趙 科, 孫淑霞, 李 靖, 涂美艷, 王玲利, 何成勇, 徐子鴻, 江國良, 宋海巖, 陳 棟

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,成都 610066;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室,成都 610066)

【研究意義】四川大渡河流域是普通枇杷(EriobotryajaponicaL.)的發(fā)源地,枇杷栽培歷史悠久,種質(zhì)資源豐富。近年來,隨著實生選種[1]、芽變選種[2]和雜交育種[3-4]工作的快速發(fā)展[5],生產(chǎn)中枇杷新品種明顯增多,研發(fā)快速準(zhǔn)確的種質(zhì)資源鑒定方法對枇杷產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展具有重要意義。前人基于表型和地理分布的枇杷種質(zhì)資源鑒定和分類方式容易受栽培條件和生態(tài)環(huán)境等因素影響[6-7],而基于DNA序列差異開發(fā)的分子標(biāo)記檢測技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、檢測高效和操作簡便等優(yōu)勢[8],為研究植物表型與基因型之間的聯(lián)系提供了可靠工具。【前人研究進(jìn)展】微衛(wèi)星或簡單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記因具有共顯性遺傳、重現(xiàn)性、相對豐度、廣泛的基因組覆蓋、染色體特定位置和高通量基因分型等優(yōu)勢,在種質(zhì)資源鑒定領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[9]。近年來,育種家們圍繞枇杷種質(zhì)資源鑒定、倍性和果肉顏色等方面開發(fā)了系列分子標(biāo)記。孫鈞等[10]利用genic-SSR引物對14份白沙枇杷地方種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定,并與現(xiàn)有白沙枇杷地方品種建立品種鑒定圖(CID),為地方白肉枇杷種質(zhì)資源的鑒定與產(chǎn)業(yè)化利用提供了依據(jù);基于非整倍體材料基因劑量的不平衡效應(yīng),溫國[11]從枇杷基因組中開發(fā)出17個連鎖群的特異性非多態(tài)SSR標(biāo)記,并結(jié)合qPCR技術(shù)準(zhǔn)確檢測染色體的非整倍性;宋海巖等[12]基于不同果肉顏色枇杷EjPSY2A基因的序列差異開發(fā)出2對InDel分子標(biāo)記,準(zhǔn)確鑒別黃肉和白肉枇杷種質(zhì)資源及其EjPSY2A位點(diǎn)的顯隱性,對指導(dǎo)白肉枇杷早齡選擇育種具有重要意義。但由于枇杷基因組數(shù)據(jù)公布較晚[13-14],許多與分子標(biāo)記緊密連鎖的功能基因或片段未能被鑒定。DNA指紋圖譜技術(shù)是對不同種質(zhì)資源基因組DNA序列的組成和長度進(jìn)行識別,獲得其特有的圖紋組成[15],在種質(zhì)資源鑒定和功能基因定位等方面應(yīng)用廣泛[16]。目前已在枇杷中用于DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記有SSR[17]、ISSR[18]和SCoT[19]等。EST-SSR是基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)集合開發(fā)的SSR標(biāo)記,其開發(fā)成本低,功能基因識別率高,具備更高的使用價值[20-21],但目前關(guān)于枇杷EST-SSR標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用卻鮮有報道。【本研究切入點(diǎn)】國家西南特色園藝作物種質(zhì)資源圃(成都)現(xiàn)保存有國內(nèi)外枇杷屬種質(zhì)資源200余份,是西南地區(qū)保存枇杷種質(zhì)資源數(shù)量最多的綜合性園藝作物種質(zhì)資源圃。本研究利用國家西南特色園藝作物種質(zhì)資源圃(成都)枇杷育種與栽培創(chuàng)新團(tuán)隊前期從黃肉洞庭枇杷及其白肉突變體果實發(fā)育期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中開發(fā)出的覆蓋全基因組的277對EST-SSR標(biāo)記和1對果肉顏色相關(guān)Indel標(biāo)記[12, 22],對資源圃內(nèi)近年來收集保存的52份國內(nèi)外種質(zhì)和本團(tuán)隊創(chuàng)制的雜交后代開展遺傳多樣性分析并構(gòu)建DNA指紋圖譜?！緮M解決的關(guān)鍵問題】豐富枇杷種質(zhì)資源鑒定的分子標(biāo)記,為枇杷種質(zhì)資源鑒定和功能基因發(fā)掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地點(diǎn)

