摘 要：采用石墨消解儀消解，全自動(dòng)凱氏定氮儀蒸餾滴定，建立液體乳中蛋白質(zhì)含量的測定方法。結(jié)果表明，蒸餾時(shí)樣品取1.0～2.5 g、硫酸取5 mL、硫酸銅和硫酸鉀用量分別為0.1 g和1.5 g，消解滴定時(shí)加堿量為25 mL、硼酸10 mL、稀釋水20 mL、蒸餾時(shí)間5 min，該條件下檢測效果最佳。選擇10種代表性液體乳進(jìn)行方法驗(yàn)證，所得結(jié)果均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。與傳統(tǒng)凱氏定氮法相比，該方法操作簡單、安全、高效，適用于液體乳蛋白質(zhì)的日常檢測。

關(guān)鍵詞：石墨消解儀；全自動(dòng)凱氏定氮儀；蒸餾；滴定

Determination of Protein in Liquid Emulsion by Graphite Digestion-Kjeldahl Nitrogen Analyzer and Verification of the Method

HAO Qin

（Miluo City Food and Drug Inspection Institute， Yueyang 414400， China）

Abstract： A method for determining protein content in liquid milk was established by using a graphite digestion instrument for digestion and a fully automatic Kjeldahl nitrogen analyzer for distillation and titration. The results showed that during distillation， the sample volume was taken as 1.0～2.5 g， sulfuric acid was taken as 5 mL， copper sulfate and potassium sulfate were used as 0.1 g and 1.5 g， respectively. During digestion titration， 25 mL of alkali was added， 10 mL of boric acid was added， 20 mL of diluted water was added， and distillation time was 5 minutes. Under these conditions， the best effect was achieved. Ten representative liquid emulsions were selected for the validation of this method， and the results obtained all met the requirements of national standards. Compared with the traditional Kjeldahl method， this method is simple， safe， and efficient， and is suitable for daily detection of liquid milk proteins.

Keywords： graphite digester; automatic kjeldahl nitrogen analyzer; distillation; titration

蛋白質(zhì)是液體乳檢測中常用且重要的質(zhì)量指標(biāo)[1-2]。國家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于蛋白質(zhì)的檢測方法雖然很全面，但考慮到傳統(tǒng)的凱氏定氮法檢測速度慢，蒸餾裝置安全性不夠，且對于儀器的具體操作說明不夠詳細(xì)，為提高檢測效率，本文針對石墨消解-全自動(dòng)凱氏定氮法進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的方法不僅操作簡單、安全、高效，能同時(shí)處理多個(gè)樣品，且準(zhǔn)確率較高，適用于液體乳中蛋白質(zhì)的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白兔奶糖風(fēng)味牛奶，北京光明健能乳業(yè)有限公司；伊利純牛奶，寧夏伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司；安慕希希臘風(fēng)味酸奶，寧夏伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司；燕麥牛奶，濟(jì)源伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司；三元純牛奶（全脂滅菌乳），新鄉(xiāng)市三元食品有限公司；旺仔牛奶（調(diào)制乳），湖南大旺食品有限公司；特侖蘇純牛奶，蒙牛特侖蘇（銀川）乳業(yè)有限公司；蒙牛純牛奶，內(nèi)蒙古蒙牛圣牧高科奶業(yè)有限公司；QQ星兒童成長牛奶，濰坊伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司；新希望純牛奶，湖南新希望南山液態(tài)乳業(yè)有限公司。

硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硫酸鉀（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、溴甲酚綠指示劑（C21H14Br4O5S）、甲基紅指示劑（C15H15N3O2）、氫氧化鈉（NaOH）、95%乙醇（C2H5OH），分析純；0.050 0 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液；0.100 0 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液；0.050 0 mol·L-1硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的三級水。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子天平（感量為1 mg）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀：山東海能科學(xué)儀器有限公司；SH220N石墨消解儀：山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的消解

稱取混合均勻的液體乳1.0～2.5 g，移入潔凈干燥的100 mL消化管中，加入0.1 g硫酸銅、1.5 g硫酸鉀和5 mL硫酸，按照表1設(shè)定的石墨消解程序進(jìn)行消解。

1.3.2 測定方法

消解完成后，將消化管取出冷卻，再將其安裝在全自動(dòng)凱氏定氮儀上，儀器自動(dòng)加液、蒸餾和滴定，記錄滴定體積V1。同時(shí)做試劑空白。試樣中蛋白質(zhì)含量按公式（1）計(jì)算。

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；V1為試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol·L-1；m為試樣的質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

蛋白質(zhì)含量≥1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留3位有效數(shù)字；蛋白質(zhì)含量＜1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 消解條件分析

2.1.1 樣品稱樣量的優(yōu)化

GB 5009.5—2016[3]中自動(dòng)凱氏定氮法要求液體試樣的稱取量為10～25 g，但用石墨消解儀消解時(shí)容易引起爆沸以及消解不完全，而且消解需要的催化劑以及濃硫酸用量較多，耗時(shí)較長，消解后的樣液不稀釋直接上機(jī)，容易導(dǎo)致后續(xù)堿化蒸餾所需要的氫氧化鈉成倍增加，而消化管容量有限（一般為100 mL），且液體乳屬于均勻度較好的樣品，故本方法參照國標(biāo)凱氏定氮法將液體乳的稱樣量在蒸餾前稀釋10倍，最終選定為1.0～2.5 g（預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。

