丁文艷,陳亞軍,王 平

1.南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院檢驗科,江蘇南京 210004;

2.江蘇省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,江蘇南京 210009

宮頸癌(CESC)是威脅女性健康的常見婦科惡性腫瘤,發(fā)病率僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌[1]。腫瘤細胞侵襲力強、惡性程度高、易復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是限制CESC療效和影響預(yù)后的主要因素[2]。結(jié)合CESC患者的臨床病理特征,尋找新型有效的生物標志物來預(yù)測CESC不良預(yù)后,對指導(dǎo)臨床治療策略、監(jiān)測復(fù)發(fā)、提高療效具有十分重要的意義。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶 4(PFKFB4)基因編碼的蛋白質(zhì)通過糖酵解的變構(gòu)調(diào)節(jié)來調(diào)控糖酵解和磷酸戊糖途徑代謝通量,以滿足腫瘤細胞惡性增殖的生物需求,因此,PFKFB4可作為惡性腫瘤的預(yù)后標志物及潛在的治療靶標,具有較高的臨床研究價值[3]。CXC趨化因子配體8(CXCL8)作為一種重要的多功能趨化細胞因子,以自分泌或旁分泌的方式與腫瘤微環(huán)境中的細胞相互作用,促進腫瘤細胞的生長、侵襲、遠處轉(zhuǎn)移及血管生成,基于此CXCL8有望成為某些惡性腫瘤具有預(yù)后評估價值的分子靶標[4]。本研究通過檢測CESC組織中PFKFB4、CXCL8的表達水平,分析PFKFB4、CXCL8表達水平與CESC患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性,旨在明確二者在CESC患者不良預(yù)后評估中的臨床價值,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12在南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院(以下簡稱本院)接受根治性手術(shù)的62例CESC患者作為研究對象;年齡36～70歲,平均(54.34±8.87)歲;TNM分期:Ⅰa/Ⅰb期38例,Ⅱa期24例;腫瘤最大徑≤3 cm 44例,>3 cm 18例;分化程度:低分化24例,中/高分化38例;宮頸浸潤深度≥2/3 26例,宮頸浸潤深度<2/3 36例;病理類型:鱗癌50例,非鱗癌12例。納入標準:(1)參照《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》,經(jīng)陰道鏡檢查、宮頸組織活檢、術(shù)后病理學確診為CESC;(2)入組前未接受CESC相關(guān)放、化療和免疫治療;(3)臨床資料和隨訪資料完整。排除標準:(1)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者;(2)合并心、肝、腎等器官功能不全者;(3)合并認知障礙及精神性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準并獲得患者知情同意。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法檢測PFKFB4、CXCL8蛋白表達 采用免疫組織化學SP法(上海經(jīng)科化學科技有限公司)檢測PFKFB4、CXCL8蛋白表達水平。手術(shù)獲取宮頸癌組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。將腫瘤組織以10%甲醛溶液固定、脫水、包埋后,制成4～5 μm石蠟切片。PFKFB4和CXCL8抗體均購于Abcam公司(稀釋度1∶200)。二氨基聯(lián)苯顯色后,蘇木精復(fù)染,以組織細胞核或細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒判定為PFKFB4和CXCL8蛋白陽性表達。染色強度評分如下:0分(組織無著色);1分(組織呈淡黃染色);2分(組織呈棕黃染色);3分(組織呈棕褐染色)。陽性細胞占比如下:0分(<5%),1分(5%～25%),2分(>25%～50%),3分(>50%～75%),4分(>75%)。以細胞染色強度與陽性細胞占比乘積>6分為高表達,0～5分為低表達。

1.2.2CESC患者隨訪 隨訪時間為3年。隨訪采用門診復(fù)診或電話回訪方式,以首次手術(shù)日期為隨訪開始時間,隨訪截止時間為2022年12月30日。將CESC患者術(shù)后復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移或死亡定義為預(yù)后不良。

1.2.3基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫分析PFKFB4、CXCL8基因在CESC中的表達 從GEPIA在線網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)上獲取306例CESC組織和13例正常對照組織中PFKFB4、CXCL8的表達情況。

1.2.4Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對PFKFB4、CXCL8基因與CESC患者預(yù)后的相關(guān)性分析 利用Kaplan-Meier Plotter平臺(http://www.kmplot.com)分析不同PFKFB4和CXCL8表達水平CESC患者生存情況,組間比較采用Log-rank檢驗。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率[n(%)]表示,采用χ2檢驗進行兩組間比較。采用多因素Logistic回歸模型分析CESC不良預(yù)后的危險因素,采用受試者工作特征(ROC)曲線對CESC不良預(yù)后模型的預(yù)測效能進行評價,采用Kaplan-Merier生存曲線及Log-rank檢驗比較生存情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1不同PFKFB4、CXCL8表達水平CESC患者生存情況比較 通過GEPIA在線數(shù)據(jù)庫對306例CESC組織和13例正常對照組織中PFKFB4、CXCL8表達水平進行分析,結(jié)果顯示,CESC組織中PFKFB4和CXCL8表達水平高于正常對照組織(P<0.05),見圖1。Kaplan-Meier曲線生存分析表明,隨著PFKFB4和CXCL8表達水平升高,CESC患者生存率降低,差異有統(tǒng)計學意義(Log-rankP=0.028、1.5×10-5),見圖2。PFKFB4和CXCL8的風險比(HR)分別為1.7、2.9(HR>1為疾病的危險因素),提示PFKFB4和CXCL8高表達是CESC患者不良預(yù)后的危險因素。

