蘇 帥 劉孝偉 牛群凱 時(shí)子文 侯雨微 馮開潔 榮廷昭 曹墨菊

玉米多葉矮化突變體的鑒定與基因克隆

蘇 帥 劉孝偉 牛群凱 時(shí)子文 侯雨微 馮開潔 榮廷昭 曹墨菊*

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所 / 農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川成都 611130

玉米株高降低通常是由節(jié)間數(shù)目減少、節(jié)間長(zhǎng)度變短或二者共同作用所致。而本研究在基因編輯后代中發(fā)現(xiàn)的玉米多葉矮化突變體卻表現(xiàn)為節(jié)間數(shù)目顯著增加, 株高顯著降低。株高僅為93.10 cm, 與野生型KN5585的株高159.95 cm相比, 降低了41.79%, 差異達(dá)到極顯著水平。然而葉片數(shù)平均達(dá)到27.8片, 相較野生型平均17.8片葉, 增加56.18%, 差異達(dá)到極顯著水平。遺傳分析表明,的突變表型由1對(duì)隱性核基因控制, 通過圖位克隆將控制多葉矮化性狀的基因定位于玉米3號(hào)染色體標(biāo)記Indel10和Indel11之間, 物理距離0.74 Mb。對(duì)定位區(qū)間內(nèi)13個(gè)基因(不包含假基因)的序列進(jìn)行測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)僅在第4外顯子出現(xiàn)1個(gè)A堿基的替換, 其他基因無差異。編碼一個(gè)RNA結(jié)合蛋白, 氨基酸的替換發(fā)生在第3個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)(RRM3), 導(dǎo)致天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸。突變體的突變位點(diǎn)與已報(bào)道的、、、不同,的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步解析玉米葉片和節(jié)間發(fā)育平衡的遺傳機(jī)制提供了寶貴的材料。

玉米; 葉片數(shù)量; 節(jié)間長(zhǎng)度; 基因定位

玉米(L.)是我國(guó)糧食和飼料作物, 在保障國(guó)家糧食安全方面發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)階段玉米產(chǎn)量的增長(zhǎng)主要通過提升種植密度, 適當(dāng)降低株高以增強(qiáng)抗倒伏能力是提高種植密度的關(guān)鍵[1-2]。玉米節(jié)間數(shù)量(葉片數(shù)量)和節(jié)間長(zhǎng)度是決定株高的關(guān)鍵因素, 因此對(duì)于玉米葉片數(shù)量和節(jié)間長(zhǎng)度以及協(xié)調(diào)二者平衡相關(guān)基因的挖掘具有重要的理論和實(shí)踐意義。

玉米節(jié)間長(zhǎng)度由節(jié)間居間分生組織細(xì)胞的分裂、分化和伸長(zhǎng)決定。植物激素作為重要的信號(hào)分子, 參與玉米節(jié)間長(zhǎng)度的調(diào)控。[3]、[4-5][6]編碼赤霉素合成途徑的中間產(chǎn)物,[7-9]、[9]編碼DELLA蛋白作為GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子, 通過調(diào)控赤霉素的生物合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響玉米節(jié)間長(zhǎng)度。生長(zhǎng)素以極性運(yùn)輸?shù)姆绞綄?duì)節(jié)間長(zhǎng)度產(chǎn)生影響,編碼生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)鞍譖GP, 通過促進(jìn)節(jié)間生長(zhǎng)素的積累抑制節(jié)間的伸長(zhǎng), 且對(duì)穗下部節(jié)間長(zhǎng)度影響較大[10-11]。[12]、[13]位于油菜素內(nèi)酯生物合成的上游,[14]位于油菜素內(nèi)酯生物合成的下游,參與油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15], 上述基因突變后均會(huì)對(duì)玉米節(jié)間長(zhǎng)度產(chǎn)生影響。編碼乙烯生物合成中的關(guān)鍵限速酶ACC合成酶, 通過增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性, 促進(jìn)乙烯合成, 抑制節(jié)間伸長(zhǎng)[16]。玉米葉片由莖頂端分生組織的周緣區(qū)以一定的時(shí)間間隔和空間間隔分化形成[17], 但具體的分子機(jī)制尚未解析。迄今已經(jīng)報(bào)道的葉片數(shù)量相關(guān)突變體主要與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素有關(guān)。玉米基因編碼IAA生物合成途徑中的色氨酸轉(zhuǎn)移酶,突變體展示出葉片數(shù)目顯著減少而導(dǎo)致的矮化表型[18]。編碼細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的A型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子, 玉米突變體葉片數(shù)增多, 但對(duì)株高沒有顯著影響。在突變體中, 玉米IAA外排載體在初始葉原基的表達(dá)量大幅下降, 其生長(zhǎng)素水平也明顯降低[19]。