2.1.2 硫酸用量的確定

硫酸在消解過程中的主要作用是將樣品碳化，然后與分離出的氮元素反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為硫酸銨[4]。由此可見，硫酸用量與樣品中的含氮量密不可分。國家標(biāo)準(zhǔn)中稱取10～25 g樣品，硫酸用量為20 mL，比對參照，樣品量為1.0～2.5 g時(shí)，硫酸用量應(yīng)為2 mL，但考慮到樣品消解最長達(dá)2.5 h，會(huì)有燒干風(fēng)險(xiǎn)，故將硫酸用量選為5 mL。

2.1.3 催化劑用量的選擇

硫酸銅和硫酸鉀作為催化劑與硫酸協(xié)同作用，加速蛋白質(zhì)的消解，其使用量與硫酸用量密切相關(guān)。硫酸鉀能夠提高硫酸沸點(diǎn)，從而加快樣品分解；硫酸銅能加速樣品的氧化分解，也是樣品消化完全的指示劑（藍(lán)綠色、澄清、透明），還能在蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑[5]（變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀）。國家標(biāo)準(zhǔn)中20 mL硫酸與0.4 g硫酸銅和6 g硫酸鉀協(xié)同作用，本實(shí)驗(yàn)將硫酸用量定為5 mL，將硫酸銅、硫酸鉀用量分別調(diào)整為0.1 g、1.5 g。

2.2 蒸餾滴定條件

2.2.1 加堿量的確定

蒸餾過程中加入堿液是為了中和消解時(shí)剩余的硫酸，同時(shí)造成堿性環(huán)境，與氮反應(yīng)生成氨氣，使其游離出來，加堿量與硫酸和樣品中的含氮量息息相關(guān)。凱氏定氮法中液體試樣10～25 g（相當(dāng)于30～40 mg氮）、20 mL硫酸消解，蒸餾時(shí)從100 mL處理液中吸取2.0～10.0 mL（稀釋10～50倍），此時(shí)硫酸剩余量不超過2 mL，含氮量不超過4 mg，堿化過程采用10 mL氫氧化鈉溶液（400 g·L-1）。本方法消解時(shí)取1.0～2.5 g液體乳（相當(dāng)于3～4 mg氮）、5 mL硫酸，蒸餾滴定時(shí)不稀釋，用堿量[氫氧化鈉溶液（400 g·L-1）]不得低于25 mL。

2.2.2 蒸餾時(shí)間的確定

為確定最佳蒸餾效果，用0.050 0 mol·L-1硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，消化管不少于5支，每支消化管內(nèi)移取硫酸銨溶液10 mL，將其安裝在全自動(dòng)凱氏定氮儀上，設(shè)置參數(shù)：樣品重量輸入0.014 g，采用0.100 0 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，空白體積0.10 mL，蛋白系數(shù)0，硼酸20 mL，稀釋水20 mL，堿液10 mL，蒸餾時(shí)間分別設(shè)置為4 min、5 min、6 min、8 min、10 min，分別測得其滴定結(jié)果V，并計(jì)算回收率（）。結(jié)果表明，蒸餾時(shí)間為5 min和6 min時(shí)，回收率符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求。但考慮時(shí)間成本，最終確定蒸餾時(shí)間為5 min。

2.2.3 硼酸用量的確定

硼酸主要用來吸收游離出來的氨，生成硼酸銨，其用量與樣品中的含氮量有直接關(guān)系。凱氏定氮法中參與蒸餾的樣品中的含氮量不超過4 mg，此時(shí)的硼酸用量為10 mL，本方法用于蒸餾的樣品中的含氮量也沒超過4 mg，所以硼酸用量也選定為10 mL。

2.2.4 稀釋水用量的確定

加入適量的水是為了緩解濃硫酸濃堿的反應(yīng)程度，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）中自動(dòng)凱氏定氮儀取20 mL濃硫酸消解后加50 mL水稀釋再上機(jī)繼續(xù)蒸餾滴定，本方法消解時(shí)的硫酸用量為5 mL，對比參照下最終選用20 mL稀釋水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 方法驗(yàn)證

本文選取了10種不同生產(chǎn)廠家的液體乳（見1.1），從1～10進(jìn)行編號，分別用本文實(shí)驗(yàn)方法和GB 5009.5—2016中5.1凱氏定氮法對樣品中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品平行2次，檢測結(jié)果如表2所示?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）中精密度要求在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%（即相對差值不得超過10%）。該實(shí)驗(yàn)中兩種方法的平行實(shí)驗(yàn)均滿足該要求。將標(biāo)準(zhǔn)方法所得結(jié)果看作真值，用本文實(shí)驗(yàn)方法對同一批樣品分別進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)也都滿足精密度要求。由此表明，本方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了消解、蒸餾和滴定參數(shù)，并用石墨消解儀-全自動(dòng)凱氏定氮儀測定了市售的10種液體乳中蛋白質(zhì)的含量，并對其進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本文實(shí)驗(yàn)方法不僅操作簡單、安全、高效，能同時(shí)處理多個(gè)樣品，而且準(zhǔn)確、可靠，適用于液體乳中蛋白質(zhì)的日常檢測。

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