■ 陳 明 贠 彪 王 勝 解綬啟 錢雪橋*

（1.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東廣州 511400；2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，湖北武漢 430072）

魚粉（FM）因其具有營(yíng)養(yǎng)平衡、適口性好、易被水產(chǎn)動(dòng)物消化吸收等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料。近年來，魚粉的市場(chǎng)價(jià)格大幅上漲，限制了魚粉在飼料中的使用[1-2]。因此，尋找優(yōu)質(zhì)的蛋白源來替代魚粉已成為當(dāng)下飼料行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

玉米蛋白粉（CGM）是一種玉米淀粉加工過程中的副產(chǎn)品，因其缺少抗?fàn)I養(yǎng)因子，纖維含量低，故玉米谷蛋白粉具有取代魚粉的潛力[3]。研究表明玉米蛋白粉可以替代魚類飼料中30%～70%的魚粉，在魚粉含量為27%的飼料中用玉米蛋白粉替代10%的魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)沒有影響[4]。改性玉米蛋白粉（MCGM）將玉米蛋白粉中的蛋白質(zhì)通過多種酶復(fù)合技術(shù)進(jìn)行改性處理，提高其水溶性能，增加酸溶蛋白和肽的比例，進(jìn)而提高其消化吸收利用率。有研究表明混合蛋白源替代魚粉比單一來源更好，因?yàn)榛旌系鞍自从懈玫陌被峤M成，單一蛋白源替代魚粉可能會(huì)造成飼料氨基酸不平衡，鈣磷缺失，適口性差等問題，從而影響水產(chǎn)動(dòng)物正常生長(zhǎng)[5]。腸膜蛋白粉（DPS）是以提取肝素后的豬小腸及腸黏膜的水解產(chǎn)物為底物，再經(jīng)一系列蛋白酶長(zhǎng)時(shí)間酶解與特殊酶處理加工而成，含有豐富的誘食肽和小腸促生長(zhǎng)肽，可促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物攝食和提高腸道消化酶活力[6-8]。有研究證明，腸膜蛋白粉可以替代珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus ♂×Epinephelus lanceolatus ♀）飼料中9%的魚粉，而對(duì)魚體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響[9]。目前還未見腸膜蛋白粉在凡納濱對(duì)蝦中的研究。

玉米蛋白粉和腸膜蛋白粉混合添加，可以保證氨基酸平衡，提高魚粉的替代比例。本研究用改性玉米蛋白粉和腸膜蛋白粉混合成一種復(fù)合蛋白源替代飼料中的魚粉，研究復(fù)合蛋白源對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)，血液生化指標(biāo)，抗氧化和免疫功能的影響，以期降低飼料成本，為復(fù)合蛋白源替代魚粉提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料配方

本試驗(yàn)以復(fù)合蛋白源分別等氮等脂替代0、20%、40%、60%、80%、100%的魚粉制作了6 組配合飼料，分別命名為CD1（對(duì)照組，基礎(chǔ)飼料）、CD2、CD3、CD4、CD5 組和CD6 組。飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。將所有原料用攪拌機(jī)混合均勻后放入壓條機(jī)（F-75型雙螺旋桿擠條機(jī)，廣州化工光電科技有限公司）壓條，制成直徑1.2 mm 的條狀飼料后，再放入制粒機(jī)（G-500 型造粒機(jī)，廣州化工光電科技有限公司）制粒。制粒后所有飼料置入熟化桶內(nèi)熟化30 min。所有飼料在25 ℃陰干后過篩，按組別分裝置于-20 ℃保存。

表1 試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平（%）

1.2 生長(zhǎng)試驗(yàn)

