張曉潤,宋 爽,朱麗瑩,王文靜,陶 臻

(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院/南京市第一醫(yī)院感染性疾病科,江蘇 南京 210000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是一種在自然界廣泛存在的病原菌,在臨床上可以引起多種感染性疾病,如皮膚軟組織感染、血流感染和中樞神經系統(tǒng)感染等[1]。近年來,因全球范圍內廣譜抗菌藥物的過度使用,SA的耐藥率呈現不斷上升趨勢,除了耐藥基因的表達外,還有一個重要的原因是生物膜的形成。生物膜是細菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面后,被細菌自身分泌的胞外物質包裹而形成的細菌聚集膜樣物,可以保護細菌免受宿主免疫系統(tǒng)、抗菌藥物及物理機械壓力的影響[2]。SA生物膜相關感染往往會造成治療失敗以及復發(fā)性感染,不僅導致疾病的發(fā)病率和病死率上升,還會給全球經濟造成巨大的損失[3]。目前研究[4]表明,抗菌藥物在亞抑菌濃度(sub-MIC)下會對SA生物膜的形成產生影響,且不同抗菌藥物影響細菌生物膜形成的作用機制不同。因此,本綜述將對SA生物膜的形成過程及基因調控、不同抗菌藥物在sub-MIC下對SA生物膜形成的影響及作用機制進行概述,以期為臨床有效控制及治療SA生物膜相關感染提供一定依據。

1 sub-MIC的定義及意義

最低抑菌濃度(MIC)是抑制細菌生長的最低藥物濃度,敏感菌株在抗菌藥物濃度高于MIC時被抑制,而耐藥菌株則需要更高的抗菌藥物濃度才能被抑制,其上限被稱為防突變濃度(MPC),兩者之間的濃度集合被稱為突變選擇窗口(MSW)。MSW理論認為,耐藥突變菌株的選擇性富集只發(fā)生在MSW內,當抗菌藥物濃度低于MIC時,雖然治療無效但也不會導致耐藥菌的富集[5]。隨著研究人員對細菌耐藥機制的深入研究,進一步提出了sub-MIC和最小選擇濃度(MSC)的概念,補充了MSW理論。研究人員將野生型敏感菌和同源的耐藥菌按1∶1 的比例混合,當抗菌藥物濃度較低時,因耐藥菌存在適應性代價,故敏感菌具有生長優(yōu)勢;當抗菌藥物濃度增加時,耐藥菌逐漸克服適應性代價,兩者生長速度相同、適應性相同的藥物濃度即為MSC,當抗菌藥物濃度高于MSC但仍低于MIC時就可以選擇性富集耐藥突變菌株[6-7]。見圖1。因此,sub-MIC是指低于MIC但仍對細菌具有選擇作用的抗菌藥物濃度,由于藥物在體內濃度分布不同和藥物自身不良反應的影響,以及臨床長期應用抗菌藥物導致菌群MIC值升高,細菌不可避免會處于sub-MIC環(huán)境[8]。當菌群處于sub-MIC環(huán)境時,不僅可以富集預先存在的耐藥突變菌株,還可以通過增加適應性進化頻率來產生更高水平的耐藥突變,最終導致藥物治療失敗[9]。

圖1 細菌在sub-MIC選擇窗口和傳統(tǒng)突變選擇窗口中的生長[9]

2 SA生物膜的形成過程及基因調控

生物膜是細菌附著于表面后被自身分泌的胞外基質(ECM)包裹形成的結構性群落,ECM主要由胞外多糖(EPS)、胞外DNA(eDNA)、蛋白質、脂類和其他生物分子組成[10]。目前關于生物膜的研究主要以體外模型為主,盡管參與生物膜形成的分子成分因細菌種類不同而異,但廣泛認可的生物膜生長模型包括三個連續(xù)階段:黏附、聚集/成熟、分離/擴散[11]。隨著研究的深入,Moormeier等[12]借助微流控活細胞分析系統(tǒng)和延時顯微鏡實時觀察SA生物膜的發(fā)展過程,并提出了五階段生物膜生長模型,即黏附、聚集、外流、成熟、擴散。見圖2。接下來將對五個階段及相關基因調控進行概述。

圖2 SA生物膜生長模型

2.1 初始黏附 生物膜形成的第一步是浮游的SA黏附到生物或非生物表面。SA與生物表面之間主要通過一組N端含有信號肽序列、C端含有“LPXTG”模體(motif)的表面蛋白即細胞壁錨定蛋白進行黏附,其中一類與ECM成分結合的蛋白分子稱為識別黏附基質分子的微生物表面成分(MSCRAMMs)[13]。MSCRAMMs主要包括凝集因子A(ClfA)和凝集因子B(ClfB)、纖維蛋白結合蛋白A(FnBPA)和纖維蛋白結合蛋白B(FnBPB)、絲氨酸-天冬氨酸重復序列蛋白(Sdr)、骨唾液酸結合蛋白(Bbp)、膠原黏附素(Cna)等[14]。這些蛋白由其對應的基因編碼,可以促進細菌與生物表面進行特異性黏附。而SA與非生物表面之間則是通過靜電作用和疏水作用實現非特異性黏附[15]。除此之外,SA自身分泌的自溶素(atlA)亦有助于細菌在聚苯乙烯表面黏附[16]。

