■ 張嘉文 張 玲 李 民 陳秀梅 王桂芹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，吉林長春 130118；4.河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院，河南鄭州 450003）

烏鱧（Channa argus）為兇猛肉食性魚類，具有適應(yīng)環(huán)境能力強，單產(chǎn)高等特點，是我國漁業(yè)規(guī)劃重點發(fā)展對象[10]。烏鱧體內(nèi)含有足夠多的礦物質(zhì)元素，在Fe、Ca 和Zn 等含量上尤為突出。烏鱧體內(nèi)的氨基酸總量也較高，它可以有效地加快創(chuàng)口的愈合，具有很高的輔助醫(yī)療價值[11]。此外，由于烏鱧體內(nèi)沒有肌間細刺，且具有高投入、高產(chǎn)出的特點，廣受養(yǎng)殖戶的青睞。近些年來，魚類磷需求量已有相關(guān)報道，例如大口黑鱸（Micropterus salmoides）的磷需求量為8.7～8.9 g/kg[12]，鳙魚（Aristichthys nobilis）[13]的磷需求量為7.16 g/kg，印度囊鰓鯰（Heteropneustes fossilis）[14]磷的需要量為9～11 g/kg。在烏鱧的養(yǎng)殖過程中，目前還鮮有關(guān)于烏鱧幼魚飼料中有效磷含量的研究。所以在養(yǎng)殖過程中，飼料中添加磷元素含量的上下浮動較大，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖尾排水磷含量升高或產(chǎn)生脂肪肝等現(xiàn)象。因此，本試驗以烏鱧為研究對象，探究烏鱧的飼料中最佳有效磷水平，促進烏鱧肝臟的糖脂代謝，提高烏鱧的免疫能力，減少烏鱧養(yǎng)殖用藥量，為烏鱧的精準磷營養(yǎng)提供理論依據(jù)，推動烏鱧養(yǎng)殖向綠色環(huán)保可持續(xù)方向發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼料制備

試驗以魚粉、豆粕和酪蛋白為蛋白源，以魚油和豆油為脂肪源。其中對照組飼料中磷元素來源為魚粉、豆粕和酪蛋白，根據(jù)《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表（2021 年第32 版）》計算得出每100 g 飼料中有效磷含量占比0.41%。在對照組飼料的基礎(chǔ)上添加不同含量的NaH2PO4制成6 組不同水平飼料[有效磷含量為0.41%（對照組，1 組）、0.64%（2 組）、0.86%（3 組）、1.09%（4 組）、1.31%（5 組）、1.57%（6 組）]。將各種飼料原料磨碎，攪拌均勻，制成1.5 mm 左右的顆粒，貯藏于-20 ℃。試驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

在正式開展試驗之前，先將采購的烏鱧暫養(yǎng)15 d，并對其進行人工馴化。在馴化成熟后，從采購的烏鱧中選取了體型相似、身體發(fā)育情況良好，適應(yīng)環(huán)境能力較強的540 尾烏鱧幼魚，將其分為6 個水平，進行8 周的飼養(yǎng)試驗。用上述6種不同有效磷含量的試驗日糧飼喂，一日投喂兩次（8：00、20：00），投喂量為魚體重量的3%～5%。喂食1 h 后，將剩余的餌料吸凈，稱量，并調(diào)整投喂量。養(yǎng)殖水溫保持在26 ℃，pH 7.5±0.1，氨氮＜0.5 mg/L，亞硝酸鹽＜0.05 mg/L，溶解氧＞7.0 mg/L。

1.2 樣品采集與指標測定

在采集樣本之前，需要進行24 h 的禁食處理，在每個處理組中，隨機選擇15 尾魚用MS-222 溶液麻醉，其中5 尾魚被用來測定魚體組成，另外10 尾魚進行稱重和體長測量；尾靜脈抽取血液，置于4 ℃冰箱中靜置12 h 后離心10 min（4 ℃，2 500 r/min）后收集血清，存放于-20 ℃冰箱中備用。取出內(nèi)臟后，去掉內(nèi)臟上附著的脂肪并稱重，記錄并計算肝體比（HSI）與臟體比（VSI）；取其中5 尾魚的魚鱗與椎骨，將魚鱗與椎骨處理干凈烘干備用。

飼料與全魚營養(yǎng)成分的測定參照牛小天等[15]的方法。

采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒檢測烏鱧血清中血清磷含量、總膽固醇（TC）含量、三酰甘油（TG）含量、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.3 指標測定公式