RNA結(jié)合蛋白是含有一個(gè)或多個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 通過結(jié)合RNA并改變結(jié)合RNA的命運(yùn)或功能的蛋白質(zhì)[20-21]。RNA結(jié)合蛋白的研究主要在哺乳動(dòng)物和細(xì)菌系統(tǒng)中進(jìn)行, 植物RNA結(jié)合蛋白研究較少。是在酵母中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)編碼RNA結(jié)合蛋白的基因, 含有3個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 促進(jìn)酵母細(xì)胞減數(shù)分裂S期DNA的合成和減數(shù)第一次分裂的有序進(jìn)行[22]。水稻基因編碼Mei2-like蛋白, 該基因突變后植株矮小, 葉片數(shù)增加, 植株早熟[23]。是在玉米中的同源基因, 該基因在葉原基起始處表達(dá)量最低, 其突變體株高降低, 葉片數(shù)目增多, 葉脈紊亂, 植株雄穗缺失, 原雄穗發(fā)育處展示出雌性化的特征[33-34]。盡管在植物中很多基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn), 且均與酵母基因類似, 含有3個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 但在植物中未找到酵母下游基因的同源物, 表明該基因在酵母和植物中的功能和作用機(jī)制并不相同[24]。在植物中基因下游結(jié)合的RNA的挖掘, 以及3個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在發(fā)揮功能過程中的作用仍需要進(jìn)一步深入研究。

本研究以多葉矮化突變體()為研究對(duì)象, 對(duì)突變體的葉片數(shù)和節(jié)間長(zhǎng)度等表型特征進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查, 采用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)突變基因進(jìn)行了定位, 并對(duì)候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析, 確定了關(guān)鍵候選基因, 該基因編碼RNA結(jié)合蛋白。本研究為進(jìn)一步闡明玉米葉片數(shù)量和節(jié)間長(zhǎng)度的平衡關(guān)系以及RNA結(jié)合蛋白對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響提供了寶貴材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米多葉矮化突變體、玉米自交系B73、Mo17和KN5585。突變體選自基因()的CRISPR/Cas9敲除后代, 對(duì)突變體中的進(jìn)行測(cè)序, 結(jié)果顯示突變體中未發(fā)生編輯, 即該突變體的突變表型與無關(guān)。

1.2 突變體lyd1的表型鑒定和遺傳分析

2020年6月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)該多葉矮化突變體, 將其自交保種。2020年12月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)云南試驗(yàn)基地種植、Mo17和B73, 并將分別與Mo17和B73雜交得到F1。2021年3月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江試驗(yàn)基地種植F1, 自交獲得F2種子。2022年3月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江試驗(yàn)基地種植F2群體。成熟期統(tǒng)計(jì)F2分離群體中正常和多葉矮化植株的分離比并進(jìn)行卡平方測(cè)驗(yàn)。

2021年3月將野生型KN5585和突變體種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江試驗(yàn)基地, 野生型KN5585二葉期后, 每間隔3 d, 統(tǒng)計(jì)野生型KN5585和突變體各30株完全展開葉數(shù)量。在植株成熟期, 田間隨機(jī)選取野生型KN5585和各15株, 考察株高、穗位、葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、雄穗分支數(shù)、地上部分各節(jié)間長(zhǎng)度和散粉期等重要農(nóng)藝性狀。使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

1.3 莖稈細(xì)胞學(xué)觀察

植株散粉后, 選取野生型KN5585和地上部分最長(zhǎng)節(jié)間(均為雌穗下方第2節(jié), 野生型KN5585為第11節(jié), 突變晰完體為第19節(jié))的中部, 縱切并將其固定于FAA固定液中。將樣品依次進(jìn)行軟化、洗滌、脫水、透明、包埋、切片、烤片、染色, 在顯微鏡下進(jìn)行節(jié)間細(xì)胞觀察, 野生型KN5585和突變體分別選取細(xì)胞形態(tài)清整的3張切片, 共10個(gè)視野進(jìn)行照相。通過ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞長(zhǎng)度測(cè)量, 并根據(jù)實(shí)際測(cè)量得出的最長(zhǎng)節(jié)間平均長(zhǎng)度進(jìn)行節(jié)間細(xì)胞數(shù)目的計(jì)算, 使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

