韓春曉,張玉鑫,劉穎文,李海波

(寧波市婦女兒童醫(yī)院出生缺陷綜合防治中心,浙江 寧波 315012)

16號(hào)染色體的微缺失和微重復(fù)與精神發(fā)育障礙中的認(rèn)知、言語延遲和行為異常有關(guān)。16p11.2近端區(qū)域由斷點(diǎn)4和5定義,包含26個(gè)已知基因,其中4個(gè)是在線人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man,OMIM)致病基因,大部分基因在大腦的不同區(qū)域表達(dá)。這個(gè)區(qū)域內(nèi)約600kb的周期性間質(zhì)缺失,是最常見的拷貝數(shù)變異區(qū)域[1]。16p11.2(TBX6)近端缺失綜合征臨床特征包括發(fā)育遲緩、認(rèn)知障礙、語言延遲與障礙、自閉癥譜系障礙、面部畸形、癲癇或腦電圖異常、肥胖、精神疾病、心臟畸形等,并觀察到不完全外顯率和異質(zhì)性[2-3]。目前研究證實(shí)16p11.2重復(fù)攜帶者的發(fā)育與精神運(yùn)動(dòng)遲緩、智力障礙、自閉癥譜系、強(qiáng)迫與重復(fù)行為和精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究通過對(duì)16p11.2綜合征患者臨床癥狀、妊娠結(jié)局和隨訪信息的收集分析,旨在探討其表型和遺傳學(xué)相關(guān)性,豐富16p11.2綜合征表型譜,為產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供有價(jià)值的臨床依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

于2019年1月至2022年8月寧波市婦女兒童醫(yī)院就診并接受染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis,CMA)檢測(cè)的9 744例患者,受檢者樣本包括8 999例產(chǎn)前羊水樣本,468例外周血樣本和277例流產(chǎn)物樣本,將檢出16p11.2微缺失/微重復(fù)綜合征22例患者(20例胎兒、2例患兒)納入描述性分析。所有孕婦及患兒監(jiān)護(hù)人在CMA檢測(cè)前進(jìn)行詳盡的知情告知并簽署知情同意書,本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)[EC(2020-048)]。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床指征

①產(chǎn)前診斷指征:孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查異常、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、胎兒超聲結(jié)構(gòu)畸形、超聲軟指標(biāo)異常、胎兒生長(zhǎng)受限、高齡妊娠、異常妊娠史等;②患兒受檢指征:非已知綜合征型神經(jīng)發(fā)育障礙、發(fā)育遲緩、智力低下、自閉癥、面部體征多發(fā)畸形、臟器畸形等。

1.2.2 樣本采集

①羊水樣本采集:在超聲引導(dǎo)下對(duì)孕19～24+6周孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺手術(shù),抽取3個(gè)15mL羊水置于無菌管中,其中2管用于細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析,1管用于全基因組DNA提取(親本驗(yàn)證時(shí)抽取父母外周血5mL);②外周血采集:采集患兒及父母外周血5mL。

1.2.3 CMA檢測(cè)

單核苷酸多態(tài)性微陣列分析采用全基因組CytoScantm 750k芯片(美國(guó)Affymetrix公司),提取的全基因組DNA進(jìn)行消化、連接、擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記、探針雜交、洗滌和掃描。使用配套ChAS4.0(Chromosome Anaylasis Suite 4.0,Affymetrix)軟件對(duì)掃描圖像結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析,參考國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫包括DGV、ClinGen、ClinVar、DECIPHER、ISCA、OMIM、UCSC等,并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)及PubMed文獻(xiàn)庫,依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)對(duì)CMA拷貝數(shù)變異結(jié)果解讀指南,評(píng)判拷貝數(shù)變異的臨床意義。

1.2.4 資料收集及統(tǒng)計(jì)分析

收集孕婦妊娠期情況及患兒生后情況,包括產(chǎn)前超聲、血清學(xué)檢查、遺傳學(xué)檢查、妊娠結(jié)局及患兒發(fā)育情況等。胎兒出生后進(jìn)行定期電話召回與健康隨訪,收集患兒相關(guān)資料,包括病史和家族史。對(duì)所得結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前診斷指征與患兒表型

