效果。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)AFR0406[21]、DY04[22]和7F1[23]等也對禾谷鐮刀菌抑制效果明顯?！颈狙芯壳腥朦c】盡管國內(nèi)外對生防菌相關研究已取得較大進展,但在應用方面尚處于起步階段,且可開發(fā)利用的生防菌資源匱乏,因此有必要挖掘新的生防菌資源?！緮M解決的關鍵問題】XH-1是否可作為赤霉病防治的有效生防菌資源?篩選禾谷鐮刀菌的高效生防菌株是小麥赤霉病生物防治的關鍵,但目前可利用的生防菌資源十分匱乏。因此,迫切需要挖掘出高效防治赤霉病的生防菌資源。為此,本研究從健康小麥周圍土壤中分離純化出常用生理小種XH-1菌株,通過鑒定其種屬分類,分析其對常用生理小種PH-1生長發(fā)育及致病力的拮抗作用,探究XH-1可否作為小麥赤霉病的有效生防菌資源這一關鍵科學問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料培養(yǎng)

禾谷鐮刀菌菌株選用常用生理小種PH-1,由西華師范大學植物遺傳與發(fā)育生物學課題組保存,將其培養(yǎng)于PDA平板,于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后,保存于4 ℃?zhèn)溆?。小麥材料選用南麥660,由南充市農(nóng)科院小麥所贈送?？莶菅挎邨U菌菌株XH-1,分離自四川南充市西華師范大學小麥試驗田。

1.2 生防菌的分離與篩選

挖取小麥赤霉病病區(qū)中健康小麥植株周圍深5～15 cm的土樣,將其于無菌水中混勻,靜置10 min后吸取100 μL上清液進行稀釋涂布于PDA培養(yǎng)基,于30 ℃培養(yǎng)1～2 d,挑取形態(tài)各異的菌落劃線純化培養(yǎng),將純化后的單菌落連續(xù)純化培養(yǎng)3次后保存?zhèn)溆谩Ｌ羧〖兓募毦臃N于PDA培養(yǎng)基的1/3處,正中間接種PH-1菌株,28 ℃培養(yǎng)3～4 d后觀察細菌周圍是否產(chǎn)生抑菌帶,將有抑菌帶菌株作為生防菌資源并保存。本研究后續(xù)選用XH-1開展試驗。

1.3 菌株XH-1的鑒定

本研究采用16S rDNA序列分析法鑒定該菌株,利用細菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCTGGCTCG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’)擴增XH-1菌株的16S rDNA基因序列。并將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,對測序結(jié)果進行BLAST比對,使用MEGA 5.0軟件將獲得的同源序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 XH-1菌液與PH-1菌株的平板對峙分析

為分析XH-1菌液對禾谷鐮刀菌PH-1菌落生長的影響,采用平板對峙法進行試驗。每個平板滴3滴1 μL的菌液形成等邊三角形的3個頂點(圖1),平板中央接種約2 mm×2 mm的PH-1菌絲塊,于28 ℃培養(yǎng)3 d后測量計算抑菌率,以添加PDB培養(yǎng)基作為對照。每個處理接種3個平板,設置3次生物學重復。抑菌率=[(R平均值-r平均值)/R平均值]×100%。

圖1 平板對峙試驗Fig.1 Experimental illustration of flat plate confrontation

1.5 菌液和孢懸液的制備

XH-1菌液:挑取XH-1菌株于3 mL PDB培養(yǎng)基中28 ℃,180 r/min搖培8～12 h作為種子液,按1∶100(種子液∶培養(yǎng)基)的比例取種子液到新的PDB

培養(yǎng)基中搖培24 h后進行后續(xù)試驗。

PH-1的孢子懸浮液:將PH-1于PDA平板培養(yǎng)3 d,用黃色槍頭戳取6個菌絲塊置于50 mL 的CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中,于28 ℃、180 r/min 條件下?lián)u培5 d后收集分生孢子,并將孢子濃度調(diào)至1×106個/mL備用。

1.6 菌株XH-1對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

將XH-1菌液與1×106個/mL的PH-1孢子懸浮液按1∶1(體積比)混合,再向各混合液中加入等量的YEPD培養(yǎng)基,以無菌水與PH-1孢子懸浮液混合為對照,28 ℃、180 r/min搖培,分別在2、4、8、12和24 h時取培養(yǎng)液觀察分生孢子的萌發(fā)情況。

