樂 愉 王 濤 張獻(xiàn)龍 林忠旭

陸地棉重組自交系再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化效率篩選

樂 愉 王 濤 張獻(xiàn)龍 林忠旭*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 / 作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430070

轉(zhuǎn)基因工程育種是棉花種質(zhì)創(chuàng)新的有效手段, 為了拓展陸地棉可再生基因型, 豐富棉花轉(zhuǎn)基因受體, 本研究以湖北省高產(chǎn)闊葉棉品種‘鄂棉22’ (E22)為母本、高再生能力的雞腳葉品種‘豫早1號’ (YZ1)為父本, 通過單籽傳法構(gòu)建了F9重組自交系群體(YE); 利用棉花中比較成熟的IBA+KT (IK)和2,4-D+KT (DK) 2種不同激素組合的培養(yǎng)體系, 分別對重組自交系群體的164個(gè)家系的愈傷組織誘導(dǎo)率(CIF)、愈傷組織繼代繁殖力(CSC)、愈傷組織的出胚率(CRE)以及愈傷組織出胚時(shí)間(CET)進(jìn)行比較, 共獲得12個(gè)可再生的闊葉棉家系; 利用目前成熟的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系對可再生闊葉棉家系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化效率分析, 同時(shí)對其進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀考察, 最終獲得了一個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化效率為82.9%并且農(nóng)藝性狀更優(yōu)良的家系YE3。本研究為棉花的遺傳轉(zhuǎn)化及基因功能研究拓展了陸地棉基因型種質(zhì)資源。

棉花; 重組自交系; 體細(xì)胞胚胎發(fā)生; 再生能力; 遺傳轉(zhuǎn)化效率

棉花是世界上重要的纖維和油料作物, 在我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展中有著舉足輕重的地位。傳統(tǒng)的雜交育種法已經(jīng)難以滿足現(xiàn)代棉花遺傳改良的需要, 轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)育種是棉花種質(zhì)創(chuàng)新的熱點(diǎn)[1]。而現(xiàn)代分子生物技術(shù)應(yīng)用的先決條件在于具備不同品種的組織培養(yǎng)和植株再生的高效體系, 因此在棉花的遺傳改良過程中, 豐富的棉花遺傳轉(zhuǎn)化受體材料以及較高的再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化效率至關(guān)重要。