1.4 基因定位

利用CTAB法[25]提取玉米自交系Mo17、KN5585、突變體以及[×Mo17] F2分離群體內(nèi)多葉矮化單株的基因組DNA。利用均勻分布在玉米10條染色體上1050對(duì)Indel和SSR標(biāo)記, 對(duì)Mo17和進(jìn)行多態(tài)性分析。在[×Mo17] F2群體中, 選取10株多葉矮化單株提取葉片的DNA, 稀釋成相同濃度并等體積混合, 每5株混合為一個(gè)池, 構(gòu)建2個(gè)突變池。同時(shí), 另外選取10株表型正常的單株提取葉片的DNA, 稀釋成相同濃度并等體積混合為一個(gè)正常池。采用BSA (bulk segregant analysis)方法[26]篩選在正常池和突變池之間具有穩(wěn)定性差異的多態(tài)性標(biāo)記, 并利用上述標(biāo)記對(duì)F2群體內(nèi)多葉矮化單株進(jìn)行基因分型, 篩選與突變表型連鎖的多態(tài)性標(biāo)記, 對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行初步定位。利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站根據(jù)初步定位區(qū)段內(nèi)序列信息, 設(shè)計(jì)產(chǎn)物片段600 bp左右的引物, 通過PCR擴(kuò)增出親本基因片段后進(jìn)行測(cè)序, 利用DNAMAN軟件對(duì)所擴(kuò)增的雙親基因序列進(jìn)行比對(duì)分析, 找出雙親間的序列差異位點(diǎn), 根據(jù)差異位點(diǎn)開發(fā)片段大小為150～300 bp的Indel標(biāo)記。利用新開發(fā)的標(biāo)記, 對(duì)擴(kuò)大的定位群體內(nèi)多葉矮化單株進(jìn)行基因分型, 縮小定位區(qū)間, 對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位。

1.5 候選基因的預(yù)測(cè)與分析

在MaizeGDB和NCBI網(wǎng)站上, 獲取精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)基因的注釋信息。根據(jù)精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)基因序列和注釋, 設(shè)計(jì)基因特異引物, 以野生型和基因組DNA或全長(zhǎng)CDS為模板, 利用KOD高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為30 μL: 2×PCR buffer for KOD FX 15 μL、正向和反向引物(10 μmol L–1)各2 μL、KOD FX 0.6 μL、dNTPs (0.002 mol L–1) 6 μL、ddH2O 3.4 μL、模板3 μL, PCR程序?yàn)? 95℃預(yù)變性5 min; 98℃變性10 s, 58℃退火30 s, 68℃延伸(1 kb min–1), 循環(huán)數(shù)為35次; 68℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序并利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì), 確定變異位點(diǎn)。

以定位群體內(nèi)關(guān)鍵交換單株DNA為模板, 根據(jù)變異位點(diǎn)附近序列設(shè)計(jì)特異性引物, 對(duì)變異位點(diǎn)所在的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增, 長(zhǎng)度約600 bp, 變異位點(diǎn)位于擴(kuò)增片段中間, 并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序, 利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì), 進(jìn)行變異位點(diǎn)群體內(nèi)共分離驗(yàn)證。

1.6 關(guān)鍵候選基因的表達(dá)及其蛋白的亞細(xì)胞定位

為了檢測(cè)在不同時(shí)期不同組織的表達(dá)模式, 利用TRIzol試劑盒提取野生型KN5585在V3、V7、V11、V17時(shí)期的根、莖、葉、雌穗、雄穗的RNA; 同時(shí)為了檢測(cè)突變體中基因表達(dá)水平變化, 利用TRIzol試劑盒提取野生型KN5585和的V3和V7時(shí)期莖尖的RNA, 電泳檢測(cè)RNA的完整性, 并將質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 根據(jù)玉米公共數(shù)據(jù)庫(kù)MaizeGDB中提供的候選基因cDNA信息, 使用Primer 3在線設(shè)計(jì)特異性引物, 引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100～200 bp左右。cDNA稀釋至100 ng μL–1作為模板。以作為內(nèi)參。qRT-PCR反應(yīng)在CFX 96 Real-Time System上進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL: Diluted cDNA 1 μL, 2×SYBR Green PCR Mix 5 μL, 上游引物(10 μmol L–1) 0.4 μL, 下游引物(10 μmol L–1) 0.4 μL, ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸15 s, 40個(gè)循環(huán), 3次生物重復(fù), 3次技術(shù)重復(fù)。擴(kuò)增結(jié)束后產(chǎn)生的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Microsoft Excel中, 采用2–DDCt方法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的分析。