特定生長率（SGR，%/d）=[ln（Wf/Wi）/t]×100

蛋白質(zhì)效率（PER，%）=Wg/I×Pf×100

①點主要是民居的庭院，在其中要創(chuàng)建相應(yīng)的綠化，民居自身要展現(xiàn)出特色，擁有良好的視覺效果，并展現(xiàn)出高質(zhì)量的環(huán)境效果。②線主要是農(nóng)村內(nèi)部的街道。農(nóng)村內(nèi)部空間不僅是要和居民的視覺生活相吻合，還應(yīng)該擁有相應(yīng)的綠色線路，展現(xiàn)出完善的景觀廊道，并關(guān)注其和外部之間存在的關(guān)系。比如，農(nóng)村內(nèi)部的廣場應(yīng)該和街道之間形成聯(lián)系，讓居民交往變得更加通暢。③環(huán)就是農(nóng)業(yè)地區(qū)的景觀林帶。企業(yè)和民居所處區(qū)域之間要形成隔離帶，這主要是讓生活和工作相互分離，讓經(jīng)濟和環(huán)境之間協(xié)調(diào)發(fā)展和運行。

飼料效率（FER，%）=（Wf-Wi）/I×100

肝體比（HSI，%）=Wh/Wf×100

臟體比（VSI，%）=Wv/Wf×100

式中：Wi、Wf——初始體質(zhì)量、末體質(zhì)量（g）；

Wg——體增質(zhì)量（g）；

Wh、Wv——肝臟質(zhì)量和內(nèi)臟團質(zhì)量（g）；

T——飼養(yǎng)天數(shù)（d）；

I——飼料攝入量（g）；

Pf——飼料中蛋白質(zhì)的含量（%）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

經(jīng)過SPSS 20.0統(tǒng)計處理，所得數(shù)據(jù)通過Duncan’s法來分析均值間的差異程度，以“平均數(shù)±標準差（Mean±SD）”表示。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚生長性能的影響

由表2可知，8周的飼養(yǎng)試驗結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，飼料中不同水平的有效磷含量影響烏鱧的生長性能。在本試驗中，有效磷含量低于0.86%時，末體質(zhì)量（FW）、特定生長率（SGR）、蛋白質(zhì)效率（PER）和飼料效率（FCR）呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。通過對6組樣本進行統(tǒng)計分析得出，其他5 組VSI 顯著高于有效磷含量1.09%組（P＜0.05）。將飼料有效磷含量作為自變量，SGR 和PER作為因變量進行拋物線回歸分析，得到拋物線回歸方程分別為y=-1.252x2+2.451 4x+1.322 3（R2=0.960 4）和y=-1.484 9x2+3.148 9x+0.540 9（R2=0.951 5）。由上述回歸方程計算得出，有效磷含量分別為0.98%和1.06%時，SGR以及PER得到最大值（圖1、圖2）。

圖1 飼料有效磷含量對烏鱧特定生長率的影響

圖2 飼料有效磷含量對烏鱧蛋白質(zhì)效率的影響

表2 飼料不同有效磷水平對烏鱧幼魚生長性能的影響

2.2 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚血清生化指標和抗氧化能力的影響

如表3 所示，當飼料中有效磷含量小于1.09%時，血清中TC 和LDL-C 的含量隨著飼料中有效磷升高而下降；當飼料中有效磷的含量大于1.09%時，血清中的TC 和LDL 含量呈現(xiàn)升高趨勢。當飼料中有效磷含量小于0.86%時，血清中TG 的含量隨著飼料中有效磷含量的上升而下降，而后呈現(xiàn)相反趨勢。HDL-C 在對照組中含量最高。SOD 的活性隨著有效磷含量的升高而升高直至有效磷含量為1.09%，有效磷含量超過1.09%時SOD 活性呈現(xiàn)下降趨勢。MDA 的含量隨著有效磷含量的升高逐漸降低至有效磷含量為0.64%，而后MDA 的含量呈現(xiàn)上升趨勢。