棉花組織培養(yǎng)體系的構(gòu)建起步較晚, 但發(fā)展迅速。1979年, Price和Smith利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)成功地誘導(dǎo)出了棉花體細(xì)胞胚[2], 1983年, Davidonis對陸地棉Coker 310 (珂字棉)經(jīng)過2年多的繼代培養(yǎng), 成功獲得第1株棉花再生植株[3]。歷經(jīng)十幾年的研究探索, 棉花組織培養(yǎng)體系逐漸完善, 隨后進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期, 由于棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生受基因型限制, 很多體細(xì)胞胚胎發(fā)生的陸地棉多為珂字棉或有其遺傳背景的品種[4-6]。2006年, 金雙俠等[7]通過對多種基因型棉花材料進(jìn)行離體培養(yǎng), 篩選到了2個(gè)體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力明顯高于珂字棉的基因型材料‘豫668’ (Y668)和‘豫早1號’ (YZ1); 2008年, 陳天子等[8]利用新疆4個(gè)主栽棉花品種‘新陸中20’、‘新陸早24’、‘新陸早33’和‘03298’為材料, 通過不同濃度的激素組合成功地誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生并且在6～8個(gè)月獲得大批量再生苗。葛書婭等[9]設(shè)計(jì)了6種不同激素組合的培養(yǎng)體系, 成功建立了新疆推廣的陸地棉品種‘新陸早45號’的再生體系。對棉花不同品種的再生條件的摸索, 拓展了陸地棉再生基因型, 為棉花的遺傳轉(zhuǎn)化豐富了受體材料。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為植物分子育種中最常用的手段, 棉花轉(zhuǎn)基因后能否快速地獲得再生植株, 除了受到組織培養(yǎng)再生體系的影響, 關(guān)鍵影響因素是轉(zhuǎn)基因受體的可再生能力[10]。再生能力受基因型決定, 不同基因型間再生能力差異很大, 且多為數(shù)量性狀[11]。張獻(xiàn)龍等[12]提出棉花的基因型是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的首要因素, 而其他外界條件是次要的。通過對4個(gè)栽培品種的比較發(fā)現(xiàn), 再生能力在栽培種之間也存在較大的差異: 陸地棉>亞洲棉>海島棉>非洲棉, 而同一栽培種的不同棉花品種間也存在差異, 例如陸地棉中以珂字棉的再生能力最強(qiáng), 珂字棉>岱字棉>斯字棉[13]。2022年, Ge等[14]以棉花種子的頂端分生組織干細(xì)胞為外植體, 利用農(nóng)桿菌和超聲波處理將外源基因整合到干細(xì)胞中, 通過誘導(dǎo)干細(xì)胞產(chǎn)生不定芽進(jìn)而發(fā)育成再生植株, 建立了無基因型限制的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系。然而, 通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生植株仍然是棉花轉(zhuǎn)基因研究的重要方法。通過對再生能力相關(guān)的基因進(jìn)行定位和克隆, 用以改造農(nóng)藝性狀優(yōu)良但再生能力低的基因型, 是實(shí)現(xiàn)作物轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的有效手段[15]。由于棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生對基因型的依賴性較大, 根據(jù)已報(bào)道的不同棉花品種的再生培養(yǎng)體系, 選擇與親本相關(guān)的再生體系對構(gòu)建的群體進(jìn)行培養(yǎng), 通過對再生能力相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì), 嘗試定位與體細(xì)胞胚發(fā)生和再生能力相關(guān)的位點(diǎn), 然后有針對性的將這些位點(diǎn)導(dǎo)入到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種中去, 可用于進(jìn)一步改良這些優(yōu)良品種[16]。

為了拓展陸地棉可再生的基因型, 豐富陸地棉的轉(zhuǎn)基因受體材料, 本研究以湖北省高產(chǎn)棉花品種‘鄂棉22’ (Emian 22, E22)和高再生能力的品種‘豫早1號’ (Yuzao 1, YZ1)為親本, 構(gòu)建了包含164個(gè)家系的重組自交系群體(YE), 采用IBA+KT (IK)和2,4-D+KT (DK) 2種培養(yǎng)體系對YE家系的再生能力進(jìn)行鑒定并對可再生闊葉棉家系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化效率分析, 以期篩選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良且遺傳轉(zhuǎn)化效率較高的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以‘鄂棉22’ (E22)為母本、‘豫早1號’ (YZ1)為父本雜交獲得F1。E22是由湖北省黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育, 產(chǎn)量較高, 纖維品質(zhì)良好, 但再生能力較差, 難以獲得再生植株。YZ1再生能力高[7,17], 可在短時(shí)間內(nèi)獲得再生植株, 但產(chǎn)量低, 纖維品質(zhì)一般。F1自交獲得F2, 之后通過單籽傳法自交9代獲得純合株系, 該重組自交系群體包含164個(gè)株系, 以YE表示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織培養(yǎng)方法 基于本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的棉花組織培養(yǎng)體系[18], 采用IBA+KT (IK)和2,4-D+KT (DK) 2套培養(yǎng)體系, 分別對164個(gè)YE家系及親本E22和YZ1的下胚軸進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的分化和再生培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇 本試驗(yàn)中所用的培養(yǎng)體系是經(jīng)過多次優(yōu)化后的、適合棉花組織培養(yǎng)的培養(yǎng)體系, 包括無菌苗萌發(fā)培養(yǎng)基、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。采用IK和DK 2套體系進(jìn)行培養(yǎng)。