頸后透明帶掃描(nuchal translucency,NT)及其他超聲軟指標(biāo)異常5例,血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)和高齡妊娠各4例,無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(non-invasive prenatal testing,NIPT)異常3例,超聲結(jié)構(gòu)異常3例(2例脊柱發(fā)育異常,1例泌尿系統(tǒng)異常)。另外,2例因癲癇而就診患兒,其中1例伴有生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,另外1例有驚厥癲癇家族史,其余未見異常,見表1。

表1 16p11.2綜合征患者的特征統(tǒng)計(jì)Table 1 Characteristics of patients with 16p11.2 syndrome

2.2 遺傳學(xué)特征

9 744 例樣本中,22例患者(20例產(chǎn)前胎兒、2例患兒)攜帶16p11.2核心區(qū)域拷貝數(shù)變異,檢出率為0.226%(22/9 744)。在22例拷貝數(shù)變異中,21例變異位于近端核心易感區(qū)堿基對(duì)(base pair,BP)4-BP5,1例變異位于遠(yuǎn)端核心易感區(qū)BP2-BP3。根據(jù)變異類型,22例變異中包含15個(gè)微缺失變異,占比68.18%(15/22),7個(gè)微重復(fù)變異,占比31.82%(7/22)。變異片段大小為324～4 101kb。

2.3 變異類型及致病性分級(jí)

22例中10例樣本進(jìn)行了親本驗(yàn)證,7例變異為新發(fā)突變,2例變異遺傳自母親,1例變異遺傳自父親。16例胎兒樣本進(jìn)行了染色體核型分析,其中1例樣本表現(xiàn)出細(xì)胞核型異常,經(jīng)驗(yàn)證該變異遺傳自母親。根據(jù)ACMG致病性評(píng)級(jí),22例變異均為致病性變異。

2.4 隨訪結(jié)果

45%(9/20) 孕婦選擇繼續(xù)妊娠。對(duì)這9例嬰兒進(jìn)行隨訪,隨訪年齡為1.5(0.5～3.5)歲。發(fā)現(xiàn)1例缺失攜帶者嬰兒表現(xiàn)異常,出生時(shí)診斷為房缺,室缺,卵圓孔未閉,2歲時(shí)表現(xiàn)出單純語言發(fā)育落后,經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該變異為新發(fā)突變。其余活產(chǎn)嬰兒未見明顯異常,見表1。

注:A為病例8第一胎,腰骶部椎體排列欠規(guī)則,提示半錐體;B為病例13,脊柱排列異常;C為病例19,巨膀胱。圖1 胎兒NT超聲影像Fig.1 Ultrasonic images of NT of three fetuses

3 討論

3.1 16p11.2綜合征與語言障礙

16p11.2 拷貝數(shù)變異最常見的臨床癥狀為語言障礙,占比高達(dá)80%～90%。據(jù)報(bào)道,重復(fù)攜帶者語言延遲與智力障礙相關(guān),而語言障礙在缺失攜帶者中更普遍[4-5],并未有證據(jù)指出語言發(fā)育障礙與自閉癥譜系有必然聯(lián)系[6]。文獻(xiàn)報(bào)道的語言功能障礙多在學(xué)齡前(3～7周歲)或?qū)W齡期(7～15周歲)確診[7]。病例1胎兒攜帶16p11.2近端缺失585kb片段,2歲時(shí)被診斷為單純性語言發(fā)育遲緩。其余隨訪病例尚未發(fā)現(xiàn)明顯的語言發(fā)育落后和自閉癥譜系相關(guān)癥狀。這與文獻(xiàn)報(bào)道的臨床占比80%～90%有一定差異,這可能與病例數(shù)較少及隨訪時(shí)間較短,患兒表型尚未顯現(xiàn)有關(guān),這也是本研究的不足之處。