以國家西南特色園藝作物種質(zhì)資源圃(成都)枇杷育種與栽培創(chuàng)新團(tuán)隊(104°18′47″ E,30°37′09″ N,海拔489 m)保存的52份國內(nèi)外枇杷種質(zhì)資源及創(chuàng)制的雜交后代為試材,其中21份為我國枇杷主產(chǎn)區(qū)的主栽品種,4份為國外收集的枇杷品種資源,1份為野生枇杷資源(表1),所有種質(zhì)資源為8～10年生,株行距4 m×5 m,常規(guī)栽培管理措施。2021年5月收集枇杷幼嫩葉片用于DNA提取以及后續(xù)的基因分型工作。

表1 供試材料Table 1 Tested materials

1.2 枇杷DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)國家西南特色園藝作物種質(zhì)資源圃(成都)前期開發(fā)的覆蓋全基因組的277對EST-SSR標(biāo)記和1對果肉顏色相關(guān)Indel分子標(biāo)記設(shè)計并合成引物。用改良CTAB法提取枇杷gDNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測‘大五星’‘艷紅’‘白沙’‘新白8號’4個主栽品種的分子標(biāo)記多態(tài)性,用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳將篩選出條帶清晰、多態(tài)性良好的引物對52份枇杷種質(zhì)資源中進(jìn)一步驗證。PCR反應(yīng)體系:1.0 μL DNA模板,12.5 μL 2×PCR Mix(擎科),1.0 μL 10 μmol/L正反向引物,加ddH2O至25.0 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性1 min,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;72 ℃徹底延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增數(shù)據(jù)建立原始矩陣,應(yīng)用NTSYSpc 2.20v軟件計算Dice相似系數(shù),根據(jù)各種質(zhì)資源間的相似系數(shù)得到聚類分析圖。以數(shù)字代表引物,字母代表不同帶型,對不同引物擴(kuò)增出的帶型記錄編號。使用WPS軟件將每份枇杷種質(zhì)資源指紋圖譜上的數(shù)字或字母生成不同色塊,每一個色塊表示該枇杷種質(zhì)資源對應(yīng)引物擴(kuò)增出的基因型,豎條表示該枇杷種質(zhì)資源的指紋圖譜,橫條表示該引物擴(kuò)增的全部基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷種質(zhì)資源多態(tài)性引物篩選

利用‘大五星’‘艷紅’‘白沙’和‘新白8號’等4份材料,從278對引物中初步篩選出12對帶型清晰、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的引物,占4.32%,部分引物擴(kuò)增效果如圖1所示,引物信息如表2所示。隨后將12對引物擴(kuò)大到52份枇杷種質(zhì)資源中篩選出擴(kuò)增帶型穩(wěn)定并且不同樣品之間具有明顯差異的9對引物,分別為Ej77、Ej79、Ej85、Ej90、Ej115、Ej168、Ej171、Ej187和PSY2A-2。利用這9對引物對52份枇杷種質(zhì)資源擴(kuò)增,共獲得765個條帶,每對引物擴(kuò)增條帶數(shù)為2～5個,平均85個;多態(tài)性條帶比率為40.00%～100.00%,平均71.55%;多態(tài)性信息含量(PIC)為0.250～0.999,平均0.685,有7對引物的PIC大于0.550,可以用于后續(xù)聚類分析和DNA指紋圖譜的構(gòu)建。

表2 篩選出的12對可用于構(gòu)建指紋圖譜的分子標(biāo)記Table 2 12 pairs of molecular markers screened for use in constructing fingerprints