無菌苗萌發(fā)培養(yǎng)基: 1/2 MS大量元素, 附加15 g L–1葡萄糖, 2.5 g L–1的Phytagel。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基: MS無機(jī)鹽, B5維生素作為基本培養(yǎng)基(以下簡稱MSB), 附加不同種類的激素組合。

體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)基: MSB基本培養(yǎng)基(KNO3加倍, 去掉NH4NO3)并附加Gln 2.0 g L–1和Asn 1.0 g L–1。

生根培養(yǎng)基: 1/2 MS無機(jī)鹽加B5有機(jī)物, 附加15 g L–1葡萄糖, 2.5 g L–1的Phytagel。

所有的激素和氨基酸在滅菌前加入, 在121℃, 1.1 kg cm–2壓力下高溫高壓滅菌15 min。所有培養(yǎng)物均置于(28±2)℃, 光照強(qiáng)度(冷光源135mmol m–2s–1), 每天光照14 h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo) 無菌苗的培養(yǎng): 硫酸脫掉短絨后的種子剝掉種皮后浸泡于10%的升汞溶液8～10 min, 再用無菌水沖洗3～5次, 接種于無菌苗培養(yǎng)基上, 露白之后將根用無菌的鑷子插入培養(yǎng)基中, 并剝?nèi)?nèi)種皮, 置于20℃的暗培養(yǎng)條件下生長。

愈傷組織誘導(dǎo): 取無菌苗下胚軸切成0.5～ 0.8 cm小段分別接種于2種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上, 每個(gè)家系培養(yǎng)3瓶, 每瓶初始放置10段下胚軸, 并稱取0 d的重量; 放置于光照培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)每隔25 d后采用各自所屬體系進(jìn)行繼代培養(yǎng), 統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率(callus induction rate, CIF); 第1次25 d繼代時(shí)稱取每個(gè)家系的增殖重量, 求取平均值, 計(jì)算愈傷組織繼代繁殖力(callus secondary fecundity, CSC)。

1.2.4 愈傷組織的繼代 隨著愈傷組織的快速增長, 培養(yǎng)基空間過于擁擠, 所以在繼代過程中隨機(jī)減少愈傷的塊數(shù), 每瓶培養(yǎng)基只保留6塊愈傷組織, 在繼代過程中統(tǒng)計(jì)愈傷組織最早出胚時(shí)間(callus embryo time, CET)和愈傷組織的出胚塊數(shù)以及瓶數(shù), 從而計(jì)算愈傷組織的出胚率(embryo rate of callus, CRE)。

1.2.5 愈傷組織的分化 觀察到分化出胚性愈傷組織后立即轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng), 繼續(xù)繼代培養(yǎng)直到分化成胚, 再選擇發(fā)育正常的子葉胚轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上, 促使幼苗生根。

1.2.6 衡量棉花再生能力性狀的統(tǒng)計(jì) 本次試驗(yàn)所統(tǒng)計(jì)的與棉花體細(xì)胞再生能力的性狀有: 愈傷組織誘導(dǎo)率(CIF)、愈傷組織繼代繁殖力(CSC)、愈傷組織最早出胚時(shí)間(CET)、愈傷組織的出胚率(CRE) 4個(gè)指標(biāo), 計(jì)算方法如下: 愈傷組織誘導(dǎo)率(CIF): 出愈傷塊數(shù)/誘導(dǎo)愈傷總塊數(shù)×100; 愈傷組織繼代繁殖力(CSC): 繼代25 d后的愈傷重/繼代0 d的愈傷重×100; 愈傷組織出胚時(shí)間(CET): 單個(gè)家系中最早出現(xiàn)胚性愈傷的時(shí)間; 愈傷組織的出胚率(CRE): 出現(xiàn)胚性愈傷的塊數(shù)/繼代總塊數(shù)×100。

