曾義迦,趙 燕,易 婕

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院健康管理中心,四川成都 610041;2.四川省人民醫(yī)院腫瘤科,四川成都 610000

肺癌是中國乃至全球最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率也居各種惡性腫瘤首位[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型,超過所有類型肺癌的85%[2]。NSCLC生存率與分期密切相關(guān),Ⅰ期患者術(shù)后5年生存率可達(dá)77%～92%,但臨床中75%的患者在初診時(shí)處于晚期,即使是可接受手術(shù)切除的ⅢA～ⅣA期,5年生存率也僅有10%～36%[3]。因此早期診斷尤為重要。有研究表明,非編碼RNA在NSCLC發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,影響著NSCLC發(fā)生、增殖、遷移、侵襲、分化和凋亡等過程[4]。外泌體是一種直徑30～150 nm的囊泡,能攜帶多種非編碼RNA參與NSCLC過程,循環(huán)外泌體中非編碼RNA異常表達(dá)已被證明是NSCLC診斷的重要標(biāo)志物[5]。長鏈非編碼核糖核酸母系表達(dá)基因8(lncRNA MEG8)和微小核糖核酸(miRNA)-363-3p是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG8、miR-363-3p在NSCLC組織中異常表達(dá),并影響其惡性進(jìn)程[6-7]。然而,血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p在NSCLC中是否異常表達(dá)及其潛在的臨床意義尚不清楚,本研究旨在探討血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p在NSCLC中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2023年5月四川大學(xué)華西醫(yī)院收治的93例NSCLC患者作為NSCLC組,其中女39例、男54例;年齡25～72歲,平均(60.28±7.43)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲;(2)初次確診;(3)經(jīng)病理檢查確診為NSCLC[8];排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有感染、免疫性疾病;(2)復(fù)發(fā)性肺癌;(3)入院前已接受任何抗腫瘤治療;(4)合并其他部位的惡性腫瘤;(5)臨床資料不全。另選取同期43例健康志愿者作為對照組,女18例、男25例;年齡18～73歲,平均(60.12±7.24)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對象或家屬簽署書面知情同意文件。

1.2方法 采集所有研究對象體檢或入院時(shí)空腹靜脈血3 mL,1 500×g離心5 min,留取400 μL血清標(biāo)本,加入外泌體提取試劑(北京博邁斯科技發(fā)展有限公司,貨號:EXOQ5A-1)100 μL混勻,再次1 500×g離心5 min,得到的沉淀即為外泌體。使用日立高新技術(shù)公司生產(chǎn)的透射電子顯微鏡(型號:HT7800)觀察分離所得血清外泌體(直徑30～150 nm類圓形雙層膜囊泡)。取200 μL血清外泌體,使用Trizol試劑盒(賽默飛世爾科技,貨號:15596026)提取總RNA,分光度計(jì)測定純度合格后(A260/A280比值1.8～2.0),使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)和相應(yīng)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號:P505)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共25 μL:模板DNA 5 μL,qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL,正、反向引物各0.4 μL,加無核酸酶水至總體積為25 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s,共循環(huán)40次。lncRNA MEG8表達(dá)檢測以GAPDH為內(nèi)參,miR-363-3p表達(dá)檢測以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較 NSCLC組血清外泌體lncRNA MEG8水平高于對照組,miR-363-3p水平低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較

2.2NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8與miR-363-3p水平的相關(guān)性 經(jīng)StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測,lncRNA MEG8與miR-363-3p存在互補(bǔ)序列。Pearson相關(guān)性分析顯示,NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8與miR-363-3p水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.730,P<0.001)。見圖1。

圖1 lncRNA MEG8與miR-363-3p水平的相關(guān)性分析

2.3血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平與NSCLC病理特征的關(guān)系 不同分化程度(低分化/中高分化)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期/Ⅲ～Ⅳ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有/無)NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較有差異(P<0.05),不同性別(男/女)、年齡(≥60歲/<60歲)、病理類型(腺癌/其他)吸煙(有/無)、腫瘤最大徑(≥3 cm/<3 cm)NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平與NSCLC病理特征的關(guān)系

2.4血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC的診斷價(jià)值 繪制血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平診斷NSCLC的ROC曲線,并計(jì)算AUC。結(jié)果顯示,血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平聯(lián)合診斷NSCLC的AUC為0.965,大于血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平單獨(dú)診斷的0.908、0.904(Z=2.667、2.572,P=0.008、0.010)。見表4和圖2。

圖2 血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平診斷NSCLC的ROC曲線

表4 血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC的診斷價(jià)值

3 討 論

NSCLC是除小細(xì)胞肺癌外所有肺癌的集合體,其發(fā)病可能與吸煙、二手煙或環(huán)境油煙吸入史、慢性肺部疾病史、一二級親屬肺癌家族史、個(gè)人腫瘤史、職業(yè)致癌物質(zhì)暴露史等有關(guān),面對人口老齡化加劇、空氣污染、吸煙人數(shù)增加等嚴(yán)峻形勢,近年來我國NSCLC發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增加趨勢[2-3]。早期診斷和干預(yù)是改善NSCLC患者預(yù)后,延長其生存期的重要措施。目前臨床常用的肺癌腫瘤標(biāo)志物如鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原、胃泌素釋放肽前體、細(xì)胞角蛋白片段19、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、癌胚抗原等對NSCLC診斷的靈敏度和特異度均不高[9]。低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描雖然有助于NSCLC早期診斷,但操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴,且無法區(qū)分結(jié)節(jié)良惡性,易給患者造成恐懼心理和負(fù)擔(dān)[10]。因此迫切需要尋找新的有價(jià)值非入侵標(biāo)志物,以提升NSCLC診斷水平。

