朱忠林 文 月 周 棋 巫燕飛 杜雪竹,2,* 盛 鋒,*

研究簡報

水稻基因抗倒伏性以及抗旱性功能研究

朱忠林1文 月1周 棋1巫燕飛1杜雪竹1,2,*盛 鋒1,*

1湖北大學生命科學學院 / 省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室, 湖北武漢 430062;2湖北洪山實驗室, 湖北武漢 430062

環(huán)核苷酸門控離子通道是一種配體門控的陽離子通道, 存在于動物和植物體內(nèi), 是真核生物信號級聯(lián)反應的重要組成部分。本研究利用水稻環(huán)核苷酸門控離子通道(cyclic nucleotide-gated channel,)基因, 構建了超表達載體和雙靶點敲除載體, 通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化法獲得敲除和過表達材料, 并從T2代中分離到純合植株及。轉基因植株莖稈特性以及抗倒伏性分析表明, 突變體莖稈強度和抗倒伏性增強; 莖稈細胞壁組織切片以及組織成分分析則表明突變體植株抗倒伏性增強是由于莖稈細胞壁莖壁厚度、薄壁組織細胞豐度以及木質素含量增加所致; 過表達降低了莖稈壁厚、莖稈木質素含量以及莖稈細胞壁細胞豐度, 敲除增加了莖稈木質素含量且增加了莖稈細胞壁薄壁細胞豐度, 初步證明與水稻莖稈細胞壁成分合成相關, 負調控水稻抗倒伏性; T2代田間試驗結果表明, 與野生型相比, 突變體植株的株高、有效穗、穗長、穗粒數(shù)、結實率、千粒重和單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀顯著提升; 苗期干旱脅迫實驗結果表明, 在干旱脅迫下,基因缺陷型植株體內(nèi)丙二醛(MDA)含量積累速度加快, 且無法形成足夠的游離脯氨酸, 而過表達植株在遭受干旱脅迫時, 體內(nèi)游離脯氨酸(Pro)含量大量升高, 且MDA積累速度相對變慢, 初步說明正向調控水稻苗期抗旱性。本研究結果表明水稻可能在水稻抗倒伏及抗旱方面有潛在功能, 為培育抗倒伏且高產(chǎn)的水稻新品種提供了理論基礎和新的種質資源。

水稻;; 抗倒伏; 抗旱; 細胞壁

水稻在世界上分布非常廣泛, 全世界有122個國家種植水稻, 亞洲、歐洲、美洲、非洲和大洋洲都有水稻種植, 栽培面積常年在1.40～1.57億公頃[1]。近年來, 隨著大穗型高產(chǎn)水稻品種的推廣, 以及直播、拋秧等簡化栽培技術的廣泛應用, 水稻倒伏的潛在風險越來越大[2]。田間發(fā)生倒伏時, 水稻的產(chǎn)量、品質均會降低, 機械收割也會受到嚴重阻礙。中國南方的水稻產(chǎn)量因倒伏通常會下降10%～30%, 嚴重時甚至會下降80%。此外, 水稻的產(chǎn)量受到干旱、高溫等不良氣候的制約。據(jù)統(tǒng)計, 我國每年因干旱導致水稻減產(chǎn)到總產(chǎn)量的13.1%, 嚴重制約水稻生產(chǎn)。因此, 培育抗倒伏、抗旱的優(yōu)質高產(chǎn)水稻新品種, 保持水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)以滿足日益增長的糧食需求迫在眉睫。