本試驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦蝦苗購(gòu)買于珠海海興農(nóng)種苗廠，試驗(yàn)在海大集團(tuán)蓮溪試驗(yàn)基地進(jìn)行。在生長(zhǎng)試驗(yàn)正式開始前，使用相同的商業(yè)飼料暫養(yǎng)投喂20 d。暫養(yǎng)結(jié)束后，挑選初始重量約為（0.80±0.01） g健康有活力的試驗(yàn)蝦，分為6 個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60 條蝦，試驗(yàn)在室外土塘搭建的懸掛網(wǎng)箱試驗(yàn)系統(tǒng)中進(jìn)行，該系統(tǒng)由24 個(gè)網(wǎng)箱(長(zhǎng)100 cm×寬100 cm×高150 cm)組成。試驗(yàn)蝦每日投喂三次(07：00、12：00 和18：00），餐后1.5 h 觀察攝食情況，根據(jù)攝食情況調(diào)整投喂量并記錄投喂量，養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為56 d。試驗(yàn)前期試驗(yàn)蝦較小，需要對(duì)飼料進(jìn)行粉碎處理，將粉碎后的飼料通過16目和36目疊加的篩網(wǎng)，取此兩粒徑篩網(wǎng)之間的破碎料進(jìn)行投喂，后期（試驗(yàn)蝦大概5 g左右）逐漸轉(zhuǎn)喂正常顆粒飼料。養(yǎng)殖期間，測(cè)定水中溶解氧含量為5.5～7.0 mg/L，氨氮含量為0～0.2 mg/L，水溫保持在29～31 ℃，鹽度4‰～7‰。及時(shí)記錄投喂情況。

1.3 樣品采集

生長(zhǎng)試驗(yàn)期間每周進(jìn)行一次稱重記錄試驗(yàn)蝦生長(zhǎng)情況。生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)網(wǎng)箱試驗(yàn)蝦存活尾數(shù)、總重以及投喂的飼料總重等，計(jì)算存活率、增重率、飼料效率等。取樣前將試驗(yàn)蝦饑餓24 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)取10 尾蝦于-20 ℃保存，用于體組成分析，另取10尾蝦用肝素鈉浸潤(rùn)的1 mL針管頭部取血，在4 ℃，3 000 r/min 下離心15 min，吸取上清液血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于血清生化指?biāo)分析。另取5 尾蝦測(cè)量其體重、體長(zhǎng)和肝胰腺重量，用于計(jì)算肝體比，同時(shí)采集肝胰腺-80 ℃保存，用于生化指標(biāo)分析。

1.4 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算

末均重（FBW，g）=末總重/末尾數(shù)

增重率（WG，%）=100×（末均重-初始均重）/初始均重

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=100×[ln（終末體重）-ln（初始體重）]/養(yǎng)殖天數(shù)

肝體比（HSI，%）=100×肝胰腺重（g）/蝦重（g）

肥滿度（CF，g/cm3）=體重（g）/[體長(zhǎng)（cm）]3

飼料效率（FE）=增重（g）/攝食量（g）

蛋白質(zhì)效率（PER）=增重（g）/蛋白質(zhì)投喂量（g）

蛋白質(zhì)沉積率（PPV，%）=100×蝦體蛋白質(zhì)貯積量（g）/攝入的蛋白質(zhì)總量（g）

1.5 樣品測(cè)定與分析

用杜馬斯燃燒法快速定氮儀（Elementar，德國(guó)）測(cè)定蝦和肌肉的粗蛋白，用全自動(dòng)脂肪儀（ANKOMx715自動(dòng)脂肪儀，美國(guó)）測(cè)定蝦和肌肉的粗脂肪含量。肌肉樣品在烘箱中 105 °C 烘干3 h，全蝦樣品在烘箱中105 ℃烘干24 h，按照減重法計(jì)算水分含量。

用全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi 7170，日本）測(cè)定血清堿性磷酸酶（ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（CHO）和三酰甘油（TG）水平。

同時(shí)試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)南京建成生物工程技術(shù)研究所有限公司檢測(cè)試劑盒的操作說明，進(jìn)行各組實(shí)驗(yàn)蝦肝胰腺谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）含量的測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS?（SPSS， Inc.，美國(guó)）23.0，采用正交多項(xiàng)式對(duì)比法進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，差異顯著（P＜0.05）時(shí)用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性能和飼料利用

如表2 所示，CD2 組試驗(yàn)蝦WG 顯著高于CD5 和CD6 組（P＜0.05）。與CD1 組相比，復(fù)合蛋白源替代20%、40%、60%以及80%魚粉皆對(duì)凡納濱對(duì)蝦WG 和SGR 無(wú)顯著影響（P＞0.05），而100%替代魚粉則顯著降低對(duì)蝦的WG和SGR（P＜0.05）。CD5組和CD6組對(duì)蝦FE 也顯著低于其他各組（P＜0.05），而CD6 組的PPV也顯著低于其他各組（P＜0.05）。