1.2.7 遺傳轉(zhuǎn)化效率分析 以12個(gè)可再生闊葉棉家系為轉(zhuǎn)化受體材料, 每一個(gè)受體保證10瓶無菌苗, 每瓶4粒種子的下胚軸用于切苗侵染; 在農(nóng)桿菌侵染后的第1個(gè)月, 每個(gè)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)皿有35～40段生長健康的下胚軸段, 每個(gè)受體獲得10～12個(gè)培養(yǎng)皿不等, 不同的培養(yǎng)皿是不同的重復(fù)。采用IK培養(yǎng)體系, 以紅色熒光蛋白(red fluorescence protein, RFP)為報(bào)告基因, 紅色熒光蛋白由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金雙俠教授提供, 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化[18]; 再利用體式顯微鏡在紅色熒光波長下觀察轉(zhuǎn)基因植株是否有紅色熒光, 遺傳轉(zhuǎn)化效率計(jì)算方法為陽性單株/總轉(zhuǎn)化單株×100。

1.2.8 農(nóng)藝性狀考察 12個(gè)可再生闊葉棉家系以及親本E22和YZ1于2019年種植于湖北武漢、2020年及2021年種植于湖北鄂州試驗(yàn)基地。待棉花完全吐絮時(shí), 收取植株中部吐絮正常的棉花, 軋花后對衣分含量以及棉花纖維品質(zhì)性狀進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種培養(yǎng)體系下YE群體的再生能力鑒定

2.1.1 體細(xì)胞胚胎發(fā)生的差異 不同的棉花品種在同一培養(yǎng)體系下, 其再生時(shí)間存在明顯的差別, 而同一品種選擇的培養(yǎng)體系不同, 再生能力也存在差異。因此, 針對高再生能力的家系選擇合適的培養(yǎng)體系就顯得至關(guān)重要。

棉花的植株再生過程通常包括外植體接種、愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的分化、胚狀體的形成和植株再生4個(gè)過程。胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3個(gè)月后會得到大量胚狀體, 對胚狀體進(jìn)行誘導(dǎo)后得到再生幼苗。但是在利用IK和DK體系培養(yǎng)YE家系的過程中發(fā)現(xiàn), 在IK培養(yǎng)體系下(圖1)有個(gè)別家系(YE3)在2～3個(gè)月的時(shí)候未見大量胚性愈傷, 卻率先發(fā)現(xiàn)了零星的子葉胚(圖1-C),通過對子葉胚的誘導(dǎo), 能夠順利得到再生植株, 可在原來培養(yǎng)周期的基礎(chǔ)上進(jìn)一步縮短再生周期。這些家系在DK培養(yǎng)體系(圖2)下并未出現(xiàn)這種先出現(xiàn)子葉胚的情況, 因此在培養(yǎng)體系的選擇上, IK體系比DK體系更適合YE群體。

2.1.2 再生能力的比較 利用IK和DK培養(yǎng)體系對164個(gè)YE家系和親本進(jìn)行組織培養(yǎng), 本研究對CIF、CSC、CET、CRE 4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。由于培養(yǎng)體系的優(yōu)化, 在2種培養(yǎng)體系下所有的家系都可以誘導(dǎo)出愈傷組織, 因此所有家系的CIF都接近100%, 本研究可通過其他3個(gè)指標(biāo)來衡量不同家系的再生能力。

圖1 IK體系下棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生流程

A: 棉花下胚軸; B: 1～2個(gè)月的愈傷組織; C: 胚性愈傷組織, 伴有子葉型胚狀體; D: 大量胚狀體形成; E: 植株再生; F: 水培后可移栽。

A: hypocotyl; B: the induced callus tissue of 1–2 months; C: the embryonic callus with cotyledons; D: a large amount of embryoid formation; E: plant regeneration; F: hydroponics can be transplanted.