環(huán)核苷酸門控離子通道(Cyclic nucleotide-gated channel, CNGC)是一種配體門控的陽離子通道, 主要分布在質膜上[3-4], 存在于動物和植物體內(nèi), 是真核生物信號級聯(lián)反應的重要組成部分。1998年, Schuurink等[5]首次在植物體內(nèi)克隆了CNGC。Arazi等[6]研究認為NtPB4與最近報道的具有相似功能，參與植物體內(nèi)金屬離子轉運。Talke等[7]研究表明CNGC可作為植物環(huán)核苷酸信號的主要靶標。Kaplan等[8]和Yuan等[9]對模式植物擬南芥CNGC家族進行鑒定和功能分析, 發(fā)現(xiàn)擬南芥CNGCs家族共有20個成員, 分布于擬南芥各個組織和器官, 參與擬南芥生長發(fā)育以及在響應外界環(huán)境刺激行使一定功能。作為植物發(fā)育和逆境耐受性的調節(jié)因子,參與了植物Ca2+的吸收[10]。朱天全[11]在對和的研究中認為,與野生型擬南芥相比, 在苗期會有嚴重的矮化表型, 且花期會延遲。Tan等[12]研究認為CNGC5、CNGC6和CNGC9是擬南芥中構成性根毛尖端生長和生長素信號傳導所必需的3個關鍵Ca2+通道。Jin等[13]研究結果表明負調控擬南芥的耐鹽性, 可能參與了Na+的轉運。Meral等[14]認為CNGC7和CNGC8至少是部分功能冗余, 并在花粉管頂端生長的啟動過程中提供了必要的功能。同時, 該研究者的另一項工作表明對高溫和干旱條件下的花粉育性至關重要[15]。植物CNGCs還存在可能參與調控生長發(fā)育等諸多潛在的功能, 需要進一步發(fā)掘并解析其作用機理。

在我們先前的工作中, 鑒定了水稻CNGCs共有16個成員, 進一步的非生物脅迫的誘導模式分析發(fā)現(xiàn)(_)受多種非生物脅迫誘導上調表達[16]。為了進一步驗證其功能, 本研究構建了超表達載體以及敲除載體, 利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化法獲得轉基因材料, 在T1代進行穩(wěn)定繁育時發(fā)現(xiàn)突變體植株表現(xiàn)出持綠性好、莖稈粗壯、根系發(fā)達等抗倒伏性狀, 為了進一步研究其抗倒伏性, 從T2代中分離到純合植株, 調查了轉基因植株的抗倒伏性, 田間植株表型, 農(nóng)藝性狀, 并分析了轉基因材料的莖稈外觀結構、莖稈強度、莖稈的解剖結構等與植株抗倒伏性的關系。此外, 還考察了轉基因植株在苗期抵御干旱脅迫的能力。本研究結果揭示了水稻基因可能在抗倒伏及抗旱方面有潛在作用, 為培育抗倒伏抗旱的水稻新品種提供了理論基礎及新的種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以粳稻野生型日本晴(spp.)為背景材料, 進行遺傳轉化。轉化用的農(nóng)桿菌為EHA105菌種, 原核感受態(tài)為大腸桿菌DH5α菌株。PGEM-Teasy載體(Promega)、PTGR質粒、載體及載體均由實驗室提供。DNA marker (DL2000)、逆轉錄酶、反轉錄試劑盒(TaKaRa Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser)購買于TaKaRa公司; Easy酶、T4-DNA連接酶、2 K DNA marker (Trans 2K)購買于北京全式金生物技術有限公司; 植物RNA提取試劑盒購于普洛麥格(北京)生物技術有限公司; MS培養(yǎng)基粉末購于武漢天源慧達生物科技有限公司; 纖維素(CLL)含量檢測試劑盒、木質素含量檢測試劑盒(紫外比色法)、半纖維素含量檢測試劑盒(微量法)購于生工生物工程(上海)股份有限公司, 植物番紅染綠試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司, 丙二醛含量檢測試劑盒、脯氨酸含量檢測試劑盒購自索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超表達載體構建 取幼嫩野生型日本晴水稻葉片, 提取RNA并反轉錄成cDNA。以cDNA為模板, 設計擴增引物(OsCNGC10-F/OsCNGC10-R)將目的基因片段進行PCR擴增(表1); 將產(chǎn)物與PGEM-Teasy載體連接, 將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌感受態(tài)中培養(yǎng), 挑選克隆進行陽性鑒定, 回收陽性質粒; 設計帶載體接頭的引物(OsCNGC10-Flag-F/OsCNGC10-Flag-R), 以回收的陽性質粒為模板進行PCR擴增帶載體接頭的基因; 使用限制性核酸內(nèi)切酶(I、HI)將載體雙酶切, 利用諾維贊的同源重組酶將帶接頭的目的基因和雙酶切后線性化的載體In-fusion連接, 得到重組載體()。

