宋志遠(yuǎn)，任洪波，韓曉正，牛國(guó)棟

邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外三科，河北 邯鄲 056009

垂體瘤是僅次于腦膜瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的第三常見(jiàn)顱內(nèi)腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的10%～15%［1］。盡管大多數(shù)垂體瘤是良性和生長(zhǎng)緩慢的惡性腫瘤，但患者可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的頭痛、視覺(jué)問(wèn)題和激素相關(guān)癥狀［2］。一些垂體瘤具有侵襲性，可導(dǎo)致嚴(yán)重的癥狀甚至死亡。垂體瘤發(fā)生發(fā)展的病因和機(jī)制尚不清楚，闡明垂體瘤的發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制有助于其早期發(fā)現(xiàn)、治療和改善患者的預(yù)后。微小RNA（miRNA）是一類17～27個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，miRNA作為機(jī)體內(nèi)在調(diào)節(jié)因子，參與包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一些系列細(xì)胞生理過(guò)程。越來(lái)越多的研究［3］表明，miRNA可以通過(guò)與靶基因的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）特異性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。研究［4］顯示，垂體瘤中miRNA的異常失調(diào)可能參與垂體瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-21是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞增殖分化有關(guān)的miRNA家族成員。既往研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，miR-21在垂體瘤組織細(xì)胞和血漿中表達(dá)異常升高，并且與垂體瘤的侵襲性相關(guān)，但miR-21對(duì)垂體瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制尚不明確。第10號(hào)染色體丟失的張力蛋白同源磷酸酶基因（PTEN）是目前研究較多的公認(rèn)的抑癌基因之一，既往研究［7-8］顯示miR-21能靶向PTEN參與包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的機(jī)體細(xì)胞功能的調(diào)控。2022年2月—2022年10月，我們觀察了miR-21低表達(dá)對(duì)垂體瘤細(xì)胞系RC-4BC增殖、凋亡的影響，并分析其與PTEN的靶向關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑 人垂體瘤細(xì)胞系RC-4BC購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心?？俁NA提取試劑TRIzol購(gòu)自北京天根公司；PCR引物、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR熒光定量試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為公司；miR-21模擬物miR-21 mimics、模擬物陰性對(duì)照NC-mimics、miR-21抑制物miR-21 inhibitor、抑制物陰性對(duì)照NC-inhibitor、野生型PTEN熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PTEN-WT、突變型PTEN熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒PTEN-MUT購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 RC-4BC細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10% FBS），在5%二氧化碳、37℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)基一次。轉(zhuǎn)染操作時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RC-4BC細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞板，按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作分別將miR-21抑制物miR-21 inhibitor、抑制物陰性對(duì)照NC-inhibitor轉(zhuǎn)染至RC-4BC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞標(biāo)記為兩組：沉默組（轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染 NC-inhibitor），轉(zhuǎn)染后12 h更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 兩組細(xì)胞中miR-21、PTEN mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。TRIzol試劑提取兩組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度合格。取總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，加入PCR引物，應(yīng)用RT-PCR熒光定量試劑盒配置反應(yīng)體系，進(jìn)行進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR引物序列：miR-21正向引物為5′-GCCGCTAGCTTATCAGACT-3′，反向引物為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；U6正向引物為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；PTEN正向引物為5′-AAAACAGTAGAGGAGCCGTCAAATC-3′，反向引物為5′-AAAACAGTAGAGGAGCCGTCAAATC-3′；GAPDH正向引物為5′-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3′，反向引物為5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s）。miR-21以U6作為內(nèi)參基因，PTEN以GAPDH作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中受檢基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 兩組細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK8實(shí)驗(yàn)。取兩組RC-4BC細(xì)胞，采用胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，以每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞板中，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)向每孔加入10 μL CCK溶液，在37 ℃繼續(xù)孵育2 h，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)490 nm的OD值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。