圖2 DK體系下棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生流程

A: 棉花下胚軸; B: 1～2個(gè)月的愈傷組織; C: 胚性愈傷組織, 無胚狀體; D: 大量胚狀體形成; E: 植株再生; F: 水培后可移栽。

A: hypocotyl; B: the induced callus tissue of 1–2 months; C: the embryonic callus with cotyledons; D: a large amount of embryoid formation; E: plant regeneration; F: hydroponics can be transplanted.

由IK和DK體系下愈傷組織增殖頻率分布圖(圖3)可知, YE家系在DK培養(yǎng)體系下的繼代繁殖力大部分在4～7 g, 而在IK培養(yǎng)體系下的繼代繁殖力大部分在3～5 g, 在DK培養(yǎng)體系下的繼代繁殖力高于IK體系。對于在IK和DK 2種培養(yǎng)體系下均可出胚的家系, 本研究對其相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 對于出胚時(shí)間(圖4-A), 在IK體系下, 出胚時(shí)間主要集中在60～80 d, 而在DK體系下, 出胚時(shí)間主要集中在80～100 d, IK體系的出胚時(shí)間要比DK體系的出胚時(shí)間短; 對胚性愈傷組織出胚率(圖4-B)的比較可以看出, 出胚率大多處于60%～100%, 2種體系沒有明顯差異。綜合胚性愈傷組織增殖、愈傷組織出胚時(shí)間和胚性愈傷組織出胚率可知, 過度地愈傷增殖并不會加快胚性愈傷組織的出現(xiàn), 對出胚率也沒有明顯影響。

圖3 IK和DK體系下愈傷組織增殖的頻率分布圖

CSC: 愈傷組織繼代繁殖力。CSC: callus secondary fecundity.

圖4 IK和DK體系下可出胚家系再生相關(guān)性狀的頻率分布圖

A: CET, 愈傷組織最早出現(xiàn)的時(shí)間; B: CRE, 愈傷組織出胚率。

A: CET, callus embryo time; B: CRE, the embryo rate of callus.

2.1.3 YE家系再生植株統(tǒng)計(jì) 本研究對在2種體系下獲得的再生苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), 共有36個(gè)家系在IK體系下獲得再生苗, 其中22個(gè)是闊葉棉家系; 共有35個(gè)家系在DK體系下獲得再生苗, 其中19個(gè)是闊葉棉家系; 共有25個(gè)家系在2個(gè)培養(yǎng)體系下均能獲得再生苗, 其中闊葉棉家系有12個(gè)(表1), 圖5所示為部分再生植株。本研究選擇在2個(gè)體系下均可以獲得再生苗的闊葉棉家系繼續(xù)后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化分析, 這些闊葉棉家系在IK體系下的CIF為100%, CSC不低于2.8 g, CER不低于50%, CET不晚于120 d。

圖5 部分再生植株

表1 再生YE家系CSC、CRE和CET比較

(續(xù)表1)

aYE表示以E22和YZ1為親本獲得的重組自交系群體的家系編號;bIBA+KT表示吲哚丁酸+激動(dòng)素激素組合, 2,4-D+KT表示2,4-二氯苯氧乙酸+激動(dòng)素激素組合。

aYE: the recombinant inbred lines obtained with E22 and YZ1 as the parents.bIBA+KT: hormone combination of indole butyric acid + kinetin, 2,4-D+KT: hormone combination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid + kinetin. CSC: callus secondary fecundity; CRE: the embryo rate of callus; CET: callus embryo time.