表1 本研究所用核苷酸序列及相應引物

1.2.2 敲除載體構建 利用華中農(nóng)業(yè)大學開發(fā)的CRISPR-P 2.0 (CRISPR-P v2.0 hzau.edu.cn)設計的sgRNA序列(sgRNA1: 3'-TCAAGAGGCAG AGAACCGTG-5'; sgRNA2: 3'-CACGGTTCTCTGCCTCTT GA-5'); 設計獲得短片段所需引物(L5AD5-F/CNGC10- gRNA1-U3R、CNGC10-gRNA1-U3F/CNGC10-gRNA2- U3R、CNGC10-gRNA2-U3F/L5AD5-R、gRNA2-U3F/ L5AD5-R), 以PTGR質粒做模板, 進行3組PCR擴增, 得到3個短片段PCR產(chǎn)物。再設計串聯(lián)結構所需引物(S5AD-F/S5AD-R), 將3個PCR產(chǎn)物作為模板, 再次進行PCR擴增, 得到串聯(lián)結構。使用限制性核酸內(nèi)切酶I將pRGEB32載體進行雙酶切, 再利用同源重組酶進行In-fusion連接, 得到重組終載體。

1.2.3 基因表達量分析 取幼嫩野生型日本晴水稻葉片提取RNA, 利用TaKaRa提供的反轉錄酶試劑盒, 對抽提后的RNA樣品反轉錄成cDNA。設計RT-qPCR引物, 以(,)作為內(nèi)參基因, 于CFX Connect Real-Time System (Bio-Rad)進行RT-qPCR分析, 采用2–??CT計算基因的相對表達量, 每個樣本設置3次生物學重復。

1.2.4 編輯植株的突變類型檢測鑒定 為檢測編輯植株中基因的突變情況, 分別在2個靶位點兩端設計引物OsCNGC10-target1-F/OsCNGC10-target1-R和OsCNGC10-target2-F/OsCNGC10-target2-R, 提取基因編輯材料的T2代幼苗葉片DNA作為模板, 進行PCR擴增, 擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序, 以野生型日本晴水稻 DNA 為模板的擴增產(chǎn)物片段序列為參照, 分析編輯植株的基因突變類型。

1.2.5 轉基因植株農(nóng)藝性狀考察 轉基因植株幼苗經(jīng)鑒定后移栽至湖北大學生命科學學院試驗基地, 依據(jù)當?shù)爻Ｒ?guī)稻田管理方式進行水肥管理、病蟲草害防除。選取成熟期長勢一致的超表達植株以及突變體水稻植株各10株, 考察株高、有效穗、穗長、有效分蘗、每穗粒數(shù)、千粒重、經(jīng)濟產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀。

1.2.6 莖稈形態(tài)分析 在水稻始穗后15 d, 隨機選取轉基因植株和野生型日本晴各10株。測量所有單莖地上基部第一、二節(jié)的節(jié)間長, 節(jié)粗及壁厚; 并選取節(jié)間上、中、下3個點, 利用數(shù)顯式游標卡尺分別測量莖稈長軸、短軸的莖粗; 將莖稈從中部縱切, 均勻選取2點, 利用數(shù)顯式游標卡尺測量壁厚。

1.2.7 莖稈強度測定 水稻始穗后15 d, 每株系選取代表性植株5株調查, 用莖稈強度測定儀(DIK-7400, 日本)測定轉基因植株和野生型日本晴的莖稈強度。選取單株水稻所有莖稈, 在莖稈中部捆扎, 測量時保持莖稈強度測定儀垂直于莖稈中部捆扎點, 緩慢均勻用力, 直到莖稈與地面成45度, 記錄儀器峰值(單位: 牛頓 N), 每株測量3次。

