耿金 李濤 李偉 袁國(guó)良 王丙劍 章延春

隨著人口的老齡化以及心血管疾病患者的增多，心房顫動(dòng)（下稱(chēng)房顫）的發(fā)病率日益升高，其致死、致殘率較高，極大影響患者的生活質(zhì)量及生存率，同時(shí)增加家庭、社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。目前認(rèn)為房顫是一種慢性炎癥性疾病，以心房纖維化為主要特點(diǎn)，伴隨心房電活動(dòng)和結(jié)構(gòu)的紊亂。盡管關(guān)于房顫的研究很多，但其具體發(fā)病機(jī)制仍不詳，臨床中也缺乏有效的生物學(xué)標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤壞死因子受體3 相互作用蛋白2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 interacting protein 2，TRAF3IP2）調(diào)節(jié)多種炎癥因子信號(hào)通路，在動(dòng)脈粥樣硬化以及易損斑塊的形成中發(fā)揮重要作用[3]。近來(lái)有研究表明，TRAF3IP2 在小鼠心肌肥大和缺血再灌注模型中與心肌纖維化有因果關(guān)系[4-5]。本研究旨在探討TRAF3IP2 與房顫的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2021 年6 至12 月南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院收治的瓣膜性心臟病患者41 例，其中男17 例，女24 例，年齡40～76（58.68±10.70）歲。根據(jù)是否合并房顫，分為房顫組（22 例）和非房顫組（19 例）；其中有8 例患者轉(zhuǎn)至心臟外科行瓣膜置換或修復(fù)手術(shù)，房顫患者5 例，非房顫患者3 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）心臟彩超明確診斷為瓣膜性心臟病；（2）紐約心臟病協(xié)會(huì)（New York Heart Association，NYHA）心功能分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)；（3）年齡＜80 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性左心衰竭、心功能Ⅳ級(jí)；（2）重癥感染和活動(dòng)性風(fēng)濕熱；（3）甲狀腺功能紊亂；（4）嚴(yán)重的腎功能不全；（5）病態(tài)竇房結(jié)綜合征或其他需要起搏器治療的情況；（6）陣發(fā)性房顫。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 心臟超聲檢查 采用荷蘭飛利浦公司Epic7 彩超儀對(duì)所有患者行心臟彩超檢查，在入院3 d 內(nèi)完成，記錄左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimeter，LVEDd）、左心房直徑（left atrial dimeter，LAD）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 全血TRAF3IP2 表達(dá)水平檢測(cè) 所有患者入院當(dāng)天抽取靜脈血5 mL。采用DNA 提取試劑盒（中國(guó)凱基，KGA1206）按照說(shuō)明書(shū)提取全血DNA，簡(jiǎn)單步驟如下：全血RNA 以Trizol 試劑提取并以NanoDrop 2000 分光光度計(jì)定量。1 μg 的RNA 以cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為DNA。定量PCR 在Stepone Plus Real-Time PCR system 儀器（美國(guó)Bio-Rad）上進(jìn)行。DNA 的表達(dá)水平以2-ΔΔCt法分析。PCR 引物序列如下：GAPDH 正義鏈，5'-AGAACATCATCCCTGCCTCTACT-3'，反義鏈，5'-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3'；TRAF3IP2正義鏈，5'- ACCGTGATGATAATCGTAGCAATC -3'，反義鏈，5'-CTGTAGACATGAGTGTTCTGAAGC3 -3'。TRAF3IP2 結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.2.3 心房肌組織TRAF3IP2 表達(dá)水平檢測(cè) 8 例患者手術(shù)過(guò)程中在左心耳的適當(dāng)部位取少許心房肌組織，-80 ℃冰箱保存行后續(xù)檢測(cè)。采用免疫組化法，心房肌組織標(biāo)本以甲醛固定，無(wú)水乙醇脫水后制備石蠟切片。石蠟切片脫水后，以2%胎牛血清孵育30 min，以TRAF3IP2 一抗（美國(guó)Santa Cruze，sc-398161）4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 沖洗后，以二抗孵育30 min，并以蘇木精復(fù)染細(xì)胞核5 min，脫水后封片。TRAF3IP2 的表達(dá)水平采用Image Pro Plus 軟件以整合光密度值分析。

1.2.4 心房肌組織膠原含量檢測(cè) 標(biāo)本同1.2.3，采用馬松染色，按照試劑盒（中國(guó)凱基，KGMST-8004）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，簡(jiǎn)單步驟如下：石蠟切片脫水后以蒸餾水清洗，以蘇木精染核5 min，充分水洗后以麗春紅染色液染色5 min，冰醋酸溶液和磷鉬酸溶液清洗后，以苯胺藍(lán)染色液染色5 min，脫水后封片。采用Image Pro Plus 軟件分析心房肌組織膠原含量，評(píng)估其纖維化程度。