2.2 可再生闊葉棉遺傳轉(zhuǎn)化效率鑒定

本研究對篩選得到的所有可再生闊葉棉家系利用IK體系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn), 并不是所有的可再生闊葉棉家系在經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染后都能獲得再生植株。YE81和YE86在侵染90 d后開始出現(xiàn)大面積的農(nóng)桿菌污染, 下胚軸壞死; YE21無法誘導(dǎo)出愈傷組織, 下胚軸發(fā)黑壞死; YE22、YE33、YE38、YE111、YE138和YE142可以誘導(dǎo)出愈傷組織, 但是后面無法誘導(dǎo)出胚性愈傷組織; YE87可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織, 但是胚狀體發(fā)育畸形, 無法獲得再生植株; 只有YE3和YE54能完成體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生過程, YE3在培養(yǎng)7個(gè)月后開始獲得再生苗, YE54只獲得了陰性單株, 沒有獲得陽性單株。圖6中的ABCD和EFGH分別為在白光和紅色熒光條件下YE3轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織(圖6-A)、體細(xì)胞胚(圖6-B)和轉(zhuǎn)基因植株葉片(圖6-C, D), 其中圖6-D和6-F所示左邊為陽性植株葉片, 右邊為陰性植株葉片。最終統(tǒng)計(jì)表明以YE3為受體獲得的轉(zhuǎn)基因總植株數(shù)為41, 陽性單株數(shù)為34, 其遺傳轉(zhuǎn)化效率達(dá)到82.9%。

圖6 YE3轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定

A和E: 胚性愈傷組織; B和F: 體細(xì)胞胚; C、G、D和F: 葉片; 標(biāo)尺為1000mm。

A and E: embryonic callus; B and F: embryo; C, G, D, and H: leaf. Bar: 1000mm.

2.3 可再生闊葉棉家系農(nóng)藝性狀考察

本研究考察了12個(gè)可再生的闊葉棉家系的纖維品質(zhì)及纖維產(chǎn)量相關(guān)性狀, 包括纖維長度、纖維強(qiáng)度、馬克隆值、整齊度、伸長率和衣分。由表2可知, 在纖維長度方面, 除YE22明顯低于YZ1外, 其他可再生闊葉棉家系均接近或高于YZ1; 在纖維強(qiáng)度方面, 所有家系均高于YZ1; 馬克隆值和伸長率在E22和YZ1之間沒有差異, 可再生闊葉家系中的馬克隆值和伸長率變化較大; YZ1的整齊度高于E22, 可再生闊葉棉家系YE3、YE21、YE81、YE138和YE142的整齊度均高于YZ1; 在產(chǎn)量性狀衣分上, 除了YE81和E22接近, 其他闊葉棉家系均高于YZ1。由此可見, 可再生闊葉棉中大部分家系表現(xiàn)出優(yōu)于高再生能力材料YZ1的農(nóng)藝性狀, 說明這些可再生闊葉家系中同時(shí)還攜帶了與優(yōu)良農(nóng)藝性狀相關(guān)的遺傳信息。

表2 12個(gè)可再生闊葉家系農(nóng)藝性狀考察

aYE表示以E22和YZ1為親本獲得的重組自交系群體的家系編號。

aYE represents the recombinant inbred lines obtained with E22 and YZ1 as the parents.

YE3在纖維品質(zhì)性狀如纖維長度、纖維強(qiáng)度、纖維整齊度、纖維伸長率方面要明顯優(yōu)于高再生能力的材料YZ1; 在產(chǎn)量性狀上, YE3的衣分為40.53%, 與E22的43.72%接近, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于YZ1的35.43%。綜上, 在主要農(nóng)藝性狀方面, YE3表現(xiàn)出優(yōu)于高再生材料YZ1的潛力, 表明YE3中攜帶了YZ1高再生能力相關(guān)的遺傳位點(diǎn), 同時(shí)又保留了高產(chǎn)陸地棉品種的優(yōu)異農(nóng)藝性狀。