2.2 細胞聚集 完成初始黏附后的細菌在存在流體剪切力的情況下很容易脫離表面,因此,SA會產生多種因子幫助細胞聚集從而增加生物膜的穩(wěn)定性。首先,SA在黏附過程中產生的一些細胞外蛋白可以在最初附著后即發(fā)揮促進細胞聚集的作用,如FnBPA、FnBPB、ClfB和SdrC[17]。其次,多糖胞間黏附素(PIA)已被證明可以在SA生物膜形成的第二階段即細胞聚集中發(fā)揮重要作用[18]。PIA的合成主要受ica基因的調控,ica由四個功能基因(icaA、icaD、icaB、icaC)和一個調節(jié)基因(icaR)組成,其表達容易受環(huán)境條件(如高溫、高滲透壓、抗菌藥物等)的影響,因此,只有特定菌株或在特定條件下SA可以依賴PIA實現細胞聚集[19]。此外,研究[20]表明,SA可以通過烯醇化酶和甘油三醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在低pH值環(huán)境下使細胞自我裂解釋放eDNA和細胞質蛋白,從而促進細胞聚集。

2.3 早期外流 過去認為,SA與其他細菌一樣有著相似的生物膜形成過程[21],但研究人員通過延時顯微鏡對SA生物膜形成過程觀察后發(fā)現,在聚集階段開始后約6 h,細胞出現了明顯的釋放,即早期外流階段[12]。此階段主要由SA自身分泌的核酸酶(nuc)介導,nuc是一種熱穩(wěn)定的核酸內切酶,也是SA的一種重要毒力因子,可以降解生物膜的主要成分eDNA引起細胞早期外流[22]。SA nuc突變體缺少早期外流階段,同時也無法觀察到生物膜成熟所需的微菌落結構的形成[12]。因此,SA獨特的早期外流階段便于生物膜進行結構重建,進而形成更有利于生物膜發(fā)展的結構形態(tài)。

2.4 生物膜成熟 無論何種細菌,其生物膜成熟的關鍵都在于微菌落結構的形成[23],SA亦不例外。通過延時顯微鏡觀察SA生物膜形成發(fā)現,在生物膜成熟過程中,不斷有細菌脫離黏附,殘留在基底層的細胞則生成小簇菌落結構,即微菌落[13]。這些微菌落不斷解離和生成,使得生物膜高度結構化,以便于細菌進行營養(yǎng)交換與廢物排除[24]。在此過程中,SA主要通過一類具有表面活性劑性質的α-螺旋多肽兩性分子,即酚溶性調節(jié)蛋白(PSMs)實現生物膜成熟。PSMs可以破壞生物膜的非共價作用,使得生物膜結構得到修飾和重塑進而逐漸趨于成熟,而PSMs的表達則受Agr系統(tǒng)的嚴格調控[25]。

2.5 細胞擴散 生物膜積累成熟后,生物膜內的細胞可以通過擴散重新恢復到浮游狀態(tài),因此細胞擴散既是生物膜生長和發(fā)展過程的最后階段,也是另一個生長周期的開始[26]。此階段主要受機械力、表面活性劑PSMs以及降解生物膜基質分子酶(如蛋白酶等)的影響,因此細胞擴散很大程度上亦受Agr系統(tǒng)調控[27]。在Agr系統(tǒng)中,首先由啟動子P2、P3分別啟動RNA II和 RNA III的轉錄,然后再由RNA II編碼AgrA、AgrB、AgrC和AgrD蛋白,其中AgrD編碼自誘導肽前體(pre-AIP),在AgrB的作用下成熟為自誘導肽(AIP),當細胞外AIP濃度達閾值時,Agr系統(tǒng)被激活,AgrC結合AIP后使AgrA磷酸化,從而再反作用于P2、P3啟動子以及其他幾個轉錄靶點,調控相關細胞外蛋白酶的表達而促進生物膜擴散[28]。同時,AgrA還可以直接調控PSMs的表達,從而有助于生物膜的擴散[29]。

3 sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜形成的作用機制

sub-MIC抗菌藥物既可以促進生物膜形成,也可以抑制生物膜形成?，F已充分證實不同抗菌藥物在sub-MIC下影響SA生物膜形成[30-43],本文針對常見抗菌藥物對SA生物膜的影響進行概述。見表1。由于生物膜形成過程中涉及眾多基因及其復雜的調控機制,至今還無法將常用抗菌藥物與SA生物膜形成的作用靶點一一對應。因此,以下部分總結了目前sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜形成的作用機制。見圖3。