1.2.5 心房肌組織TRAF3IP、α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 標(biāo)本同1.2.3，采用Western blotting 法。以全蛋白提取試劑盒（中國(guó)凱基，KGP250）提取組織蛋白，BCA 法定量蛋白濃度。在配好的膠中加入蛋白樣品后電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。脫脂牛奶封閉該膜后以TRAF3IP2一抗（美國(guó)Santa Cruze，sc-398161）和α-SMA 一抗（美國(guó)Santa Cruze，sc-32313）4 ℃孵育過(guò)夜，以二抗孵育30 min 后ECL 法顯影，以GAPDH（美國(guó)Santa Cruze，sc-47724）作為參照蛋白。采用Image J 軟件定量分析TRAF3IP、α-SMA 蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0 分析軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。對(duì)LAD 進(jìn)行分層分析，采用Spearman 直線(xiàn)相關(guān)法分析TRAF3IP2 與LAD 的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者年齡、性別、伴隨疾病、LVEDd、LVEF 及生化指標(biāo)等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。房顫組LAD、LAD＞3.5 mm的比例及TRAF3IP2 表達(dá)水平均大于非房顫組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 LAD 與TRAF3IP2 表達(dá)水平的相關(guān)性分析和分層分析 相關(guān)性分析顯示，LAD 與TRAF3IP2 表達(dá)水平呈直線(xiàn)相關(guān)（r=0.33，P=0.037），見(jiàn)圖1。分層分析顯示，LAD＜3.5 mm 者及LAD＞3.5 mm 者中，房顫患者的TRAF3IP2 表達(dá)水平均高于非房顫患者（均P＜0.01），見(jiàn)表2。

圖1 LAD 與TRAF3IP2 表達(dá)水平相關(guān)性分析的散點(diǎn)圖

表2 不同LAD 患者TRAF3IP2 表達(dá)水平比較

2.3 兩組患者心房肌組織膠原含量和TRAF3IP2、α-SMA 蛋白表達(dá)水平比較 8 例患者于心臟外科行瓣膜置換術(shù)或修復(fù)術(shù)，其中非房顫組3 例，房顫組5 例。馬松染色顯示房顫組心房肌組織膠原含量高于非房顫組（P＜0.01），免疫組化染色顯示房顫組心房肌組織TRAF3IP2 蛋白表達(dá)水平高于非房顫組（P＜0.01），見(jiàn)圖2A、B。Western blotting 法顯示房顫組左心房組織的TRAF3IP2 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平均高于非房顫組（均P＜0.01），見(jiàn)圖2C、D。

3 討論

TRAF3IP2 是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的銜接蛋白，能直接與TNF-α、IL-1 等結(jié)合，通過(guò)激活其下游的JNK 和NF-κB 通路調(diào)節(jié)炎癥因子的合成與分泌、參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，目前關(guān)于TRAF3IP2 的研究多在動(dòng)物和細(xì)胞模型中進(jìn)行。部分研究表明，TRAF3IP2在動(dòng)脈粥樣硬化以及易損斑塊的形成中發(fā)揮重要作用[3]，其潛在機(jī)制可能是通過(guò)TRAF3IP2 參與泡沫細(xì)胞的形成、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移、增殖[6-8]。近期，Sakamuri 等[4]以醛固酮皮下注射小鼠構(gòu)建心肌肥大模型，發(fā)現(xiàn)心肌的TRAF3IP2表達(dá)水平明顯升高，抑制TRAF3IP2 的表達(dá)后小鼠心肌肥大的程度減輕，同時(shí)心肌纖維化的程度也得到了抑制。在小鼠缺血再灌注模型中，心肌TRAF3IP2的表達(dá)水平同樣明顯升高，而敲除TRAF3IP2 基因后，小鼠心肌梗死面積以及纖維化程度均明顯減少[5]。進(jìn)一步的研究表明，TRAF3IP2 通過(guò)JNK 通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移，且促進(jìn)其分泌各型膠原最終誘導(dǎo)纖維化[9]。這些動(dòng)物和細(xì)胞的研究結(jié)果均表明，TRAF3IP2 作為一種炎癥相關(guān)蛋白，廣泛參與了動(dòng)脈粥樣硬化、心肌重構(gòu)和心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展。TRAF3IP2 在人體中同樣廣泛表達(dá)，但健康狀態(tài)表達(dá)量較低，病理狀態(tài)下表達(dá)則明顯升高[10]。目前尚缺乏TRAF3IP2 與人類(lèi)心血管疾病相關(guān)性的研究數(shù)據(jù)。

心房肌纖維化是心房顫動(dòng)的主要特征之一，因此TRAF3IP2 可能參與房顫進(jìn)展。為驗(yàn)證該假說(shuō)，本研究入選瓣膜病房顫患者，發(fā)現(xiàn)房顫患者的TRAF3IP2表達(dá)水平較非房顫患者明顯升高，此外，TRAF3IP2 表達(dá)水平與患者LAD 呈直線(xiàn)相關(guān)，由于房顫患者的左心房顯著大于非房顫患者，因此行分層分析以校正其對(duì)結(jié)果的影響。最終發(fā)現(xiàn)TRAF3IP2 表達(dá)水平與房顫的相關(guān)性不受左心房大小的影響。有部分患者行外科手術(shù)，術(shù)中取其左心耳心房肌組織行馬松染色、免疫組化及Western blotting，發(fā)現(xiàn)房顫患者心房肌組織的TRAF3IP2 表達(dá)水平和纖維化程度高于非房顫患者，這些結(jié)果表明TRAF3IP2 表達(dá)水平可能與心房肌的纖維化相關(guān)，進(jìn)而參與房顫的進(jìn)展。根據(jù)本研究的結(jié)論，推測(cè)在房顫發(fā)展過(guò)程中TRAF3IP2 通過(guò)調(diào)節(jié)心肌纖維化參與房顫的進(jìn)展，但尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究在臨床標(biāo)本中證實(shí)TRAF3IP2 與房顫存在相關(guān)性，但由于樣本量較小，且并未行動(dòng)物以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確TRAF3IP2 與房顫的因果關(guān)系，因此仍需更多的臨床以及基礎(chǔ)研究證實(shí)本結(jié)論。