3 討論

3.1 高再生能力家系的篩選

同一個(gè)家系在不同培養(yǎng)體系下的再生能力存在差異。李雪林等[19]利用DK和IK體系對多個(gè)棉花品種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn), DK體系下大鈴棉和邯8959兩個(gè)材料只能分化出胚性愈傷, 但在IK體系下胚性愈傷組織能夠萌發(fā)出胚狀體, 并再生出完整植株。本研究利用DK和IK體系對YE家系的再生能力統(tǒng)計(jì)過程中也發(fā)現(xiàn), 有些家系在2個(gè)體系下都可再生(表1); 但也有一部分家系只在其中一個(gè)體系下可再生, 如YE16、YE34和YE129等10個(gè)家系只能在DK體系下獲得再生植株, YE30、YE44、YE80等11個(gè)家系只能在IK體系下可以獲得再生植株。本研究認(rèn)為在2個(gè)體系下都能獲得再生植株的YE家系才是高再生能力的代表, 至少說明其基因型響應(yīng)2種激素的能力較強(qiáng)。

3.2 高遺傳轉(zhuǎn)化效率及農(nóng)藝性狀優(yōu)良材料的篩選

篩選再生能力強(qiáng)以及遺傳轉(zhuǎn)化效率高且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的闊葉棉材料對于棉花轉(zhuǎn)基因工程尤為重要。YZ1雖然具有較高的再生能力, 但以它作為轉(zhuǎn)基因受體的弊端很明顯, 作為超雞腳葉的典型代表, YZ1的纖維產(chǎn)量和品質(zhì)不佳, 以它為受體的轉(zhuǎn)基因植株很難滿足當(dāng)前的生產(chǎn)需要。E22適應(yīng)范圍廣, 其纖維產(chǎn)量和纖維品質(zhì)優(yōu)于YZ1, 但該材料無法通過組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生及植株再生,因此我們無法以它作為轉(zhuǎn)基因受體材料進(jìn)行定向改良研究。為了獲得高再生能力并且產(chǎn)量和品質(zhì)優(yōu)良的材料, 以滿足當(dāng)前生產(chǎn)上的遺傳改良需要, 本研究以YZ1和E22為親本, 通過多代自交獲得了穩(wěn)定遺傳的重組自交系群體, 避免了像F2群體只能用一代的弊端, 可以常年獲得外植體對其進(jìn)行組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究。

作為維管束植物最主要的營養(yǎng)器官, 葉片對于光合產(chǎn)物的積累、養(yǎng)分分配以及水分運(yùn)輸起著重要作用[20]; 葉形和空間分布會影響光能利用效率, 在很大程度上決定著作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[21]。目前生產(chǎn)上主栽陸地棉品種為闊葉棉, 闊葉棉葉面積大, 光合作用強(qiáng); 雞腳葉葉面積小, 不利于光合作用, 并且與纖維產(chǎn)量和品質(zhì)不利性狀關(guān)聯(lián), 不適于大面積種植[22]。因此, 本研究選擇可再生的闊葉棉家系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化效率的研究。

本研究共獲得了12個(gè)在IK和DK 2種培養(yǎng)體系下均可再生的闊葉棉家系, 選用更適合于YE家系的IK培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng), 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化, 農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因進(jìn)入植物基因組需要編碼毒力蛋白(vir)的基因, 這些毒蛋白基因的表達(dá)受到受傷的植物釋放的酚類物質(zhì)的誘導(dǎo)[23]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花遺傳轉(zhuǎn)化受到多因素影響[24], 內(nèi)在因素包括基因型和外植體, 外在因素包括培養(yǎng)體系、農(nóng)桿菌菌株和濃度以及浸染時(shí)間、酚類物質(zhì)乙酰丁香酮(AS)的濃度、共培養(yǎng)的時(shí)間以及抗生素的濃度等, 本研究在對可再生闊葉棉家系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí), 除了基因型的差異外, 其他因素都是保持一致的。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明, 并不是所有能夠再生的闊葉棉家系都能夠經(jīng)過農(nóng)桿菌的浸染并完成轉(zhuǎn)化過程而得到轉(zhuǎn)基因植株, 可能是由于基因型差異引起, 基因型不同的受體在受到農(nóng)桿菌侵染時(shí), 傷口釋放的酚類物質(zhì)可能也會不同, 從而影響對毒力蛋白的誘導(dǎo)和T-DNA的轉(zhuǎn)移能力, 針對不同基因型的材料, 可能需要優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化方案才能達(dá)到理想的結(jié)果。