表3 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚血清生化指標的影響

2.3 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚全魚、椎骨及鱗片營養(yǎng)成分的影響

從表4 可以看出，魚體脂肪含量與磷含量呈負相關(guān)，有效磷水平為1.54%時脂肪含量達到最低值（P＜0.05）。隨著飼料中有效磷含量的升高，魚體灰分也隨之升高，1.31%組與1.54%組無顯著差異，其余各組間差異顯著（P＜0.05）。全魚磷含量隨飼料有效磷升高而升高，當飼料有效磷含量超過1.09%時呈現(xiàn)下降趨勢。全魚磷含量在有效磷含量1.09%和0.64%間存在顯著性差異（P＜0.05），且有效磷含量為0.41%時與其余各組均存在顯著性差異（P＜0.05），其余各組間差異不顯著（P＞0.05）。有效磷含量為1.54%時，與有效磷含量為0.64%、0.86%椎骨灰分含量無顯著性差異，其余各組間差異顯著（P＜0.05）。有效磷含量為0.86%和1.09%的椎骨磷含量無顯著差異（P＞0.05），其余各組間差異顯著（P＜0.05）。有效磷含量達到1.09%時，鱗片灰分和總磷的含量最高。以飼料有效磷含量為自變量，以全魚磷含量為因變量，對其進行拋物線回歸分析，得出拋物線回歸方程為y=-0.192 3x2+0.457 3x+0.593 7（R2=0.837 2）。根據(jù)以上的回歸公式，得出全魚磷含量在有效磷含量為1.19%時取得最大值（圖3）。

圖3 飼料有效磷含量對烏鱧全魚磷含量的影響

表4 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚全魚、椎骨及鱗片營養(yǎng)成分的影響(%)

3 討論

3.1 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚生長性能和飼料效率的影響

在烏鱧的養(yǎng)殖過程中，F(xiàn)ER、PER 和SGR 三個指標直接決定其經(jīng)濟效益。磷元素作為與水產(chǎn)動物機體生長休戚相關(guān)的常量元素之一，僅靠吸收水中的磷元素含量無法滿足其機體需要。因此，眾多研究學(xué)者對不同水產(chǎn)動物進行磷需要量的研究。在適宜有效磷含量范圍內(nèi)，花鱸（Lateolabrax maculatus）[16]、黃河鯉（Cyprinus carpio）[17]、黑鯛幼魚（Sparus macrocephalus）[2]、哲羅魚（Hucho taimen）[18]、吉富羅非魚（Oreochromis niloticusGIFT）[19]、大口黑鱸[20]、雜交鱘幼魚（Acipenser baerii ♀×Acipenser schrenckii ♂）[21]、革胡子鯰幼魚（Clarias leather）[22]、黑線鱈幼魚（Melanogrammus aeglefinusL.）[23]等的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著有效磷含量的升高，魚體生長性能也隨之升高。在本試驗條件下，與1.09%組相比，其余各組FER、PER 和SGR 在飼喂烏鱧幼魚低磷飼料后顯著降低。其可能的原因為：在動物機體內(nèi)，氨基酸在合成多肽時與ATP 和tRNA反應(yīng)生成氨酰-tRNA、AMP 和焦磷酸。由圖2 可知，當烏鱧幼魚磷攝入量減少時，機體無法提供足量的ATP 供給氨基酸合成蛋白質(zhì)，導(dǎo)致烏鱧無法充分利用飼料中的蛋白質(zhì)。當飼料中有效磷含量逐漸升高并趨向于1.06%時，烏鱧幼魚機體中ATP 含量逐漸升高，使氨基酸與tRNA和ATP的反應(yīng)更加充分，烏鱧的蛋白質(zhì)效率隨之升高，提高烏鱧的生長性能。而在Fjelldal等[24]的研究中得出不同結(jié)論，飼料中磷含量的缺乏與否對大西洋鮭的生長性能的影響并不顯著，其原因可能包括魚的品種、養(yǎng)殖試驗條件和試驗飼料組成有關(guān)。在本試驗中選用10.50 g 左右的烏鱧幼魚作為研究對象，其體型較小、生長速度快、初始磷沉積量相對較低、對飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)需求較高、對各種營養(yǎng)物質(zhì)的緩沖能力較弱。隨著飼料中有效磷含量的變化，烏鱧幼魚的生長性能表現(xiàn)出現(xiàn)了顯著差異。