3.2 16p11.2綜合征與心血管系統(tǒng)異常

據(jù)統(tǒng)計(jì),0.3%的16p11.2微缺失攜帶者患有主動(dòng)脈狹窄、房間隔缺損、卵圓孔未閉等心血管系統(tǒng)異常[8]。Zufferey等在233名16p11.2缺失個(gè)體中發(fā)現(xiàn)有6%的人患有先天性心臟病[8]。William報(bào)道了16p11.2缺失攜帶者,臨床表現(xiàn)為主動(dòng)脈瓣發(fā)育異常、手部畸形、小頭畸形等[9]。M Marwan等歸納了16p11.2缺失相關(guān)的并發(fā)癥,包括大頭畸形、癲癇、和先天性心臟病[10]。Ghe等報(bào)道了攜帶16p11.2微缺失的同卵雙胞胎,分別在11.5歲和13歲時(shí)癲癇發(fā)病,并出現(xiàn)智力發(fā)育遲緩和主動(dòng)脈瓣發(fā)育異常[11]。病例1是本研究中唯一一個(gè)心臟畸形的病例,出生時(shí)診斷為先天性心臟病,具體表現(xiàn)為房間隔缺損、室間隔缺損、卵圓孔未閉。該缺失攜帶者片段中包含HIRIP3基因,16p11.2缺失引起HIRIP3基因單倍劑量不足,從而導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣畸形發(fā)生,該基因產(chǎn)物與HIRA結(jié)合形成的復(fù)合物在染色質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用,表明該基因突變可能為病例1致病因素[11]。

3.3 16p11.2綜合征與癲癇

癲癇是16p11.2綜合征中高度外顯表型[3]。Ben等整理了16p11.2綜合征中癲癇發(fā)病率,缺失攜帶者約21.8%～26.8%,重復(fù)攜帶者約19.4%～29%[12]?；騊RRT2相關(guān)疾病在16p11.2缺失的個(gè)體中已有報(bào)道,基因PRRT2與三種常染色體顯性疾病相關(guān)[12-14]。Natália等認(rèn)為16p11.2拷貝數(shù)變異相關(guān)的癲癇復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加,但不具有特異性[1]。本研究報(bào)道的病例14,15均因全面性強(qiáng)直性陣攣發(fā)作就診,CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)患者在16p11.2區(qū)域分別攜帶542kb和727kb左右缺失片段,兩個(gè)片段中均包含致病基因PRRT2,表明該片段缺失可能是癲癇的發(fā)病原因。這提示在癲癇患者的遺傳學(xué)評(píng)估時(shí),注意16p11.2微缺失篩查。隨訪信息中,尚未發(fā)現(xiàn)癲癇患者,表明癲癇在該綜合征中存在不完全外顯率。

3.4 16p11.2綜合征與脊柱發(fā)育異常

脊柱發(fā)育異常是16p11.2復(fù)發(fā)性綜合征產(chǎn)前診斷中最常見的臨床表型,占比約21%,具體表現(xiàn)為脊柱側(cè)彎[8]。基因XII和TBX6與常染色體顯性和隱性脊髓型肋骨生長(zhǎng)障礙5(OMIM 122600)相關(guān),由Chapman等人最早發(fā)現(xiàn)TBX6基因在小鼠的前體細(xì)胞中參與近軸中胚層的發(fā)育[15]。Takemoto等證明了TBX6依賴的SOX2調(diào)控軸向干細(xì)胞進(jìn)而影響神經(jīng)發(fā)育[16]。FEI等發(fā)現(xiàn),中國(guó)漢族人群中TBX6基因上的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2289292和rs3809624在先天性脊柱側(cè)彎的發(fā)病中起重要作用[17]。本研究報(bào)道了2例胎兒脊柱發(fā)育不良,病例8有半錐體發(fā)育異常不良孕產(chǎn)史,但未做基因檢測(cè),其胎兒攜帶585kb缺失片段,尚未發(fā)現(xiàn)此胎兒脊柱發(fā)育異常,未進(jìn)行親本來源鑒定,但根據(jù)不良孕產(chǎn)史及本次胎兒CMA結(jié)果,推測(cè)第一胎為16p11.2缺失攜帶者且變異可能遺傳自父(母)親。病例13超聲提示胎兒由胸椎至尾椎排列不規(guī)則,CMA提示胎兒攜帶542kb缺失片段,父母未驗(yàn)證。基于此,并非基因TBX6缺失都出現(xiàn)脊柱發(fā)育不良,單純TBX6基因缺失可能不會(huì)發(fā)生脊柱發(fā)育不良,具體致病機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究探索。