1.7 菌株XH-1對禾谷鐮刀菌侵染力的影響

接種前配制3份接種液,A液:PH-1孢子懸浮液與XH-1菌液按1∶1(體積比)混合;B液:PH-1孢子懸浮液與PDB液體培養(yǎng)基混合;C液:無菌水。

葉片戳傷接種:選取生長4周齡大小的小麥葉片,進行戳傷處理,在戳傷處分別接種6 μL的A、B、C液對接種后的葉片進行保濕處理,于27 ℃下暗培養(yǎng)24 h,之后進行光暗交替培養(yǎng)3～4 d后觀察葉片發(fā)病情況,每個處理接種15個傷口,設置3次生物學重復。

麥穗單花滴注接種:選取處于揚花期的小麥麥穗,分別在小穗中部小花接種A、B、C液,每個小花接種體積10 μL,每個處理接種3個小穗,并進行套袋保濕,1周觀察麥穗發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XH-1的分離與鑒定

前期通過采集健康的南麥660植株附近根際土壤,通過梯度稀釋后涂布于平板,對獲得的菌落進行分離純化(圖2-A),將純化后的菌株接與禾谷鐮刀菌共培養(yǎng),觀察PH-1的菌落生長情況。發(fā)現(xiàn)其中XH-1對PH-1的菌落生長具有抑菌作用。經(jīng)革蘭氏染色觀察,菌株XH-1為革蘭氏陽性菌,菌體為桿狀(圖2-B)。通過16S rDNA序列分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹,將XH-1鑒定為枯草芽孢桿菌(圖3)。

圖2 XH-1菌株形態(tài)Fig.2 Morphology of strain XH-1

圖3 XH-1系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of XH-1

2.2 菌株XH-1影響禾谷鐮刀菌生長

為探究枯草芽孢桿菌XH-1對禾谷鐮刀菌營養(yǎng)生長的影響,進行平板對峙試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于對照組,接種有XH-1的PDA培養(yǎng)基中PH-1菌落生長受到抑制(圖4),其抑制率為45.6%。表明枯草芽孢桿菌XH-1能抑制禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長,對禾谷鐮刀菌具有拮抗作用。

圖4 XH-1菌株對禾谷鐮刀菌的平板對峙分析Fig.4 Plate confrontation analysis of strain XH-1 against F. graminearum

2.3 菌株XH-1抑制禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢

為探究枯草芽孢桿菌XH-1對禾谷鐮刀菌孢子產(chǎn)量的影響,利用CMC產(chǎn)孢法,將XH-1加入CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中,同時加入PH-1菌絲塊,產(chǎn)孢 5 d后統(tǒng)計產(chǎn)孢量,以加入與XH-1等體積的PDA培養(yǎng)基為對照,每個處理設置3個技術重復,并進行3次生物重復。結(jié)果顯示,對照組平均產(chǎn)孢量為12.1×105個/mL,加入XH-1后PH-1的產(chǎn)孢量為0(圖5)。表明枯草芽孢桿菌XH-1能夠抑制禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢過程。

圖5 XH-1對禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effect of XH-1 on the spore production of F. graminearum

2.4 菌株XH-1抑制禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)過程

為探究枯草芽孢桿菌XH-1菌液對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響,將XH-1菌液加入PH-1孢子萌發(fā)誘導培養(yǎng)基YEPD中,以添加與XH-1菌液等體積的PDA培養(yǎng)基為對照,分別于培養(yǎng)2、4、8、12和24 h后觀察孢子萌發(fā)情況。通過顯微觀察,發(fā)現(xiàn)對照組的PH-1分生孢子從培養(yǎng)2 h后開始萌發(fā)產(chǎn)生液生菌絲(圖6-A),培養(yǎng)8 h后孢子的萌發(fā)率趨于穩(wěn)定(圖6-B)。而加入XH-1后,分生孢子的萌發(fā)被顯著抑制,且孢子出現(xiàn)異常膨大現(xiàn)象(圖6-A),直到24 h都沒有萌發(fā)產(chǎn)生液生菌絲。表明,添加XH-1菌液后能夠抑制禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)過程。

A:各時間段孢子萌發(fā)情況;B:孢子萌發(fā)率變化情況。A: Conidia germination at different time; B: The change of conidia germination rate.圖6 XH-1對孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of XH-1 on germination of conidia