3.2 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚血清生化指標的影響

血液作為烏鱧幼魚機體內(nèi)物質(zhì)交換的重要場所，血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 的含量可有效體現(xiàn)機體脂質(zhì)代謝的能力。在黑線鱈幼魚的研究中發(fā)現(xiàn)，以Ca（H2PO4）2為飼料磷源，在飼喂低磷飼料與高磷飼料12 周后，全魚體脂肪表現(xiàn)出上升的趨勢，在飼喂0.82%磷水平飼料后全魚體脂肪達到最低值5.3%[23]。Zafar 等[14]在對印度囊鰓鯰（Heteropneustes fossilis）的研究中發(fā)現(xiàn)，以Ca（H2PO4）2為飼料磷源，飼料中磷添加量為3.2 g/kg時脂肪含量最高，且隨著飼料磷水平的增加，體脂持續(xù)顯著下降，直至需求水平（9.2 g/kg）。在團頭魴幼魚（Megalobrama amblycephala）的研究中發(fā)現(xiàn)，以Ca（H2PO4）2為飼料磷源，飼料磷水平11.5 g/kg 組和14.3 g/kg組的全魚脂肪含量顯著高于對照組8.1 g/kg水平組[25]。在Zhang等[16]對花鱸飼料中磷需求量的研究中發(fā)現(xiàn)，以NaH2PO4和K2HPO4為磷源飼喂10 周后發(fā)現(xiàn)0.89%磷水平組可以有效升高脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達、降低花鱸的脂肪含量，并減少干細胞的空泡化。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，有效磷含量為1.09%時血清TC和LDLC的含量達到最低，TG在有效磷含量為0.86%時達到最低，有效磷含量為1.54%時HDL-C含量顯著小于其他各組。隨著有效磷含量降低，血清中TC、LDL-C 和HDL-C 含量逐漸升高，并在有效磷含量為0.41%時達到最大。由此可見，當飼喂烏鱧磷缺乏飼料時，其脂肪利用能力大大降低，攝食適宜磷水平的飼料可以有效增強脂肪利用能力。Roy等[23]認為這可能是由于磷在三羧酸循環(huán)的底物水平磷酸化過程中發(fā)揮了重要的作用。由ATP提供能量的脂代謝相關(guān)酶可能與線粒體外脂肪酸的利用有關(guān)，磷的攝入量不足很可能會導(dǎo)致ATP含量的減少，進而影響脂肪酸的β氧化，游離脂肪酸和乙酰輔酶A的酯化反應(yīng)受到抑制，降低魚體利用脂質(zhì)功能的效率。且飼料中有效磷水平的升高可以有效升高脂肪分解酶相關(guān)的mRNA表達量，例如，在花鱸的研究中，磷缺乏條件下有效升高了脂肪合成酶（FAS）和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP-1）的mRNA 表達量[16]。Yang等[25]發(fā)現(xiàn)，11.3 g/kg和14.3 g/kg組顯著降低了團頭魴幼魚體內(nèi)乙酰輔酶a 羧化酶（ACC）、SREBP-1 和FAS 的mRNA表達量。因此，當飼料中有效磷的含量改變時可以使烏鱧體內(nèi)的脂肪含量發(fā)生顯著性變化。但當磷含量過高時，血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量重新升高，其原因未見相關(guān)研究報道，具體機制有待后續(xù)探索。

當魚體的損傷來自于自由基時，其體內(nèi)會產(chǎn)生一種酶性抗氧化系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠保護魚體免受自由基的損害，而另一種非酶性抗氧化系統(tǒng)則會被用來清除自由基。這種酶性抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)，共同抵御自由基對魚體造成的損傷[26]。SOD 可以清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基，體內(nèi)的MDA含量可以有效表明細胞損傷的程度[27]。在黃河鯉的研究中得出，飼料中磷含量充足組血清SOD活性顯著高于飼料磷缺乏組，MDA 含量恰好相反[17]；印度囊鰓鯰的肝臟中檢測到飼料中磷含量達到1.12%時SOD活性達到最佳，MDA 含量在0.86%時在肝臟中的沉積最低[14]；Wang 等[18]在哲羅魚的肝臟中發(fā)現(xiàn)，0.91%有效磷水平組SOD活性顯著高于其他各組，MDA含量在1.02%有效磷水平組體內(nèi)沉積量最少。在本研究中發(fā)現(xiàn)當飼料中有效磷水平升高至0.86%時，血清中SOD 的活性達到最佳，MDA在有效磷水平0.64%時測得沉積量最少。隨著磷含量的下降，血清中SOD活性與MDA含量呈現(xiàn)相反趨勢。因而，適宜的有效磷能夠有效地增強機體的抗氧化性能，減輕細胞的損傷程度。但隨著飼料中磷水平的不斷升高，魚體的抗氧化能力發(fā)生逐漸下降的原因尚不得而知，這一問題有待后期進一步研究。