3.5 16p11.2綜合征與泌尿系統(tǒng)異常

病例19是16p11.2重復(fù)綜合征中唯一的結(jié)構(gòu)異常,在頸部透明層(NT)超聲檢查中提示胎兒為巨膀胱,CMA提示胎兒攜帶586kb重復(fù)片段。在以往報(bào)道中16p11.2重復(fù)綜合征的未發(fā)現(xiàn)早期巨膀胱,但J Neurodev等報(bào)告了45個(gè)16p11.2微缺失和32個(gè)微重復(fù),其中3例缺失綜合征表現(xiàn)為泌尿系統(tǒng)發(fā)育不良,具體表現(xiàn)為腎盂積水、多囊腎病,4例重復(fù)綜合征表現(xiàn)為腎回流、馬蹄型腎[18]。由于病例19終止妊娠,無后續(xù)監(jiān)測(cè),產(chǎn)前標(biāo)本量不足以進(jìn)一步檢測(cè),未進(jìn)行單基因變異的遺傳學(xué)檢測(cè),我們推測(cè)胎兒在妊娠中后期可能會(huì)出現(xiàn)泌尿系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能異常。泌尿系統(tǒng)異?？赡芘c多種拷貝數(shù)變異和單基因突變相關(guān),早期泌尿系統(tǒng)異?？勺鳛槲⒅貜?fù)綜合征的診斷指征仍需更多臨床數(shù)據(jù)支持。另外,病例10孕婦本人左腎缺如,且有腎臟發(fā)育不良孕產(chǎn)史,此次胎兒CMA結(jié)果提示攜帶約599kb缺失片段,由于孕婦本人拒絕父母驗(yàn)證,且第一胎未做基因檢測(cè),因此無法確定此次胎兒的缺失片段與孕婦腎臟異常及不良孕產(chǎn)史的關(guān)系。Li L等報(bào)告了一對(duì)雙胎16p11.2上含有200～240kb缺失區(qū)域,雙胞胎之一表現(xiàn)為左腎積水[19]。Masuno等報(bào)道了一個(gè)4月齡女嬰,核型為47,XX,+del(16)(p11.2),臨床表現(xiàn)為輕微面部異常,肢體異常和泌尿生殖系統(tǒng)異常[20]。Su J等通過CMA分析評(píng)估877例腎臟超聲異常的胎兒,4例16p11.2缺失攜帶者中,1例腎臟發(fā)育不良,3例單側(cè)腎臟發(fā)育不良[21]。

3.6 16p11.2綜合征與NT增厚及其他表型

頸部透明層增厚與染色體非整倍體、遺傳病和畸形等相關(guān),是行羊水穿刺的產(chǎn)前診斷指征之一?，F(xiàn)有研究數(shù)據(jù)指出NT增厚的異常檢出率高達(dá)2.5%～10%,單純與合并其他畸形的NT增厚的致病性拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNVs)檢出率分別為4%和7%[22-23]。本研究中我們共發(fā)現(xiàn)3例NT增厚,其中2例(病例2和病例9)遺傳自表型正常的母親,病例9隨訪時(shí)僅為6月齡,尚未見明顯異常。因此,NT增厚與16p11.2綜合征的相關(guān)性還需更多研究數(shù)據(jù)支持。高齡和血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)并不具有明顯的特異性。另外,病例5和病例11超聲提示腸道回聲增強(qiáng),相似癥狀在以往報(bào)道文獻(xiàn)中已有提及[19,24]。

3.7 小結(jié)

本研究不足為樣本以羊水居多,超聲表型有限,且隨訪時(shí)間較短,病例數(shù)較少,未能提供表型外顯率以及基因與表型相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。另外,12例變異未明確來源,家系16p11.2復(fù)發(fā)性拷貝數(shù)變異再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高于一般人群頻率(<1%),再生育前建議對(duì)夫妻雙方進(jìn)行CNVs檢測(cè)及遺傳咨詢,孕早期需進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷與密切隨訪。對(duì)父母為16p11.2變異攜帶者家系,應(yīng)進(jìn)行遺傳咨詢告知再生育攜帶者風(fēng)險(xiǎn)為50%,16p11.2區(qū)域缺失和重復(fù)外顯率分別為46.8%,27.2%[25],建議再次孕育時(shí)應(yīng)行早期的產(chǎn)前診斷或胚胎植入前遺傳學(xué)診斷以減少出生缺陷患兒發(fā)生。

綜上所述,16p11.2綜合征患者多系統(tǒng)發(fā)育表現(xiàn)異常且臨床表型多變,異質(zhì)性強(qiáng)。當(dāng)臨床出現(xiàn)相關(guān)表型時(shí),需結(jié)合家族史及臨床情況并盡早明確遺傳學(xué)病因。