圖3 sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜形成的作用機制

3.1 改變初始黏附 初始黏附是生物膜形成的早期關鍵步驟。SA可以通過細胞表面蛋白與表面相互作用,也可以通過靜電作用和疏水作用與表面黏附。已有多項研究觀察到SA在sub-MIC抗菌藥物作用下,其表面蛋白含量(包括黏附相關蛋白)會發(fā)生變化。通過對氨芐西林誘導和非氨芐西林誘導的生物膜進行轉錄組學分析發(fā)現,SA在sub-MIC氨芐西林作用下,一些編碼表面蛋白基因以及黏附相關基因的表達會上調,有助于細菌形成生物膜[30]。同時,研究[34,40]表明,sub-MIC鏈霉素或諾氟沙星可以通過改變SA表面電荷和疏水性增加細菌與表面的初始黏附,促進生物膜的形成。

3.2 釋放eDNA 細菌生物膜主要由EPS、eDNA、蛋白質、脂類和其他生物分子組成[10]。在過去的生物膜研究中,EPS被認為是主要和最重要的組成部分,然而隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現eDNA在生物膜形成中發(fā)揮著重要作用[44]。由于生理、生長速率或細胞周期的不同,大多數細菌在抗菌藥物敏感性上會表現出一定的異質性,即一些細胞在抗菌藥物濃度低于MIC時就會死亡[45-46]。因此,sub-MIC抗菌藥物影響生物膜形成的另一種潛在機制可能是細胞死亡后eDNA的釋放。sub-MIC阿莫西林可以誘導SA eDNA的釋放而增加生物膜的形成[31]。eDNA除了可以直接釋放到細胞外空間促進生物膜形成外,還可以封閉在膜囊泡內參與生物膜的形成[47],如sub-MIC萬古霉素刺激SA生物膜形成的潛在機制是膜囊泡分泌的增加[39]。

3.3 調控Agr系統(tǒng) 群體感應系統(tǒng)(QS系統(tǒng))是細菌細胞間的一種通訊系統(tǒng),控制著許多基因的表達以響應群體密度[48],而Agr系統(tǒng)是SA QS系統(tǒng)的重要部分[49]。Agr系統(tǒng)在生物膜形成過程中起著至關重要的調控作用,因此,sub-MIC抗菌藥物可以通過直接影響Agr系統(tǒng)而影響SA生物膜的形成,也可以通過影響Agr系統(tǒng)調節(jié)下游基因的表達而影響生物膜的形成。例如,sub-MIC環(huán)丙沙星促進SA生物膜形成的作用機制是sub-MIC環(huán)丙沙星結合了AgrC受體,從而影響下游agrA、icaA及icaR基因的表達[41]。sub-MIC莫匹羅星則通過上調cidA的表達刺激SA生物膜的形成,故cidA的表達受到群體感應Agr系統(tǒng)的正向調節(jié)[50]。最近研究[51]表明,SA在sub-MIC左氧氟沙星和萬古霉素作用下可能引起Agr系統(tǒng)發(fā)生自發(fā)基因突變,刺激群體欺騙效應,導致生物膜形成的增加。

3.4 改變nuc活性 nuc是SA分泌的一種胞外核酸內切酶,主要由nuc1基因編碼,其不僅可以降解eDNA引起細胞早期外流從而促進生物膜的形成[22],還可以切斷中性粒細胞胞外陷阱(NET)的主干DNA從而實現免疫逃逸,避免NET對生物膜產生殺傷作用[52]。因此,sub-MIC抗菌藥物可以通過影響nuc活性從而影響SA生物膜的形成,如多西環(huán)素在sub-MIC下可抑制nuc活性,從而抑制SA生物膜的形成[53]。

3.5 觸發(fā)應激反應 為了在不同的環(huán)境條件下生長,SA可以利用高效的信號轉導系統(tǒng)調整細胞生理機能,從而響應環(huán)境刺激,這種信號轉導系統(tǒng)的一個關鍵轉錄因子是σB(SigB),其主要參與細菌的應激反應[54]。因此,sub-MIC抗菌藥物可以通過影響σB而影響應激反應的發(fā)生,從而調節(jié)SA生物膜的形成。如sub-MIC克林霉素可以替代σB,從而觸發(fā)細菌的應激反應,并上調生物膜相關基因如atlA、agrA、psm、fnbA和fnbB的表達,使得SA生物膜的形成增加[42]。

4 小結

sub-MIC抗菌藥物會影響SA的生物膜結構和基因表達,也會對細菌的毒力表達和耐藥性產生不同程度的影響。目前關于sub-MIC抗菌藥物作用下生物膜的相關研究大部分為體外研究,且樣本量較小,因而難免造成抽樣誤差的增加,使得研究結果的可靠性下降。因此,不同抗菌藥物在sub-MIC狀態(tài)下對SA生物膜的影響還存在爭議。同時,正如本綜述中所提到的,sub-MIC抗菌藥物影響SA生物膜是一個涉及多基因的復雜過程,雖然與之相關的研究很多,但大多數未闡明具體的作用機制。因此,對于sub-MIC抗菌藥物對SA生物膜形成的影響及相關機制還需要更多的研究進一步證明。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。