為了檢測(cè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位模式, 設(shè)計(jì)帶有PCAMBIA2300-eGFP載體同源臂的引物擴(kuò)增全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。利用同源重組的方法, 將pCAMBIA2300-35S-eGFP載體和目的片段連接, 并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài), 挑選陽性克隆檢測(cè)并測(cè)序比對(duì), 挑選正確序列的單克隆擴(kuò)繁, 提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌, 200轉(zhuǎn) min–128℃過夜擴(kuò)繁至OD600為0.6左右, 然后5000轉(zhuǎn) min–1離心5 min收集菌體, 棄上清, 加入適量的注射液。用已滅菌的1 mL注射器將菌體懸浮液注射至4～8周左右的煙草葉背部表皮細(xì)胞層中, 然后在正常條件下培養(yǎng)48 h, 用熒光顯微觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型鑒定及遺傳分析

為了明確突變體的遺傳規(guī)律, 將自交后代于每年的春季在四川、秋季在云南進(jìn)行多年種植觀察,的突變表型不受環(huán)境影響, 可以穩(wěn)定遺傳。將分別與Mo17和B73雜交, F1代植株均表現(xiàn)正常表型, 將F1自交獲得F2, 在5380株[×Mo17] F2群體中, 正常植株數(shù)量為4083株, 多葉矮化株數(shù)量為1297株, 經(jīng)卡平方檢測(cè), 正常植株與多葉矮化株分離比符合3∶1 (c2C=2.24, 小于c20.05,1=3.84); 在286株[×B73] F2群體中, 正常植株數(shù)量為220株,多葉矮化株數(shù)量為66株, 經(jīng)卡平方檢測(cè), 正常植株與多葉矮化株分離比符合3∶1 (c2C=0.46, 小于c20.05,1=3.84)。不同遺傳背景下的F2群體, 正常植株與多葉矮化植株分離比均符合3∶1, 表明該突變表型是由單個(gè)隱性核基因控制。

對(duì)突變體的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),株高93.10 cm、穗位高43.48 cm, 僅為野生型株高159.95 cm、穗位高64.37 cm的58.21%和67.55% (圖1-A～C), 進(jìn)一步分析表明穗上部和穗下部節(jié)間縮短是造成株高降低的原因(圖2-A)。生育期內(nèi)完全葉數(shù)量平均為27.80±1.18片, 野生型生育期內(nèi)完全葉數(shù)量平均為(17.80±0.95)片(圖2-B), 差異達(dá)到極顯著水平。野生型從播種至群體內(nèi)50%植株散粉需要(89.03±2.10) d,從播種至群體內(nèi)50%植株散粉需要(88.64±1.79) d, 二者無顯著差異(表1)。綜合葉片數(shù)量及生育期的比較結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),相鄰2片葉片完全展開的時(shí)間間隔為2.31 d, 野生型相鄰2片葉片完全展開的時(shí)間間隔為3.50 d, 兩者差異達(dá)到顯著水平,相鄰葉原基起始所用時(shí)間間隔縮短, 葉片起始速率加快。此外葉片長(zhǎng)度和寬度較野生型顯著縮小(圖1-D), 穗長(zhǎng)、穗粗、行粒數(shù)、穗粒重、百粒重均顯著下降(圖1-F, G), 雄穗分支數(shù)顯著減少, 雄穗基部由未完全伸展的葉片包裹(圖1-E和表1), 這可能也暗示了雄穗基部節(jié)間伸長(zhǎng)受阻。

圖1 野生型KN5585和突變體lyd1的性狀比較

A、B、C: 分別表示五葉期、十葉期和成熟期的野生型KN5585和植株; D: 野生型KN5585和成熟期的葉片表型; E: 野生型KN5585和突變體的雄穗表型; F、G: 野生型KN5585和的果穗和籽粒的表型。標(biāo)尺: A 15 cm; B、C、D 30 cm; E 5 cm; F 2 cm。

A, B, and C: represent the 5th leaf stage, 10th leaf stage, and mature stage of wild type KN5585 and mutant, respectively. D: leaves phenotypes of wild type KN5585 and mutantat maturity. E: the tassel phenotype of wild type KN5585 and mutant. F, G: phenotypes of ear and kernel of wild types KN5585 and mutant. Bar: A 15 cm; B, C, D 30 cm; E 5 cm; F 2 cm.