2.5 菌株XH-1影響禾谷鐮刀菌的侵染力

為分析XH-1對禾谷鐮刀菌致病性的影響,對小麥葉片進行戳傷接種,分別接種PH-1與XH-1的混合液、PH-1、 ddH2O于小麥葉片上,接種4 d后觀察并統(tǒng)計發(fā)病情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種XH-1與 PH-1混合液的小麥葉片病斑較小(圖7-A),且不會向接種點外擴展,而接種PH-1的小麥葉片發(fā)病嚴重,接種無菌水的小麥葉片不發(fā)病。進一步通過對小麥麥穗進行單花滴注實驗,結(jié)果與葉片接菌結(jié)果一致,加入XH-1后PH-1的致病力顯著減弱(圖7-B)。結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌XH-1菌液能夠抑制禾谷鐮刀菌的致病力。

A:XH-1對PH-1侵染小麥葉片的影響;B:XH-1對PH-1侵染小麥穗部的影響。A: Effect of XH-1 on PH-1 infection of wheat leaves; B: Effect of XH-1 on PH-1 infection of wheat spike.圖7 XH-1對禾谷鐮刀菌侵染力的影響Fig.7 Effect of XH-1 on wheat leaves and ears infected by F. graminearum

3 討 論

小麥赤霉病的普遍發(fā)生給農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟損失[24],而禾谷鐮刀菌作為引發(fā)赤霉病的主要病原體,被列為第四大植物病原真菌[25]。一直以來,人們通常采用殺菌劑(如多菌靈等)對赤霉病進行化學防控,但這對環(huán)境也造成了一定的污染[26-27]。相比化學防治,生物防治具有無公害、無殘留、對人和動物安全等優(yōu)點,因此具有廣泛的應用前景[20]。生物防治是指利用生物有機體或其天然產(chǎn)物控制病蟲害的方法[28-29],芽孢桿菌是生物防治中使用最廣泛的微生物[30]。已有研究表明,芽孢桿菌可以產(chǎn)生表面活性素、豐原素和伊枯草菌素等脂肽抗菌物質(zhì),包括聚酮、氨基糖和磷脂在內(nèi)的非肽類抗菌化合物,細菌素等蛋白類活性物以及其他的能夠抑制病原菌生長的產(chǎn)物[31-35]。一些研究表明芽孢桿菌對小麥赤霉病有明顯的抑制作用,如抑制菌絲營養(yǎng)生長[17]、降低孢子萌發(fā)率或致畸[11-13]以及削弱病原菌的致病力[36]等。此外,已有研究表明芽孢桿菌被廣泛應用于作物土傳病害的防治中,如尖孢鐮刀菌引起的人參根腐病[37]和草莓鐮刀菌枯萎病[38]、致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病[39]等,因此芽孢桿菌具有良好的應用前景。本研究從小麥根部土壤中分離出1株對禾谷鐮刀菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株XH-1,經(jīng)過對該菌株的形態(tài)特征觀察、16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

生防菌XH-1與禾谷鐮刀菌一起培養(yǎng)時,可以抑制禾谷鐮刀菌的生長,使其菌絲無法向外自由延伸,并且XH-1還能抑制禾谷鐮刀菌分生孢子的產(chǎn)孢及萌發(fā),降低孢子萌發(fā)率,同時使孢子膨脹和畸形。已有研究表明,大部分枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)都能造成病原菌的細胞壁或細胞膜裂解,繼而使原生質(zhì)外泄,菌絲體崩解,這些抑菌物質(zhì)大多也都能抑制孢子萌發(fā)或者使已經(jīng)萌發(fā)的孢子變形[31, 40],這一結(jié)論與本研究結(jié)果相符?？梢?在生防菌XH-1的作用下,禾谷鐮刀菌無法正常生長和繁殖。但是XH-1菌株具體產(chǎn)生了哪些抑菌物質(zhì)來影響禾谷鐮刀菌的生長目前尚不明確,后續(xù)可對其抑菌物質(zhì)的組成和作用機理進行深入探究。此外,本研究還通過葉片及麥穗的接菌實驗發(fā)現(xiàn),XH-1能夠顯著削弱禾谷鐮刀菌對小麥的侵染能力,因此XH-1在小麥赤霉病的防治中,甚至在其他植物真菌病害的防治中可能會有廣泛的應用前景。但其具體的作用機制尚不明確,后續(xù)可深入探究其在禾谷鐮刀菌侵染進程中的作用機理以及對產(chǎn)毒的影響。

4 結(jié) 論

本研究從健康小麥周圍土壤中分離到對禾谷鐮刀菌具有拮抗作用的菌株XH-1,經(jīng)測序比對及系統(tǒng)發(fā)育分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌,該菌株對禾谷鐮刀菌的生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)、侵染力等過程均具有明顯抑制作用,因此該菌株具有良好的應用前景,可為小麥赤霉病的生物防治提供資源。