1.5 兩組細(xì)胞集落形成能力觀察 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。取兩組RC-4BC細(xì)胞，采用胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，以每個(gè)培養(yǎng)皿200個(gè)細(xì)胞的密度接種到含10 mL培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在5%二氧化碳、37 ℃的恒溫環(huán)境中孵育14 d后，肉眼可見(jiàn)細(xì)胞集落，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，染色細(xì)胞20 min，去除染色液，室溫下干燥，顯微鏡下計(jì)數(shù)集落形成數(shù)，以大于50個(gè)細(xì)胞的集落表示為一個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)。

1.6 兩組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。取兩組RC-4BC細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，PBS洗滌3遍，加入結(jié)合液500 μL重懸細(xì)胞，避光加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，再加入PI 5 μL，充分混勻后，室溫孵育15 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 兩組細(xì)胞周期分布情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取兩組RC-4BC細(xì)胞，PBS洗滌2遍，加體積分?jǐn)?shù)70%的預(yù)冷乙醇固定，4 ℃固定24 h后，1000 r/min離心5 min分離乙醇，去上清，PBS洗滌3遍，加適量RNaseA，37 ℃水浴30 min后加入適量PI混勻，4 ℃避光染色30 min，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)G0/G1期、S期細(xì)胞占比。

1.8 miR-21與PTEN的靶向關(guān)系驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。收集RC-4BC細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，接種于12孔板，按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作分別將miR-21 mimics或NC-mimics與PTEN-WT或PTEN-MUT共轉(zhuǎn)染至RC-4BC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞標(biāo)記為四組：miR-21 mimics+PTEN-WT組、NC-mimics+PTEN-WT組、miR-21 mimics+PTEN-MUT組、NC-mimics+PTEN-MUT組。轉(zhuǎn)染24 h后收集并裂解各組細(xì)胞，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞中miR-21、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 沉默組RC-4BC細(xì)胞中miR-21、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.30 ± 0.08、2.89 ± 0.14，陰性對(duì)照組RC-4BC細(xì)胞中miR-21、PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01 ± 0.02、0.99 ± 0.03，兩組相比，P均＜0.05。

2.2 兩組細(xì)胞增殖能力比較 沉默組RC-4BC細(xì)胞24 h、48 h、72 h時(shí)OD值分別為0.40 ± 0.11、0.77 ±0.13、1.51 ± 0.15，陰性對(duì)照組RC-4BC細(xì)胞24 h、48 h、72 h時(shí)OD值分別為0.69 ± 0.08、1.50 ± 0.18、2.81 ± 0.26，兩組相比，P均＜0.05。

2.3 兩組細(xì)胞集落形成數(shù)目比較 沉默組RC-4BC細(xì)胞集落形成數(shù)為（108 ± 18）個(gè)，陰性對(duì)照組RC-4BC細(xì)胞集落形成數(shù)目為（215 ± 29）個(gè)，兩組相比，P＜0.05。

2.4 兩組細(xì)胞凋亡率比較 沉默組RC-4BC細(xì)胞凋亡率為22.30% ± 5.64%，陰性對(duì)照組RC-4BC細(xì)胞凋亡率為5.59% ± 2.08%，兩組相比，P＜0.05。

2.5 兩組細(xì)胞周期分布情況比較 沉默組RC-4BC細(xì)胞G0/G1期占比65.65% ± 7.82%、S期占比19.25% ± 3.70%，陰性對(duì)照組RC-4BC細(xì)胞G0/G1期占比45.62% ± 5.03%、S期占比35.72% ± 4.67%，兩組相比，P均＜0.05。

2.6 miR-21與PTEN的靶向關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果miR-21 mimics+PTEN-WT組、NC-mimics+PTEN-WT組、miR-21 mimics+PTEN-MUT組、NC-mimics+PTEN-MUT組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性分別為0.39 ± 0.07、1.02 ± 0.03、1.01 ± 0.04、1.00 ±0.03，其中miR-21 mimics+PTEN-WT組相對(duì)熒光素酶活性與其他各組相比，P均＜0.05，提示miR-21的靶基因是PTEN。