3.3 飼料中不同有效磷含量對烏鱧幼魚全魚、椎骨及鱗片營養(yǎng)成分的影響

在評價飼料磷對魚類生長過程的影響中，不僅蛋白質(zhì)含量和脂肪含量值得關(guān)注，骨骼和鱗片中的磷沉積也是重要的評價指標。Hamada等[28]發(fā)現(xiàn)，魚類脊椎骨基質(zhì)的主要成分為羥基磷灰石。Meinke等[29]發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石中鈣與磷的比例為5：3。相關(guān)文獻表明，當飼料中磷含量低于適宜磷含量時，魚體脊椎骨和鱗片中的磷含量隨飼料中磷含量的升高而升高，在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[30]、鯽（Carassius auratus）[31]、革胡子鯰[32]、吉富羅非魚[19]和黑鯛幼魚[2]等研究中得出相同結(jié)論。但不同的是，當飼料中磷含量繼續(xù)升高時，烏鱧的椎骨和鱗片中的磷含量呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于當飼料中有效磷含量過高時，魚體內(nèi)鈣磷比例受到影響，椎骨礦化可能會出現(xiàn)相反的趨勢，魚體椎骨的礦化程度減小，進而降低魚體生長性能。在黑線鱈[23]的研究中發(fā)現(xiàn)，椎骨磷沉積在1.02%磷含量組時達到最大值，但當飼料中磷含量繼續(xù)升高至1.22%時椎骨磷沉積小于磷水平1.02%組；1.17%有效磷水平組的七星鱸魚（Lateolabrax japonicus）椎骨與鱗片中磷沉積量顯著低于0.93%有效磷水平組[33]。在本試驗條件下，不同磷水平對烏鱧幼魚的全魚蛋白質(zhì)含量沒有顯著性影響，而各組間脊椎骨和磷沉積量與全魚粗脂肪產(chǎn)生差異，當含磷量達到1.09%時，烏鱧椎骨和鱗片的磷沉積達到最大值，當磷含量為1.54%時全魚粗脂肪含量達到最低。由表3和表5可知，盡管烏鱧幼魚在對照組的低磷條件下可以繼續(xù)生長。但相比于1.09%磷水平組，對照組蛋白質(zhì)效率大大降低，加之各組間全魚蛋白含量并無明顯差異，脊椎骨磷含量存在差異。由此推測：在缺磷條件下，攝入的磷元素優(yōu)先用于蛋白質(zhì)的合成以維持基本的生命活動。當烏鱧幼魚攝入的磷含量逐漸升高時，機體生命活動所需能量由脂代謝產(chǎn)生的能量替代部分蛋白質(zhì)消耗產(chǎn)生的能量。攝入的部分磷元素與鈣元素結(jié)合為脊椎骨發(fā)育和鱗片的生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)。因此表現(xiàn)為蛋白質(zhì)效率增加但全魚蛋白質(zhì)含量幾乎不變，脂肪沉積量減少，脊椎骨和鱗片磷沉積量增加。

由于不同試驗所選用魚的品種、試驗魚體大小、試驗地點、評價指標、磷源和養(yǎng)殖方式等諸多因素的差異，導(dǎo)致得出的最佳磷含量存在差異。如，以8.53 g左右的大口黑鱸為試驗對象，以磷酸一二鈣為磷源，有效磷水平為0.52%時，磷沉積率達到最大[20]；周文博等[21]在以磷酸二氫鈣為磷源飼喂8 周10.06 g 左右的雜交鱘幼魚后發(fā)現(xiàn)，增重率、全魚磷含量和脊椎磷含量分別在有效磷水平為0.93%、1.02%和0.95%時達到最佳；1.8 g 左右軍曹魚（Rachycentron canadum）飼喂以磷酸二氫鈣為磷源的飼料8 周后，最佳有效磷水平為0.62%[34]。因此，針對在本試驗條件下，飼料中有效磷含量為1.09%時可以使烏鱧達到最優(yōu)的生長性能。通過本試驗得出，烏鱧幼魚的SGR、PER 和全魚磷含量在有效磷含量為0.98%、1.06%和1.19%時達到最佳。同時，為減少養(yǎng)殖水環(huán)境富營養(yǎng)化風(fēng)險，烏鱧飼料推薦有效磷含量為0.98%。