本研究選擇以RFP為報(bào)告基因, 因?yàn)镽FP的可視性強(qiáng), 可肉眼觀察轉(zhuǎn)基因植株的顏色以篩選陽性轉(zhuǎn)化事件, 同時(shí)可利用熒光體式顯微鏡觀察以明確篩選結(jié)果。通過統(tǒng)計(jì)陽性轉(zhuǎn)基因植株所占比例, 篩選出了高遺傳轉(zhuǎn)化效率的材料YE3, 該材料能在胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段率先誘導(dǎo)出子葉胚, 子葉胚進(jìn)一步分化成再生苗, 這一點(diǎn)特性可縮短再生苗的培養(yǎng)周期; 田間農(nóng)藝性狀考察表明YE3有更優(yōu)于YZ1的優(yōu)良農(nóng)藝性狀。綜上, 本研究表明YE3在棉花轉(zhuǎn)基因育種中具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

4 結(jié)論

本研究利用DK和IK 2種培養(yǎng)體系對YE重組自交系群體進(jìn)行再生能力的鑒定, 篩選出了12個(gè)可再生闊葉棉; 通過遺傳轉(zhuǎn)化效率分析以及農(nóng)藝性狀考察, 最終篩選到一個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化效率高于80%、且主要農(nóng)藝性狀更優(yōu)良的材料YE3, 本研究拓展了陸地棉遺傳轉(zhuǎn)化的基因型, 豐富了轉(zhuǎn)基因受體材料。后續(xù)研究可以將具有YZ1等位基因的位點(diǎn)作為具有調(diào)控棉花再生能力的候選位點(diǎn), 同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析以及功能基因組挖掘棉花再生相關(guān)候選基因, 為棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生及再生研究提供理論基礎(chǔ)。

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Screening of regeneration capacity and genetic transformation efficiency in recombinant inbred lines ofL

LE Yu, WANG Tao, ZHANG Xian-Long, and LIN Zhong-Xu*

College of Plant Science & Technology, Huazhong Agricultural University / National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Wuhan 430070, Hubei, China

Transgenic engineered breeding is an effective way of cotton germplasm innovations. In order to expand the renewable genotypes of upland cotton and to enrich cotton transgenic receptors, we constructed an F9recombinant inbred population (YE) by the single-seed descent method using the high-yielding broad leaf cotton variety Emian 22 (E22) from Hubei province as the male parent and the high regeneration-capable okra leaf variety Yuzao 1 (YZ1) as the female parent. We compared the callus induction rate (CIF), callus secondary fecundity (CSC), embryo rate of callus (CRE), and callus embryo time (CET) of 164 recombinant inbred lines using two different hormone combinations of IBA+KT (IK) and 2,4-D+KT (DK), respectively, which were mature tissue culture systems in cotton. A total of 12 regenerable broad leaf lines were obtained and evaluated for the genetic transformation efficiency using the current mature genetic transformation system in cotton; meanwhile, agronomic traits of these lines were investigated. Finally, a family line YE3, with a genetic transformation efficiency of 82.9% and better agronomic traits, was obtained. This study develops a new genotype of upland cotton, which will facilitate the genetic transformation and gene function research of cotton.

cotton; RILs; somatic embryogenesis; regeneration capacity; transformation efficiency

10.3724/SP.J.1006.2024.34167

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32172025)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32172025).

林忠旭, E-mail: linzhongxu@mail.hzau.edu.cn

E-mail: leyu_hzau@163.com

2023-10-16;

2024-01-12;

2024-02-07.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240205.1152.008

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