3 討論

垂體瘤是常見(jiàn)顱內(nèi)腫瘤之一，影響患者的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、學(xué)習(xí)和工作能力。由于其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，垂體瘤的治療是一個(gè)臨床難題。目前垂體瘤的治療通常包括手術(shù)、藥物和放射治療，這些治療方法的目的是減少或消除腫瘤占位性病變的影響，糾正腫瘤分泌過(guò)多的激素，并保持正常的垂體功能。然而，垂體瘤手術(shù)后的復(fù)發(fā)率很高，還可能會(huì)導(dǎo)致尿崩癥、腦脊液滲漏、視力障礙惡化和腦癱等手術(shù)后并發(fā)癥。因此，探索調(diào)控垂體瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的基因通路，開(kāi)發(fā)新的有效治療方法很重要。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在各種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)。miRNA被認(rèn)為有望成為診斷和治療各種疾病的新靶點(diǎn)。2005年BOTTONI等［9］人首次研究并報(bào)道了垂體瘤和miRNA之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-15a和miR-16-1在垂體瘤中的表達(dá)水平較正常垂體組織低。近年來(lái)相繼研究［10］發(fā)現(xiàn)許多miRNA可能與垂體瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但目前研究尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在垂體瘤發(fā)生進(jìn)展中起關(guān)鍵作用的miRNA。miR-21是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老等生命過(guò)程有關(guān)的miRNA家族成員之一，在腫瘤的生長(zhǎng)中可能起著重要作用［11］。在腫瘤細(xì)胞的研究［12］顯示，miR-21在大多數(shù)腫瘤中表達(dá)上調(diào)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的高致癌特性，并且與腫瘤的化療耐藥有關(guān)。近期AMARAL等［5］發(fā)現(xiàn)，垂體瘤手術(shù)樣本中miR-21的表達(dá)明顯高于從尸檢中獲得正常垂體組織標(biāo)本。郝良超等［6］還發(fā)現(xiàn)，在侵襲性垂體瘤患者瘤組織和血漿中miR-21的表達(dá)水平明顯高于非侵襲性垂體瘤患者。但目前有關(guān)miR-21在垂體瘤中的研究仍較少，并且其作用機(jī)制并不明確。為了探討miR-21在垂體瘤發(fā)生發(fā)展中的可能的作用機(jī)制，本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功沉默了miR-21表達(dá)水平最高的垂體瘤細(xì)胞系RC-4BC細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)介紹發(fā)現(xiàn)，沉默miR-21表達(dá)的RC-4BC細(xì)胞，24、48、72 h時(shí)OD值明顯下降，集落形成能力明顯降低，細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期G0/G1占比明顯升高，S期占比明顯下降，說(shuō)明沉默miR-21表達(dá)能夠抑制垂體瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。

通過(guò)調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，從而影響靶基因的功能，是目前發(fā)現(xiàn)的miRNA調(diào)控的主要機(jī)制。PTEN位于人染色體10q23.31染色體上，是目前研究較多的公認(rèn)的抑癌基因之一，PTEN通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮著調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程［13］。目前有關(guān)PTEN在垂體瘤中的研究較多，研究［14-16］發(fā)現(xiàn)垂體瘤組織中PTEN的表達(dá)明顯降低，并且與垂體瘤的侵襲性相關(guān)。大量的研究［17-20］已經(jīng)證實(shí)，過(guò)表達(dá)垂體瘤細(xì)胞中PTEN基因，可顯著抑制瘤細(xì)胞的增殖及遷移侵襲能力，并能夠促進(jìn)瘤細(xì)胞的凋亡。本研究中，我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沉默miR-21表達(dá)的垂體瘤細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)明顯升高，雙熒光素酶報(bào)告基因顯示miR-21能夠靶向PTEN基因從而影響熒光素酶活性，提示沉默miR-21表達(dá)對(duì)垂體瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可能與其對(duì)PTEN基因的靶向調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，沉默miR-21能夠抑制垂體瘤細(xì)胞增殖活性及集落形成能力，將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與其對(duì)PTEN基因的靶向調(diào)控有關(guān)，為垂體瘤的治療提供了新的研究思路。