1.2.8 莖稈細胞壁組織切片觀察 將水稻莖稈基部第3節(jié)切成1～2 mm的薄片, 置于載玻片上, 加一滴植物番紅染色液, 染色1 min; 吸去植物番紅, 加蒸餾水清洗3次,吸去多余水分; 加一滴植物固綠染液, 染色30 s; 吸去植物固綠, 加蒸餾水清洗3次, 吸去多余水分; 加水封片, 吸去多余水分后置于生物顯微鏡下觀察。

1.2.9 莖稈細胞壁組織成分分析 根據(jù)Van Soest等[17]方法稍加修改, 使用生工生物工程(上海)股份有限公司的試劑盒測定細胞壁組分及含量。選取抽穗期水稻材料, 將莖稈與葉鞘分離, 取每株主莖桿, 于電熱鼓風干燥箱中105℃殺青15 min, 80℃烘干2 h, 50℃烘干至恒重; 將烘干的水稻莖稈剪碎, 使用磨樣儀磨成粉末, 過40目篩, 裝入2.0 mL EP管中, 干燥條件保存待用。

1.2.10 幼苗期干旱脅迫處理 選取T2代超表達植株, 突變體與野生型日本晴為試驗材料, 種子經(jīng)浸泡、催芽后, 利用1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d至四葉一心期, 挑選生長狀態(tài)良好、長勢一致的植株幼苗移栽至溫室, 緩苗一周。倒掉穴盤中的多余營養(yǎng)液, 斷水, 每個處理設3次重復。脅迫15 d后, 每個處理選取6株用于觀察幼苗表型, 處理后統(tǒng)計幼苗存活率。

1.2.11 生理生化指標測定 采用北京索萊寶科技有限公司的丙二醛含量檢測試劑盒、脯氨酸含量檢測試劑盒進行測定。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理與分析 采用IBM SPSS 25對本文試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 OsCNGC10超表達載體獲得

從水稻基因組數(shù)據(jù)庫RGAP下載基因的相關序列, 從水稻日本晴克隆出的CDS序列, 利用同源重組酶將和線性化后的進行In-fusion連接, 得到重組終載體。將接連產(chǎn)物轉化到大腸桿菌中, 挑單克隆搖菌, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶正確后, 送菌液測序。將測序結果正確的返樣質粒轉化到農(nóng)桿菌中,挑單克隆搖菌, 并進行菌落PCR。挑選菌落PCR結果中條帶大小正確的菌液–80℃保存(圖1)。

2.2 OSCNGC10敲除載體獲得

本研究所用雙靶點敲除載體的構建方式是在華中農(nóng)業(yè)大學謝卡斌教授研究團隊開創(chuàng)的tRNA串聯(lián)法的基礎上加以調整[18]。依據(jù)DNA序列以及基因結構, 設計2個gRNA合成接頭引物以及gRNA連入表達載體所需的接頭引物(表1); 采用infusion重組的方法將串聯(lián)好的PCR產(chǎn)物到線性化的載體中。將上述反應產(chǎn)物熱激轉化大腸桿菌DH5α, 挑單克隆進行陽性檢測并測序, 保存陽性菌株和質粒, 并將陽性質粒轉化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)(圖2)。

圖1 OsCNGC10超表達載體菌落PCR

M: Trans 2K; 1～8: 菌落PCR片段。

M: Trans 2K; 1–8: the colony PCR fragments.

圖2 OsCNGC10敲除終載體菌落PCR檢測

M: Trans 2K; 1～8: 菌落PCR片段。

M: Trans 2K; 1–8: the colony PCR fragments.