表2 復(fù)合蛋白源替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、體形態(tài)學(xué)和飼料利用的影響

2.2 體組成分析

如表3 所示，復(fù)合蛋白源替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦全蝦體組成皆無(wú)顯著影響(P＜0.05)。

表3 復(fù)合蛋白源替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦體組成的影響(%,濕重)

2.3 血清生化指標(biāo)

如表4 所示，CD3 組ALP 顯著高于CD1 組（P＜0.05），而CD6 組的ALP 顯著低于其他各組（P＜0.05）。CD1 的AST 含量最低（P＜0.05），而CD6 組的AST 的含量最高（P＜0.05）。CD6 組試驗(yàn)蝦血清ALT 和TG 含量顯著高于其他各組（P＜0.05），而血清TP 含量較其它各組顯著降低（P＜0.05）。

表4 復(fù)合蛋白源替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響

2.4 肝胰腺生化指標(biāo)

如表5 所示，CD6 組試驗(yàn)蝦肝胰腺GPX 和SOD 含量顯著低于其他各組（P＜0.05），而其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。CD5 組肝胰腺LZM 活性顯著低于CD4 組（P＜0.05）。CD5 組和CD6 組ACP 活性顯著低于CD1 組和CD2 組（P＜0.05）。而CD6 組的MDA 含量顯著高于除CD5組外的其他各組（P＜0.05）。

表5 復(fù)合蛋白源替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺酶活的影響(U/mg prot)

3 討論

3.1 生長(zhǎng)性能，飼料利用和體組成

本研究中，由酶解腸膜蛋白粉和玉米蛋白粉組合蛋白源替代不超過80%的魚粉不會(huì)顯著影響凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，但復(fù)合蛋白全替代魚粉后會(huì)造成凡納濱對(duì)蝦增重率顯著降低。在凡納濱對(duì)蝦的研究中，玉米蛋白粉最多可替代10%的魚粉而對(duì)其生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響[4]，而在日本對(duì)蝦研究中，玉米蛋白粉替代魚粉比例提高到了22%[10]。然而，復(fù)合蛋白替代魚粉可以使魚粉的替代比例大幅上升。含有玉米蛋白粉的復(fù)合植物蛋白源（雙低菜粕∶大米蛋白粉∶玉米蛋白粉=5∶3∶2）可以替代配合飼料中80%的魚粉而不會(huì)影響凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)[11]。我們可以發(fā)現(xiàn)，除了品種的差異，玉米蛋白粉性狀的改變也會(huì)影響替代魚粉的比例，改性后的玉米蛋白粉消除了部分抗?fàn)I養(yǎng)因子，胃蛋白消化率更高，更符合水生動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求[12]。李鳳玉等[13]飼料中用發(fā)酵玉米蛋白粉替代42.8%魚粉不會(huì)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能、免疫應(yīng)答和腸道消化能力產(chǎn)生負(fù)面影響。有研究發(fā)現(xiàn)，用雞肉粉、大豆?jié)饪s蛋白和發(fā)酵豆粕組成的復(fù)合蛋白替代配合飼料中40%～80%的魚粉對(duì)卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）的生長(zhǎng)性能沒有顯著影響[14]，這與本文的研究結(jié)果相似。配合飼料中用復(fù)合蛋白替代一定比例的魚粉不會(huì)對(duì)大口黑鱸（micropterus salmoides）[15]、加州鱸幼魚[16]，三倍體虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[17]和大菱鲆（Scophthalmus maximus）[18]的生長(zhǎng)造成顯著影響。動(dòng)植物復(fù)合蛋白相較于單一蛋白可以替代更多的魚粉，過多的植物蛋白會(huì)造成飼料適口性下降，消化利用率低，從而導(dǎo)致替代魚粉比例較低，單一動(dòng)物蛋白存在氨基酸不平衡的問題[19]，而動(dòng)植物復(fù)合蛋白可以調(diào)節(jié)氨基酸組成從而極大程度地提高復(fù)合蛋白替代魚粉的水平。這是復(fù)合蛋白源可以替代80%的魚粉的主要原因。魚粉不能完全被復(fù)合蛋白替代，一方面是由于氨基酸組成與魚粉有差異，另一方面可能是缺乏某些魚粉特有的營(yíng)養(yǎng)元素。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合蛋白源全替代魚粉時(shí)會(huì)顯著降低FE、PER 和PPV。植心妍等[8]的研究發(fā)現(xiàn)用酶解腸膜蛋白替代36%的魚粉會(huì)使FE 顯著降低，大菱鲆配合飼料中用動(dòng)植物蛋白替代70%以上魚粉時(shí)，會(huì)使FE 大幅降低，都與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果近似[20]。全替代組實(shí)驗(yàn)蝦PER 和PPV 下降的原因可能是復(fù)合蛋白源組成的蛋白質(zhì)和氨基酸消化率低于魚粉[21]。也可能是因?yàn)轱暳现行‰暮陀坞x氨基酸的含量過高，機(jī)體腸道轉(zhuǎn)運(yùn)能力超負(fù)荷。此外，快速涌入機(jī)體的小肽可能會(huì)加速氨基酸氧化和內(nèi)因性排泄,從而影響氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終抑制魚體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收[22]。在本試驗(yàn)條件下，復(fù)合蛋白源替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦體組成，HSI 和CF 無(wú)顯著影響。這與動(dòng)植物復(fù)合蛋白在海水魚的研究上一致[23-24]。