2.2 枇杷種質(zhì)資源聚類分析

52份枇杷種質(zhì)資源的平均遺傳相似系數(shù)為0.791(圖2);在相似系數(shù)D1=0.668處,可以將52份枇杷種質(zhì)資源分為2類,第Ⅰ類為2份西班牙種質(zhì)資源(‘培優(yōu)’和‘烏里拉’),遺傳相似系數(shù)為0.833,第Ⅱ類為剩余的50份枇杷種質(zhì)資源。在相似系數(shù)D2=0.756處,可以將第Ⅰ類進(jìn)一步劃分為3類,第ⅰ類為育成品種(包括‘艷紅’等)和創(chuàng)制的雜交后代(包括CB2-26等),共計38份種質(zhì)資源;第ⅱ類包括櫟葉枇杷和CB4-14等7份種質(zhì)資源;第ⅲ類包括‘早鐘6號’和W-4XC等5份種質(zhì)資源,其中2份日本枇杷種質(zhì)資源‘茂木’和日本紅肉的遺傳相似系數(shù)最大(0.977)。在相似系數(shù)D3=0.794處,可以將第ⅰ類種質(zhì)細(xì)分為3類,第1類為育成品種(包括‘艷紅’等)和創(chuàng)制的雜交后代(包括CB2-26等),共計19份黃肉枇杷種質(zhì)資源;第2類為‘大五星’、TBY(洞庭枇杷)、‘黃蜜’和‘大白梨’4份種質(zhì)資源,這4份種質(zhì)資源既有黃肉又有白肉類型,可能是栽培中較早出現(xiàn)果肉顏色分化的種質(zhì)資源;第3類為‘香種11號’‘新白7號’‘西蜀3號’‘新白8號’‘香妃’‘貴妃’‘白早鐘7號’‘軟條白沙’‘陽光白’‘冠玉’‘TBW’‘內(nèi)江白’‘78-1’和‘白早鐘5號’等14份白肉枇杷種質(zhì)資源。果肉顏色一致或地理分布相近的枇杷種質(zhì)資源被聚類到相近的分類單元中,可以準(zhǔn)確將西班牙、日本與其他種質(zhì)資源進(jìn)行區(qū)分。此外,聚類分析結(jié)果表明西南特色園藝作物種質(zhì)資源圃(成都)內(nèi)現(xiàn)保存的枇杷種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富,但利用‘艷紅’‘黃豐’等創(chuàng)制的雜交后代之間遺傳相似系數(shù)較高。

圖2 52份枇杷種質(zhì)資源的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 52 loquat germplasm resources

2.3 枇杷種質(zhì)資源DNA指紋圖譜

將引物Ej77、Ej79、Ej85、Ej90、Ej115、Ej168、Ej171、Ej187和PSY2A-2分別命名為1、2、3、4、5、6、7、8和9號,根據(jù)帶紋遷移率不同進(jìn)行分組,組內(nèi)的不同帶紋以字母表示,缺失記為D。以8號引物Ej187為例(圖3),1、2、3號樣品分別讀作8A、8A和8AB。將每份種質(zhì)資源的9對引物擴(kuò)增帶型用上述方法記錄,構(gòu)成指紋圖譜(表3)和色塊矩陣(圖4),24份枇杷種質(zhì)資源可以通過指紋圖譜區(qū)分,其中Ej90和Ej171可以特異性鑒別櫟葉枇杷和‘茂木’。

1～52的材料名稱見表1。1-52 meaning material names are the same as table 1.圖3 8號引物Ej187的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of primer No.8 Ej187

橫軸為種質(zhì)資源名稱(同表1);縱軸為引物名稱;1.Ej77;2.Ej79;3.Ej85;4.Ej90;5.Ej115;6.Ej168;7.Ej171;8.Ej187;9.PSY2A-2。 The horizontal axis is the name of germplasm resources(the same as table 1); The longitudinal axis is the primer name;1.Ej77; 2.Ej79; 3.Ej85; 4.Ej90; 5.Ej115; 6.Ej168; 7.Ej171; 8.Ej187; 9.PSY2A-2.圖4 52份枇杷種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜色塊矩陣Fig.4 Color block matrix of DNA fingerprints of 52 loquat germplasm resources