2.3 OsCNGC10轉基因材料獲得及陽性鑒定

利用農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化, 分別獲得基因的過表達植株12株, 敲除植株11株。用潮霉素引物(OsHyg-F/OsHyg-R)對該23株轉化幼苗進行PCR陽性檢測, 得到8株超表達苗和8株敲除苗(圖3- A)。經(jīng)過表達量分析以及靶點解碼分析, 最終選取表達量相對較高的超表達株系(圖3-B)以及單堿基缺失的純合突變株系(圖3-C)作為后續(xù)試驗材料, 并自交繁育得到純合材料。

2.4 OsCNGC10轉基因材料田間表型鑒定

對轉基因材料全生育期表型觀察發(fā)現(xiàn), 與野生型相比, 轉基因植株表型在抽穗期和結實期都有較大差異(圖4-A, B)。株系在抽穗期前生長緩慢, 其株高顯著低于和WT。但當植株發(fā)育后期尤其是抽穗期后長勢明顯提高, 株高顯著高于野生型和過表達株系, 表現(xiàn)出持綠性好、莖稈粗壯和抗倒伏性強的優(yōu)勢(圖4-C, D)。

圖3 T0代轉基因植株的陽性鑒定

(A): 轉基因植株陽性鑒定; (B): 超表達株系表達量分析; (C): 敲除株系靶點解碼分析。M: Trans 2K; N: 陰性對照。

(A): positive identification of transgenic plants; (B): the expression analysis of the overexpression lines; (C): target decoding analysis in knockout lines. M: Trans 2K; N: the negative control.

圖4 轉基因植株及野生型(WT)株型

(A): 轉基因材料以及野生型田間抽穗期表型; (B): 轉基因材料以及野生型田間成熟期表型; (C): 轉基因材料以及野生型抽穗期單株表型; (D): 轉基因材料以及野生型成熟期單株表型。

(A): transgenic materials and field phenotypes of wild type at heading stage; (B): transgenic materials and wild type phenotypes at field maturity stage; (C): transgenic materials and single plant phenotypes of wild type at heading stages; (D): transgenic materials and single plant phenotypes of wild type at maturity stage.

2.5 轉基因植株莖稈特性以及抗倒伏性分析

為了進一步探究在水稻抗倒伏方面的特性, 對同處于齊穗期15 d左右的轉基因材料進行抗倒伏性測定。取該時期的不同材料莖稈測量基部節(jié)間間距, 并觀察其根部生長差異。結果表明: 與野生型日本晴WT相比,地上三節(jié)節(jié)間距變短(圖5-A), 根長顯著變長, 根冠顯著變大(圖5-B); 且莖壁厚度顯著增加, 莖稈強度顯著增強, 而相較于WT則無顯著差別(表2)。

圖 5 轉基因植株及野生型(WT)基部節(jié)間形態(tài)

表2 轉基因植株與野生型莖稈強度分析

**表示在0.01概率水平顯著相關;*表示在0.05概率水平顯著相關。

**: the correlation is significant at the 0.01 probability level;*: the correlation is significant at the 0.05 probability level.

2.6 莖稈細胞壁組織切片觀察

為進一步探究株系莖稈抗倒伏能力的提升是否與細胞壁結構改變有關, 對同處于抽穗期的轉基因材料取倒二節(jié)進行徒手切片觀察。利用植物番紅染綠進行染色, 在光學顯微鏡下成像, 并截取對應位置于體視鏡下放大, 觀察細胞壁厚(CWT)和稈壁厚度(SWT)。結果發(fā)現(xiàn),植株莖稈細胞壁的CWT和SWT均顯著高于野生型WT, 而則為三者最低(圖6)。因此推測, 敲除引起細胞壁結構的改變, 細胞壁厚度和桿壁厚度增加, 導致了敲除植株莖稈特性的改變從而提高了抗倒伏能力。

2.7 莖稈細胞壁組織成分分析

研究認為, 水稻莖稈細胞壁的主要成分及其含量與水稻抗倒伏能力之間有密切聯(lián)系。水稻莖稈物質含量豐富且復雜, 含有組成細胞壁的木質素、纖維素、半纖維素等。為了研究轉基因材料的抗倒伏性差異是否由于細胞壁組分變化引起, 本試驗對轉基因材料成熟期的莖稈細胞壁主要成分(木質素、纖維素、半纖維素)的含量進行測定。結果表明, 與野生型相比, 在每1 g水稻莖稈粉末中,的木質素含量最高, 且顯著高于WT, 而木質素含量最低。轉基因材料與野生型相比, 纖維素以及半纖維素含量則無顯著差異(圖7)。由此推測, 敲除植株莖稈強度增強的原因, 可能是因為敲除該基因影響了控制木質素合成相關途徑, 從而引起了木質素合成的大量增加而使其莖稈變粗, 抗倒伏性增強。

圖6 轉基因植株與野生型(WT)組織切片顯微鏡觀察

CWT: 莖壁厚度; SWT: 稈壁厚度。

CWT: cell wall thickness; SWT: straw wall thickness.