3.2 血清生化指標(biāo)

本試驗(yàn)中，復(fù)合蛋白源完全替代魚粉會(huì)造成凡納濱對(duì)蝦血清AST，ALT，CHO 和TG 水平顯著升高，同時(shí)，血清ALP 和TP 顯著降低。血清總膽固醇和三酰甘油可以反饋動(dòng)物脂質(zhì)代謝情況[25]，CD6組血清AST、ALT 和TP 顯著增加，有研究表明，當(dāng)魚粉含量降低后，會(huì)使肝胰腺負(fù)擔(dān)增加，導(dǎo)致ALT 和AST 大量游離到血液[26]。CD6 組血清CHO 和TG 水平顯著升高，這可能是由于當(dāng)復(fù)合蛋白源替代水平升高后，飼料中不飽和脂肪酸減少，影響脂肪代謝酶造成的[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加復(fù)合植物蛋白會(huì)上調(diào)肝胰腺中促炎因子的表達(dá)，復(fù)合蛋白源過量替代魚粉對(duì)動(dòng)物肝胰腺造成了一定脅迫，導(dǎo)致ALT 和AST 大量游離到血液，這可能是CD6 組試驗(yàn)蝦AST 和ALT 顯著上升的原因[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合蛋白源替代魚粉比例不宜高于60%，否則會(huì)對(duì)凡納濱對(duì)蝦健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

3.3 肝胰腺生理生化指標(biāo)

生物抗氧化酶系統(tǒng)主要包括：超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等，其主要作用是防御機(jī)體肝胰腺代謝異常產(chǎn)生ROS 對(duì)機(jī)體肝細(xì)胞產(chǎn)生的影響[29-30]。本試驗(yàn)中，復(fù)合蛋白源全替代魚粉會(huì)造成凡納濱對(duì)蝦肝胰腺GPX、SOD和ACP活性顯著降低，同時(shí)MDA 顯著升高。CD5 組試驗(yàn)蝦肝胰腺LZM 也有下降趨勢(shì)。這與在虹鱒中觀察到的現(xiàn)象一致[17]。玉米蛋白粉替代魚粉過多，也會(huì)造成鮑魚(Haliotis discus hannai)血清中SOD、LZM、ACP 和ALP活性下降[31]，這與本文觀察到的現(xiàn)象一致，植物蛋白含量過多可能是造成凡納濱對(duì)蝦抗氧化和免疫功能減弱的原因。

4 結(jié)論

綜上所述，以生長(zhǎng)性能和生理生化指標(biāo)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，飼料中復(fù)合蛋白源能替代部分魚粉而對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能沒有顯著影響。然而，復(fù)合蛋白源全替代魚粉會(huì)降低凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能，飼料利用率，免疫力和抗氧化能力。