注:*P<0.05。

圖2 不同PFKFB4和CXCL8表達水平CESC患者生存情況比較

2.2PFKFB4、CXCL8表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 CESC患者的臨床病理參數(shù)中,PFKFB4、CXCL8表達水平在不同TNM分期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而PFKFB4、CXCL8表達水平在不同年齡、腫瘤最大徑、肌層浸潤及病理類型CESC患者中比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)CESC患者PFKFB4、CXCL8表達水平比較[n(%)]

2.3CESC患者不良預(yù)后的多因素分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示,TNMⅡa期、腫瘤低分化程度、宮頸浸潤深度≥2/3、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PFKFB4、CXCL8高表達是CESC患者不良預(yù)后的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響CESC不良預(yù)后的危險因素分析

2.4CESC不良預(yù)后風險預(yù)測模型評分規(guī)則及ROC曲線驗證 采用參考邏輯評分法,將CESC不良預(yù)后風險預(yù)測模型轉(zhuǎn)化為風險評分體系。依據(jù)Logistic回歸方程中最小的偏回歸系數(shù)(1.310)為基數(shù),賦值為1分,其他變量賦值得分為每個自變量的偏回歸系數(shù)除以最小的偏回歸系數(shù)所的數(shù)值,取整數(shù)部分,總計評分為0～7分,其中,0～2分為低風險,3～5分為中風險,6～7分為高風險。采用ROC曲線對CESC不良預(yù)后風險預(yù)測模型的能力進行評估,AUC為0.872(95%CI:0.763～0.943,P<0.001),見圖3及表3。以Youden指數(shù)最大值為最佳臨界點,該預(yù)測模型靈敏度為0.925 9,特異度為0.828 6,提示該模型對CESC不良預(yù)后風險預(yù)測效果較好。

表3 CESC不良預(yù)后風險評分

注:預(yù)警模型由TNM分期、分化程度、宮頸浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PFKFB4表達、CXCL8表達共6項指標構(gòu)建。

3 討 論

CESC發(fā)生發(fā)展是由多基因、多因素參與的復(fù)雜的病理生理過程,宮頸上皮細胞的非典型增生導(dǎo)致原位癌的形成,CESC在晚期表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性的惡性攻擊性行為,且部分CESC患者對化療不敏感,總體預(yù)后較差,5年生存率相對較低[5-7]。因此,結(jié)合CESC的分子生物學特征和組織病理學特征,迫切需要尋找敏感性好、特異性高的生物標記物,早期預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后,以獲得更好的治療策略,對CESC患者進行指導(dǎo)治療。有報道顯示,PFKFB4基因促進小細胞肺癌的化療耐藥與不良預(yù)后關(guān)系密切,是小細胞肺癌潛在的治療靶點及化療敏感性的預(yù)測因子[8]。另一項研究表明,膀胱癌組織中PFKFB4基因高表達,誘使腫瘤細胞代謝異常,沉默PFKFB4基因表達或使用PFKFB4基因的阻斷劑有望成為膀胱癌新型的治療策略,這為膀胱癌的治療提供新的研究方向[9]。HAN等[10]研究發(fā)現(xiàn),CXCL8基因表達與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞基質(zhì)血管化密切相關(guān),由此促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,這在一定程度上解釋了CXCL8基因具有預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。

本研究從生物信息學分析及組織層面分析了PFKFB4和CXCL8的表達水平及其與CESC的臨床病理特征的緊密關(guān)系。在線GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示,CESC組織中PFKFB4和CXCL8表達水平顯著高于正常對照組織。然而,GEPIA在線網(wǎng)站并未提供306例CESC組織的臨床病理特征,為了彌補GEPIA在線網(wǎng)站的不足之處,本研究對62例CESC患者組織中PFKFB4和CXCL8表達水平與CESC患者臨床病理特征(包含年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤及病理類型)的關(guān)系進行分析。本研究結(jié)果表明,過表達PFKFB4和CXCL8與CESC患者TNM Ⅱa期、腫瘤低分化程度、宮頸浸潤深度≥2/3及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。生存曲線分析結(jié)果顯示,隨著PFKFB4和CXCL8表達水平升高,患者的生存率降低。本研究將PFKFB4和CXCL8與CESC進展聯(lián)系起來,并將PFKFB4和CXCL8高表達作為CESC患者不良預(yù)后的重要危險因素。PFKFB4參與了CESC的發(fā)生發(fā)展,可能與PFKFB4在許多實體腫瘤中過表達,通過加強腫瘤細胞的糖酵解通量,調(diào)控自噬形成和細胞周期進程,促進血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過程有關(guān)[11-13]。由此推測,PFKFB4在CESC進展中發(fā)揮了重要作用,是CESC不良預(yù)后潛在的新型預(yù)測因子。CXCL8通過促進上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、引發(fā)中性粒細胞外陷阱的形成以及促進血管生成途徑導(dǎo)致腫瘤侵襲和遠處轉(zhuǎn)移,研究顯示,CXCL8基因表達與腫瘤轉(zhuǎn)移具有很強的相關(guān)性并能準確預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移[14-16]。由此推測,CXCL8是另外一種潛在的CESC預(yù)后相關(guān)生物標志物和治療靶點。

綜上所述,CESC患者組織中PFKFB4、CXCL8呈高表達,二者能夠成為TNM期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的有力補充,由此構(gòu)建的CESC不良預(yù)后風險模型具有良好的評估效果,能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)生精準評估CESC預(yù)后,有效監(jiān)測高風險人群,進行早期預(yù)防和及時治療,有助于降低CESC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風險,因此具有重要的臨床應(yīng)用價值。