圖7 轉基因植株與野生型(WT)細胞壁主要成分分析

Cellulose: 纖維素; Lignin: 木質素; Hemicellulose: 半纖維素。

*表示在0.05概率水平顯著相關。

*: the correlation is significant at the 0.05 probability level.

2.8 OsCNGC10轉基因材料農(nóng)藝性狀分析

對轉基因材料生育期調查發(fā)現(xiàn), 同時移栽的秧苗,營養(yǎng)生長期要比和WT更長, 孕穗期推遲, 全生育期為137 d, 比野生型長7 d (表3)。而過表達材料與野生型相比生育期縮短了9 d。成熟期農(nóng)藝性狀統(tǒng)計分析結果顯示, 突變體除分蘗數(shù)降低以外, 其株高、穗長、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、千粒重和理論產(chǎn)量均顯著高于野生型日本晴和過表達材料。

表3 轉基因植株與野生型(WT)農(nóng)藝性狀分析

**表示在0.01概率水平顯著相關;*表示在0.05概率水平顯著相關。

**: the correlation is significant at the 0.01 probability level;*: the correlation is significant at the 0.05 probability level.

2.9 OsCNGC10調控水稻抗旱性表型鑒定

挑選生長狀態(tài)較好且長勢一致的植株幼苗移栽至溫室, 待緩苗一周后倒掉穴盤中的多余營養(yǎng)液, 進行斷水干旱處理。干旱脅迫處理15 d后, 觀察發(fā)現(xiàn),植株葉片干枯卷曲, 部分植株死亡; 但過表達材料僅有少數(shù)幾片葉卷曲, 大部分植株葉片舒展, 生長狀態(tài)良好(圖8-A)。同時, 干旱脅迫后野生型以及轉基因材料的死亡率統(tǒng)計表明: 相對于野生型, 超表達材料死亡率更低, 而敲除材料死亡率則高于野生型(圖8-B)。脅迫結果表明:基因功能缺失導致植株對干旱的脅迫承受能力降低, 而過表達則提高了水稻苗期抗旱能力。

2.10 水稻葉片Pro、MDA含量測定分析

植物在遭受干旱脅迫時, 植株體內(nèi)抵御逆境的相關成分含量會發(fā)生變化, 如脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)等。為探究在干旱脅迫下對水稻葉片Pro和MDA含量的影響, 對干旱脅迫后水稻葉片中Pro和MDA含量進行了測定。測定結果發(fā)現(xiàn)在干旱處理15 d后, 每1 g葉片中,的Pro含量顯著低于野生型, 過表達材料中Pro含量相對于野生型顯著升高(圖9-A)。同時, 干旱脅迫15 d后, 每1 g水稻葉片中MDA含量顯著降低, 而葉片中MDA含量則顯著升高(圖9-B)。結果表明, 在干旱脅迫下,基因缺陷型植株無法形成足夠的游離脯氨酸, 同時干旱脅迫下該基因缺陷型植株體內(nèi)MDA含量積累速度加快。而過表達植株在遭受干旱脅迫時, 體內(nèi)游離Pro含量大量升高, 且MDA積累速度相對變慢, 這說明了正向調控水稻苗期抗旱性。

圖8 轉基因植株與野生型(WT)苗期干旱脅迫15 d表型以及存活率

*表示在0.05概率水平顯著相關。標尺為20 cm。*: the correlation is significant at the 0.05 probability level. Bar: 20 cm.

圖9 轉基因植株與野生型(WT)苗期干旱脅迫15 d后Pro及MDA含量

A: 植株葉片脯氨酸含量; B: 植株葉片丙二醛含量。***表示在0.01概率水平顯著相關;*表示在0.05概率水平顯著相關。

A: proline content in the leaves of the plants; B: MDA content in the leaves of the plants.**: the correlation is significant at the 0.01 pro-bability level;*: the correlation is significant at the 0.05 probability level.