圖2 野生型KN5585和突變體lyd1的節(jié)間、葉片發(fā)育的比較

A: 野生型KN5585和地上部分節(jié)間長(zhǎng)度的比較, 0表示雌穗所在節(jié)間、–1表示雌穗下方第一節(jié)、+1表示雌穗上方第一節(jié), 依此類推; B: 野生型KN5585和葉片發(fā)育過程比較?？v坐標(biāo)表示調(diào)查群體內(nèi)植株葉片的平均數(shù), 橫坐標(biāo)表示調(diào)查日期。

A: the comparison of internodes length between the wild type KN5585 and mutant, 0 represents the internode of the ear, –1 represents the first internode below the ear, +1 represents the first internode above the ear, and so on. B: the comparison of leaves development between wild type KN5585 and mutant. The vertical axis shows the average number of leaves in the surveyed population. The horizontal axis indicates the survey date.

表1 突變體lyd1和野生型KN5585的農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)分析

表中數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式呈現(xiàn);**表示< 0.01差異極顯著,*表示< 0.05差異顯著。

Data are present “means ± SDs” in the table;**:< 0.01;*:< 0.05.

對(duì)和野生型最長(zhǎng)節(jié)間進(jìn)行石蠟切片觀察(圖3-A, B)。結(jié)果表明,最長(zhǎng)節(jié)間的10個(gè)細(xì)胞縱向長(zhǎng)度為17.70 μm, 與野生型KN5585最長(zhǎng)節(jié)間的10個(gè)細(xì)胞縱向長(zhǎng)度22.13 μm相比, 減少了20.02%, 差異達(dá)到極顯著水平;最長(zhǎng)節(jié)間細(xì)胞數(shù)目36,003.50個(gè), 野生型KN5585最長(zhǎng)節(jié)間細(xì)胞數(shù)目44,984.00個(gè), 差異達(dá)到極顯著水平(圖3-C, D)。因此,節(jié)間縮短是由于節(jié)間細(xì)胞數(shù)目減少和細(xì)胞縱向長(zhǎng)度縮短共同導(dǎo)致。

圖3 野生型KN5585和突變體lyd1散粉后雌穗穗位下第二節(jié)節(jié)間的石蠟切片觀察

A: 散粉后野生型KN5585最長(zhǎng)節(jié)間(第11葉所在節(jié)間)細(xì)胞觀察; B: 散粉后突變體最長(zhǎng)節(jié)間(第19葉所在節(jié)間)細(xì)胞觀察; C, D: 野生型KN5585最長(zhǎng)節(jié)間和最長(zhǎng)節(jié)間細(xì)胞長(zhǎng)度和數(shù)量的比較。標(biāo)尺: 5 μm;**表示< 0.01差異極顯著。

A: the observation of longest intersegmental (the internode where the 11th leaf is located.) cells of wild type KN5585 after loose powder; B: the observation of longest intersegmental (the internode where the 19th leaf is located.) cells of mutantafter loose powder; C, D: the comparison of longest intersegmental cell length and number between wild type KN5585 and mutant. Bar: 5 μm;**:< 0.01

2.2 突變基因的定位

將[×Mo17] F2作為定位群體, 利用均勻分布在玉米10條染色體上的SSR和Indel標(biāo)記對(duì)、Mo17進(jìn)行多態(tài)性分析, 從中共篩選到172對(duì)具有雙親多態(tài)性的標(biāo)記。將篩選得到的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)正?；虺睾屯蛔兓虺剡M(jìn)行BSA混池分析, 結(jié)果顯示位于3號(hào)染色體上3對(duì)多態(tài)性標(biāo)記Bnlg1019、Indel1、Indel9 (表2)在正?；虺睾屯蛔兓虺刂g存在差異。進(jìn)一步利用[×Mo17] F2中的93株多葉矮化單株進(jìn)行基因分型, 發(fā)現(xiàn)標(biāo)記Bnlg1019、Indel1和Indel9的交換單株分別為35、34和9個(gè), 因此將候選基因定位于玉米3號(hào)染色體標(biāo)記Indel1和Indel9之間。在Indel1和Indel9之間開發(fā)出8對(duì)新的多態(tài)性Indel標(biāo)記, 利用8對(duì)Indel標(biāo)記對(duì)[×Mo17] F2中93個(gè)多葉矮化單株進(jìn)行基因分型, 發(fā)現(xiàn)Indel2、Indel3、Indel4、Indel5、Indel6、Indel7、Indel10、Indel8 (表2)的交換單株數(shù)分別為30、15、10、7、6、2、0和8個(gè), 將定位區(qū)段鎖定在標(biāo)記Indel7和Indel8之間, 物理距離10.94 Mb (圖4-A)。