表3 52份枇杷種質(zhì)資源的數(shù)字DNA指紋圖譜Table 3 Digital DNA fingerprints of 52 loquat germplasm resources

3 討 論

DNA多態(tài)性是單一基因座等位基因變異性在群體水平的體現(xiàn)[23-24]。胡經(jīng)煌[25]利用構(gòu)建的群體開發(fā)多態(tài)性分子標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)1個新的抗白粉病基因Pm61。本研究篩選出擴(kuò)增帶型穩(wěn)定且不同品種之間具有明顯差異的9對引物。其中,Ej85是基于絲氨酸/蘇氨酸激酶基因Sapk1的表達(dá)序列標(biāo)簽開發(fā)的分子標(biāo)記,在櫟葉枇杷等13份種質(zhì)資源中出現(xiàn)了不同的帶型,該基因在水稻[26]和黑麥草[27]等作物中被證實與抗逆性密切相關(guān),表明不同枇杷種質(zhì)資源中Sapk1基因可能存在不同等位基因并導(dǎo)致抗逆性差異。

聚類分析結(jié)果可以為枇杷種質(zhì)資源的鑒定及核心種質(zhì)篩選提供依據(jù),平均遺傳相似系數(shù)越低表明樣本間的遺傳多樣性越豐富,樣本間遺傳相似系數(shù)越高親緣關(guān)系則越近[28-29]。范付華等[30-31]采用ISSR標(biāo)記構(gòu)建了39份貴州野生枇杷種質(zhì)資源的指紋圖譜,供試材料的遺傳相似性系數(shù)為0.40～0.98,在相似系數(shù)為0.70時,可將供試材料分成五大類。胡文舜等[32]采用SSR標(biāo)記構(gòu)建了19份枇杷雜交新品種的指紋圖譜,供試材料的遺傳相似性系數(shù)為0.728～0.969,平均相似系數(shù)為0.852。本研究中,保存于國家西南特色園藝作物種質(zhì)資源圃(成都)的52份枇杷種質(zhì)資源的相似系數(shù)為0.462～1.000,平均相似系數(shù)(0.791)介于野生枇杷種質(zhì)資源和育成品種之間,表明資源圃內(nèi)現(xiàn)保存的西南地區(qū)枇杷種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。但利用‘艷紅’和‘黃豐’等創(chuàng)制的雜交后代之間的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.986和1.000,今后還需要繼續(xù)引進(jìn)和收集國內(nèi)外不同產(chǎn)區(qū)的枇杷種質(zhì)資源豐富其遺傳背景。

本研究還將指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化和圖像化處理,其中24份枇杷種質(zhì)資源具備特異性DNA指紋圖譜,其余材料出現(xiàn)重復(fù),這可能是由于本研究僅選擇EST-SSR分子標(biāo)記且部分種質(zhì)資源親緣關(guān)系較近。胡文舜等[32]利用6對枇杷EST-SSR引物、6對枇杷gSSR引物、6對蘋果gSSR引物和1對梨gSSR引物構(gòu)建24個枇杷品種的SSR指紋圖譜,整合不同分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果后19個枇杷雜交新品種可以明確地相互區(qū)分。

4 結(jié) 論

52份枇杷種質(zhì)資源的平均相似系數(shù)(0.791)介于野生枇杷種質(zhì)資源和育成品種之間,表明西南地區(qū)枇杷種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結(jié)果顯示,果肉顏色一致或地理分布相近的枇杷種質(zhì)資源被聚類到相近的分類單元,該結(jié)果可以準(zhǔn)確地將西班牙、日本枇杷種質(zhì)資源與其他種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。本研究豐富了枇杷種質(zhì)資源鑒定的分子標(biāo)記,為今后發(fā)掘分子標(biāo)記緊密連鎖的功能基因或片段提供了研究基礎(chǔ)。