3 討論

近些年來, 由于全球氣候變暖和環(huán)境污染加劇, 全球糧食產(chǎn)量及儲量也有了新的需求。如何提升作物面對諸如倒伏, 干旱等非生物脅迫的能力, 將經(jīng)濟損失降到最低, 是近些年來植物領域研究的熱點之一。

倒伏對作物的品質及產(chǎn)量有重要影響, 通過基因工程手段選育具有抗倒伏能力的水稻品種對水稻育種具有重要意義。研究表明, 節(jié)間數(shù)、節(jié)間長、莖粗、莖壁厚以及大小維管束數(shù)目等形態(tài)性狀均與抗倒伏能力有關[19]。莖基粗、莖基厚與莖稈強度呈正相關, 增加節(jié)間莖粗以及莖壁厚度可以有效提高水稻抗倒伏能力[20]。Yano等[21]將攜帶基因的植株與帶有基因的水稻材料聚合雜交構建近等基因系, 獲得了莖稈強度增強而產(chǎn)量不變的水稻材料。在本試驗中, 著重研究了水稻莖稈特性。結果顯示, 敲除植株莖稈強度顯著提高, 且壁厚增加, 莖稈所含的木質素含量也增加。由此推測, 敲除會影響木質素合成相關途徑, 但需要進一步試驗探索。株高作為植物結構的重要組成部分之一, 與水稻的抗倒伏能力密切相關[22]。但有研究認為株高并不是影響水稻倒伏的最主要因素, 高稈不是倒伏的直接原因, 水稻的抗倒能力在品種之間存在不一致性, 高稈不一定易倒伏, 矮稈不一定抗倒。在適宜的栽培條件下, 并不是株高越高, 倒伏指數(shù)就越高[23-25]。與野生型日本晴相比, 突變體水稻株高在抽穗期前矮于野生型, 但同處于抽穗結實期時, 突變體植株株高更高, 且其抗倒伏能力增強。此外, 以往的大多數(shù)研究在注重矮稈抗倒伏這一性狀時, 拋棄了產(chǎn)量這一重要因素, 本研究后續(xù)試驗結果顯示, 在增強了高稈水稻的抗倒伏能力的同時, 稻米產(chǎn)量也得到了提升, 這對水稻種質資源創(chuàng)新提供了一個很好的思路。

作為一種固著生物, 水稻極易受到各種非生物和生物脅迫帶來的危害。干旱對水稻產(chǎn)量造成了嚴重影響, 對水稻的供應構成了威脅。通過現(xiàn)代分子生物學技術提高水稻對干旱脅迫的耐受性, 成為當前維持糧食安全行之有效的途徑之一[26-27]。水稻的抗旱性是由多種類型的基因控制的復雜性狀, 目前已發(fā)現(xiàn)一些基因可以在干旱、鹽、低溫、高溫等非生物脅迫條件下調控水稻產(chǎn)量, 超表達(或敲除)這些基因可以提高轉基因水稻的抗性及產(chǎn)量[28]。Hu等[29]研究認為通過基因工程手段聚合或導入外源抗旱基因可以提高水稻抗旱能力。Zhang等[30]將番茄中基因轉入水稻中, 研究發(fā)現(xiàn)過表達可以顯著提高水稻耐旱性, 且不影響轉基因水稻的生長發(fā)育。李兆偉等[31]通過基因編輯對突變體材料的耐旱型進行考察, 表明轉錄因子OsNAC2d正調控水稻響應干旱脅迫。Xu等[32]研究認為超表達能夠上調木質素合成基因和 ABA 信號通路關鍵基因來提高水稻的抗旱性, 并最終提高產(chǎn)量。楊建昌等[33]研究認為, 耐旱性更強的水稻品種的抗氧化系統(tǒng)更加強大, 能夠快速清除積累的MDA, 因此, 能否快速消除積累的MDA可以作為水稻耐旱性的檢測標準之一。同時, 以Pro為代表的一類滲透調節(jié)物質能夠緩解干旱等非生物脅迫對植物造成的傷害, 從而維持植物細胞膨壓和正常生理活動[34]。本試驗前期通過PEG模擬干旱下OsCNGCs基因家族的表達模式分析表明,受PEG脅迫誘導上調明顯[16]。苗期干旱脅迫試驗結果表明, 干旱脅迫處理15 d后,植株葉片干枯卷曲, 部分植株死亡; 但過表達材料僅有少數(shù)幾片葉卷曲, 大部分植株葉片舒展, 生長狀態(tài)良好。同時,植株無法形成足夠的游離Pro, 且植株體內(nèi)MDA含量積累速度加快; 而過表達植株在遭受干旱脅迫時, 體內(nèi)游離Pro含量大量升高, 且MDA積累速度相對變慢, 這說明了正向調控水稻苗期抗旱性。