為了精細(xì)定位, 在標(biāo)記Indel7和Indel8之間新開發(fā)出5對(duì)有多態(tài)性的標(biāo)記。同時(shí)擴(kuò)大定位群體, 利用新開發(fā)的5對(duì)多態(tài)性標(biāo)記對(duì)[×Mo17] F2群體中的剩余的1204株多葉矮化單株進(jìn)行基因分型, Indel7、Indel10、SNP1、Indel11、Indel12、Indel13和Indel8 (表2)的交換單株數(shù)分別為35、6、0、11、11、39和89個(gè), 最終將候選基因定位在Indel10和Indel11標(biāo)記之間, 物理距離約0.74 Mb (圖4-B, C)。

2.3 候選基因分析

根據(jù)B73_V5版本的基因注釋信息, 0.74 Mb定位區(qū)間中共有14個(gè)候選基因, 其中存在1個(gè)假基因(表3)。根據(jù)候選基因的基因組和CDS序列的長(zhǎng)度及擴(kuò)增的難易程度, 對(duì)基因組序列較短且較容易擴(kuò)增的基因擴(kuò)增其基因組序列, 否則擴(kuò)增其CDS序列, 并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示KN5585和之間在基因組上、、、、、和均無序列差異, 在全長(zhǎng)CDS上、、、、均無序列差異。而()在基因組上存在1個(gè)堿基的替換, 為了驗(yàn)證該堿基替換的真實(shí)性, 對(duì)全長(zhǎng)CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增, 發(fā)現(xiàn)該位置的堿基替換在的基因組和CDS序列中穩(wěn)定存在(圖5-A)。全長(zhǎng)4132 bp, 只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子, 編碼664個(gè)氨基酸, 具有3個(gè)典型的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RRM), 編碼一個(gè)RNA結(jié)合蛋白。中堿基替換發(fā)生在第4外顯子上, 位于全長(zhǎng)CDS第1478堿基由A堿基轉(zhuǎn)換為T堿基, 導(dǎo)致第492個(gè)氨基酸由天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸, 該突變的氨基酸殘基位于RRM3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。RRM3在玉米、水稻、擬南芥、小麥、高粱、大豆、藜麥等植物中保守性較高, 并且突變的天冬氨酸也具有較高保守性(圖5-B, C)。

圖4 突變體lyd1的精細(xì)定位

A: 候選基因初步定位在3號(hào)染色體Indel7和Indel8分子標(biāo)記之間; B: 候選基因精細(xì)定位在3號(hào)染色體Indel10和Indel11分子標(biāo)記之間; C: 精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)包含14個(gè)候選基因。橫線上方為分子標(biāo)記, 橫線下方為重組單株數(shù)。

A: the candidate gene was preliminarily located between the Indel7 and Indel8 molecular markers on chromosome 3; B: the candidate gene was finely positioned between the Indel10 and Indel11 molecular markers on chromosome 3; C: there are 14 candidate genes in the fine localization interval. Above the horizontal line is the molecular marker, below the horizontal line is the number of recombinant individual plants.

表2 基因定位相關(guān)標(biāo)記信息

表3 定位區(qū)間內(nèi)候選基因功能注釋

根據(jù)在和野生型差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性SNP引物(SNP1), 以標(biāo)記Indel10和Indel11在[×Mo17] F2定位群體中檢測(cè)到的17個(gè)關(guān)鍵交換單株的基因組DNA為模板, 進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果顯示17個(gè)單株在該位點(diǎn)都顯示的T堿基(圖6), 以上結(jié)果表明該位置發(fā)生的堿基替換與多葉矮化突變表型共分離。

2.4 ZmTE1的表達(dá)分析

利用qRT-PCR分析了在野生型的表達(dá)特征, 結(jié)果顯示在莖尖和幼嫩的雌穗中表達(dá)量較高, 在葉片、莖、雄穗中表達(dá)量很低, 在根中幾乎不表達(dá)(圖7-A)。同時(shí)分析了V3和V7時(shí)期在野生型與莖尖中的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示2個(gè)時(shí)期在突變體和野生型之間的表達(dá)量均未達(dá)顯著差異(圖7-B), 說明A堿基到T堿基的替換可能不影響該基因在莖尖的表達(dá)。