外泌體是廣泛存在各種體液中的一類含有代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)和非編碼RNA等的囊泡樣脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu),在病理生理和細(xì)胞間通訊調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,不同來源的外泌體能保存親代細(xì)胞特有遺傳物質(zhì),能通過轉(zhuǎn)移腫瘤生長所需蛋白質(zhì)和RNA等機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲、血管生成和存活,因此腫瘤來源的外泌體有利于腫瘤的早期診斷[11-12]。lncRNA作為新興的關(guān)鍵生物調(diào)節(jié)因子,在NSCLC進(jìn)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[13]。lncRNA MEG8定位于人染色體14q32.2,參與了多種惡性腫瘤過程,例如,lncRNA MEG8能靶向miR-181a-5p抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[14],靶向miR-495-3p/G3BP應(yīng)力顆粒裝配因子1促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[15],靶向p53蛋白抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡[16]。然而,關(guān)于血清外泌體lncRNA MEG8與NSCLC的關(guān)系尚未可知。本研究結(jié)果顯示,NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8水平升高,與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),這符合LIU等[6]報(bào)道的結(jié)果。其原因可能與lncRNA MEG8能上調(diào)細(xì)胞分裂蛋白激酶6和磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞分裂蛋白激酶6是調(diào)控細(xì)胞分裂的關(guān)鍵因子,其異常升高會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂,促進(jìn)其增殖、遷移和侵襲[17]。磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1是調(diào)控細(xì)胞代謝的重要途徑,其異常升高能通過代謝催化糖酵解、一碳代謝等為腫瘤細(xì)胞提供更多的能量支持,促進(jìn)其增殖、遷移和侵襲[18]。lncRNA MEG8升高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂蛋白激酶6和磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1上調(diào),通過紊亂細(xì)胞分裂周期和通過代謝催化為腫瘤細(xì)胞提供更多能量支持,促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲[6,19]。

miRNA是一種短而小的非編碼RNA,通過調(diào)控mRNA翻譯和降解參與NSCLC發(fā)生發(fā)展[20]。miR-363-3p定位于人染色體Xq26.2,也參考了多種惡性腫瘤過程,如miR-363-3p能靶向鞘氨醇激酶2抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[21];miR-363-3p能靶向Y染色體性別決定區(qū)-盒轉(zhuǎn)錄因子4抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲[22];miR-363-3p能靶向白細(xì)胞介素-6抑制血管瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[23]。然而,關(guān)于血清外泌體miR-363-3p與NSCLC的關(guān)系尚未可知。本研究結(jié)果顯示,NSCLC患者血清外泌體miR-363-3p水平降低,與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明外泌體miR-363-3p水平降低參與NSCLC發(fā)生發(fā)展,這與既往研究報(bào)道相符[7]。這可能與miR-363-3p能下調(diào)扭曲家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1和磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位有關(guān)。扭曲家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1是重要的轉(zhuǎn)錄因子,能通過調(diào)控多條信號通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[24]。磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位是參與磷脂酰肌醇激酶3催化合成的關(guān)鍵亞基,在致癌信號通路PI3K/蛋白激酶B中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。miR-363-3p水平降低會(huì)導(dǎo)致扭曲家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1、磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位上調(diào),增強(qiáng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo),增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲能力,促進(jìn)其惡性進(jìn)展[7,26]。

本研究中,在線網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG8與miR-363-3p存在互補(bǔ)序列,進(jìn)一步行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者在NSCLC患者血清外泌體中表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示lncRNA MEG8與miR-363-3p可能共同參與NSCLC過程。林燕明等[27]通過雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí),lncRNA MEG8過表達(dá)能靶向下調(diào)miR-363-3p促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和抑制凋亡,進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果。為確定血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC的診斷價(jià)值,繪制ROC曲線,結(jié)果顯示血清外泌體lncRNA MEG8診斷NSCLC的AUC為0.908,miR-363-3p診斷NSCLC的AUC為0.904,二者聯(lián)合診斷NSCLC的AUC為0.965,大于血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p單獨(dú)診斷。說明血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平對NSCLC具有診斷價(jià)值,可能成為NSCLC的輔助診斷指標(biāo),而且聯(lián)合檢測血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平能進(jìn)一步提升NSCLC的診斷價(jià)值?？紤]原因可能是二者共同參與NSCLC進(jìn)程,聯(lián)合檢測血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平可以更好地解釋NSCLC發(fā)病機(jī)制,因此診斷價(jià)值更高。

綜上所述,NSCLC患者血清外泌體lncRNA MEG8水平升高和miR-363-3p水平降低,與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),lncRNA MEG8與miR-363-3p可能共同參與NSCLC發(fā)生發(fā)展,而且血清外泌體lncRNA MEG8、miR-363-3p水平聯(lián)合對NSCLC具有較高的診斷價(jià)值。