植物CNGCs功能多樣且復雜, 目前在水稻中的研究尚且較少。關于是如何調控水稻的抗倒伏性和抗旱性尚不清楚, 有待進一步研究。

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Mechanism of loding residence and drought tolerance ofgene in rice

ZHU Zhong-Lin1, WEN Yue1, ZHOU Qi1, WU Yan-Fei1, DU Xue-Zhu1,2,*, and SHENG Feng1,*

1School of Life Sciences, Hubei University / State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, Wuhan 430062, Hubei, China;2Hubei Hongshan Laboratory, Wuhan 430062, Hubei, China

Cyclic nucleotide-gated ion channels are ligand-gated cationic channels that exist in animals and plants, which are an important part of eukaryotic signaling cascades. In this study,(cyclic nucleotide-gated channel) gene in rice was used, and the overexpression vectorand the double-target knockout vectorwere constructed. The knockout and overexpression materials were obtained by Agrobacterium-mediated genetic transformation. Homozygous plantsandwere isolated from T2generation. The analysis of stem characteristics and lodging resistance of transgenic plants showed thathad enhanced stem strength and lodging resistance. Stem cell wall sections and tissue composition analysis showed thatincreased lodging resistance due to the increase of stem wall thickness, parenchyma cell abundance, and lignin content. The knockout ofincreased the lignin content and the abundance of stem-cell wall parenchyma cells. The overexpression ofreduced stem wall thickness, lignin content, and cell abundance in stem cell wall, while the knockdown ofincreased lignin content and increased the abundance of thin-walled cells in stem cell wall, suggesting thatwas associated with the composition of stem cell wall and negatively regulated lodging resistance in rice. T2generation field experiment indicated that compared with the wild type,significantly increased plant height, the effective panicle length, panicle number, seed setting rate, 1000-grain weight, and yield per plant. The results of drought stress at seedling stage showed that malondialdehyde (MDA) content accumulated rapidly indefective plants under drought stress and insufficient free proline (Pro) was formed, while the free Pro content inplants was significantly increased. Moreover, the MDA accumulation rate was relativelyslow, which preliminarily indicated thatpositively regulated the drought resistance at seedling stage. The results of this study indicated thatmight have a potential function in lodging resistance and drought resistance in rice, which providing a theoretical basis and new germplasm resources for the breeding lodging resistance and high yield of new rice varieties.

rice;; lodging resistance; drought tolerance; cell wall

10.3724/SP.J.1006.2024.32027

本研究由武漢市生物技術關鍵技術科技重大專項(2022021302024851)和糧食作物種質創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室開放課題項目(2018lzjj01)資助。

This study was supported by the Wuhan Municipal Key Technology Project of Biotechnology (2022021302024851) and the Hubei Provincial Key Laboratory of Grain Crop Germplasm Innovation and Genetic Improvement (2018LZJJ01).

盛鋒, E-mail: shengfsk@163.com; 杜雪竹, E-mail: duxeuzhusk@163.com

E-mail: 1418369969@qq.com

2023-07-20;

2024-01-12;

2024-02-19.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240219.1122.014

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