為進(jìn)一步了解蛋白的定位情況, 對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析, 結(jié)果顯示GFP-的GFP信號(hào)與核、膜Marker的信號(hào)很好地重疊(圖8-A), 表明蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上, 這與RNA結(jié)合蛋白在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的mRNA進(jìn)行加工的功能一致。

3 討論

玉米的株高通常由節(jié)間的數(shù)目和節(jié)間長(zhǎng)度決定, 一般來說節(jié)間數(shù)目(葉片數(shù)目)越多, 節(jié)間越長(zhǎng)植株越高。目前已報(bào)道的玉米矮化突變體, 有些葉片數(shù)目不變, 株高降低由節(jié)間長(zhǎng)度縮短導(dǎo)致, 如[10-11]、[27]、[7-9]、[28]過表達(dá)株系[29]等, 有些為葉片數(shù)目減少和節(jié)間長(zhǎng)度縮短, 但葉片數(shù)減少是導(dǎo)致株高降低的主要原因, 如[18]、過表達(dá)株系[30]等。此外還有些玉米矮化突變體, 表現(xiàn)為節(jié)間數(shù)量的增加, 其株高降低是由節(jié)間長(zhǎng)度縮短導(dǎo)致, 如突變體葉片數(shù)較野生型增加3.2片[31];突變體葉片數(shù)較野生型增加1.6片[32];突變體葉片數(shù)較野生型增加1.75片[16]。而本研究發(fā)現(xiàn)的多葉矮化突變體葉片數(shù)較野生型KN5585增加10片葉, 增加了56.18%, 節(jié)間嚴(yán)重縮短, 為研究節(jié)間數(shù)目和節(jié)間長(zhǎng)度的平衡提供了寶貴材料。

圖5 lyd1突變位點(diǎn)及突變位點(diǎn)保守性分析

A: 突變體與野生型KN5585的CDS差異序列比較; B, C:蛋白序列突變氨基酸殘基保守性分析

A: the comparison of CDS difference sequence ofin mutantand wild type KN5585; B, C: the conservative analysis of amino acid residues mutated inprotein sequence.

圖6 野生型KN5585和突變體lyd1的序列差異位點(diǎn)群體驗(yàn)證

圖7 ZmTE1組織表達(dá)分析

A:在野生型KN5585不同組織中的表達(dá); B:在野生型KN5585和突變體中的表達(dá)比較。V3、V7、V11、V17分別表示玉米植株分別有3、7、11、17片完全展開葉所處的時(shí)期。

A: the relative expression level ofgenes in different tissues of wild type KN5585; B: the comparison ofexpression in wild type KN5585 and mutant. V3, V7, V11, and V17 represent the stage when the maize has 3, 7, 11, and 17 fully unfolded leaves, respectively.

圖8 ZmTE1的亞細(xì)胞定位

PC2300-eGFP-與NLS (細(xì)胞核標(biāo)記)和mCherry (細(xì)胞膜標(biāo)記)共定位, 標(biāo)尺為50 μm。

PC2300-eGFP-are colocalized with NLS (nuclear marker) and mCherry (cell membrane marker). Bar: 50 μm.

控制突變表型的基因被定位在玉米3號(hào)染色體, 位于標(biāo)記Indel10和Indel11之間, 物理距離0.74 Mb, 將確定為的關(guān)鍵候選基因。與已報(bào)道的、、突變體的突變位點(diǎn)不同,和突變體中轉(zhuǎn)座子插入在第3外顯子,突變體中轉(zhuǎn)座子插入在第1內(nèi)含子[33],突變體中第1外顯子單堿基的替換導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止[34], 上述已報(bào)道的突變體植株生活力較弱, 難以完成正常生長(zhǎng)發(fā)育, 給后續(xù)研究帶來困難, 并且由于突變位點(diǎn)的不同導(dǎo)致株高降低的程度存在差異, 突變體僅在第4外顯子上發(fā)生1處堿基替換, 植株矮化程度較輕, 且并未出現(xiàn)雌穗和雄穗發(fā)育缺失, 能夠正常生長(zhǎng)。RNA結(jié)合蛋白通過在轉(zhuǎn)錄水平上改變與之結(jié)合RNA的命運(yùn)或功能, 調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[35]。RRM是特征最明確的RNA結(jié)合基序, 其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為βαββαβ, 與RNA的特異性識(shí)別通常發(fā)生在β-sheet的表面[36]。編碼含有3個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白, 但該基因下游的靶標(biāo)RNA尚未找到。突變體中發(fā)生突變的天冬氨酸殘基具有較高的保守性, 且出現(xiàn)在保守性較高的RRM3結(jié)構(gòu)域內(nèi), 位于與RNA的特異性識(shí)別相關(guān)的β-sheet的表面, 因此我們推測(cè)中的點(diǎn)突變可能通過影響與下游RNA的結(jié)合能力進(jìn)而影響其他基因的表達(dá)。由此可見,突變體的發(fā)現(xiàn)對(duì)于從RRM3結(jié)構(gòu)域出發(fā)探索下游靶標(biāo)RNA, 以及解析3個(gè)RRM在多葉矮化表型產(chǎn)生過程中所扮演的角色具有重要研究意義。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)玉米多葉矮化突變體, 其株高較野生型KN5585顯著下降41.79%, 葉片數(shù)較野生型KN5585顯著增加56.18%。該突變表型受一對(duì)隱性核基因控制, 被定位在3號(hào)染色體分子標(biāo)記Indel10和Indel11之間, 物理距離0.74 Mb。進(jìn)一步對(duì)定位區(qū)間內(nèi)候選基因測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)第4外顯子出現(xiàn)1個(gè)堿基替換, 其他基因無差異, 因此, 將確定為突變表型的關(guān)鍵候選基因, 該基因編碼一個(gè)含有3個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白, 突變位點(diǎn)位于第3個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。突變體的發(fā)現(xiàn)為探究玉米葉片數(shù)目(節(jié)間數(shù)目)與節(jié)間長(zhǎng)度的平衡以及二者對(duì)株型發(fā)育的影響提供了寶貴的試驗(yàn)材料。

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Identification and gene cloning of leafy dwarf mutantin maize

SU Shuai, LIU Xiao-Wei, NIU Qun-Kai, SHI Zi-Wen, HOU Yu-Wei, FENG Kai-Jie, RONG Ting-Zhao, and CAO Mo-Ju*

Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Southwest Region, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chengdu 611130, Sichuan, China

The decrease of plant height in maize is usually caused by the decrease in the number of internodes, the shortening of internodes or the combination of both. However, in this study, the mutant() found in the progeny of gene editing, exhibited more leaves and shorter stature. Quantitative measurements indicated the plant height of mutantwas only 93.10 cm, the plant height of wild-type KN5585 was 159.95 cm. The plant height was significantly reduced by 41.79% in mutantcompared with the wild type KN5585. The wild type KN5585 produced an average of 17.8 leaves at maturity stage, whereas mutantsproduced 27.8 leaves. The number of leaves were significantly increased by 56.18% in mutantcompared with the wild type. Genetic analysis showed that the mutation phenotype ofwas controlled by a pair of recessive nuclear genes. We applied a map-based cloning strategy to identify the gene responsible for thephenotype. The gene was located between Indel10 and Indel11 on maize chromosome 3, and the physical distance was 0.74 Mb. Gene sequencing analysis of 13 genes (excluding pseudogenes) within the interval revealed that one base A was substituted in the fourth exon of, and there was no significant difference in other genes.encoded an RNA-binding protein. The amino acid substitution was in the third RNA binding domain (RRM3), resulting in the conversion of aspartic acid to valine. The mutation sites of the mutantwere different from,,, andin previously reported. The discovery ofprovides valuable materials for further analysis of the genetic mechanism of the balance between leaves and internodes development in maize.

maize; the number of leaves; the length of internodes; gene mapping

10.3724/SP.J.1006.2024.33044

本研究由四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2021YFYZ0011, 2021YFYZ0017, MZGC20230108)和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科建設(shè)專項(xiàng)研究支持計(jì)劃項(xiàng)目資助。

This study was supported by the Sichuan Science and Technology Program (2021YFYZ0011, 2021YFYZ0017, MZGC20230108) and the Specific Research Supporting Program for Discipline Construction at Sichuan Agricultural University.

曹墨菊, E-mail: caomj@sicau.edu.cn

E-mail: 1018714902@qq.com

2023-07-31;

2024-01-12;

2024-02-08.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240206.1114.002

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