孫玉亭 全舒婷 孫柏旭 田雪 綦輝 焦偉偉 申阿東 孫琳

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)的細(xì)胞壁由分枝菌酸及嵌于其中的其他糖脂和游離脂類組成[1-2],脂蛋白作為組成MTB細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的重要成分,與MTB的毒力及免疫逃逸能力密切相關(guān)[3-4]。目前,MTB基因組可編碼約100個(gè)脂蛋白[5],這些脂蛋白可以通過抑制主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子表達(dá)及干擾巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生來促進(jìn)MTB的免疫逃逸[6-7]。部分脂蛋白參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)并協(xié)助脂質(zhì)定位進(jìn)而發(fā)揮功能。如脂蛋白LprN參與組成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與MTB攝取利用膽固醇作為碳源的能力相關(guān)[8-9]。脂蛋白LppX也通過結(jié)合和運(yùn)輸結(jié)核分枝桿菌硫蠟醇(phthiocerol dimycocerosates,PDIM)參與細(xì)胞壁的生物合成[10]。而Rv1411c作為一種分泌型表面糖脂蛋白,即脂蛋白LprG,也被認(rèn)為是MTB的毒力蛋白之一,在敲除Rv1411c基因后可導(dǎo)致MTB毒力減弱[11];還可以結(jié)合脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidylinositol mannoside,PIM)等糖脂成分并參與兩者的膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)過程,與細(xì)菌細(xì)胞壁的生物合成、免疫識別和免疫逃逸均相關(guān)[12-15]。同時(shí),Rv1411c與Rv1410還可共同組成操縱子參與到甘油三酯(triacylglycerol,TAG)由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞壁的過程中,而敲除該操縱子或單獨(dú)敲除Rv1410均可見MTB內(nèi)部TAG脂質(zhì)的積累,說明脂蛋白Rv1411c可作為下游分子參與到TAG轉(zhuǎn)運(yùn),協(xié)同Rv1410維持細(xì)菌內(nèi)部的脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài),并促進(jìn)細(xì)菌在宿主體內(nèi)的長期存活[16],提示脂蛋白Rv1411c可能通過參與調(diào)節(jié)MTB自身的脂質(zhì)代謝來協(xié)助MTB在宿主體內(nèi)的存活,但其具體調(diào)控機(jī)制,以及是否通過參與其他脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程來影響MTB的脂質(zhì)代謝仍未可知。

脂質(zhì)組學(xué)作為一種高效準(zhǔn)確的高通量檢測方法,能夠精確地獲取不同生物體間的脂質(zhì)組成及成分差異,其中非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析能夠?qū)崿F(xiàn)對樣本脂質(zhì)成分的無偏向系統(tǒng)解析,最大程度地反映樣品中脂質(zhì)的變化規(guī)律,從而發(fā)現(xiàn)差異代謝物[17]。為進(jìn)一步探索脂蛋白Rv1411c對MTB生長過程中脂質(zhì)代謝的影響,深入研究MTB以脂質(zhì)為核心的宿主體內(nèi)生存策略,本研究應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)及非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)檢測敲除Rv1411c基因的MTB(ΔRv1411c)菌株及MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv培養(yǎng)上清的脂質(zhì)譜,為后續(xù)尋找治療MTB感染的新靶點(diǎn)和探索MTB在體內(nèi)的長期持留機(jī)制提供線索和指導(dǎo)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.實(shí)驗(yàn)材料:MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv購自美國細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)會(ATCC)細(xì)胞庫,由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室贈予。7H9液體培養(yǎng)基(貨號:271310)、Middlebrook OADS增菌液(貨號:212351)和7H10固體培養(yǎng)基(貨號:262710)均購自美國BD公司;吐溫80(貨號:P8074-500ML)購自美國Sigma-Aldrich公司;胰蛋白胨(貨號:T8490-500G)、酵母提取物(貨號:Y8020-500G)和瓊脂粉(貨號:A8190-1KG)均購自北京索萊寶科技有限公司。

2.主要試劑:氯化鈉(貨號:A100241-0500)和甘油(貨號:A600232-0500)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;磷酸鹽(PBS)緩沖液干粉(貨號:P10003)購自北京索萊寶科技有限公司;高純度低電滲瓊脂糖(貨號:TSJ001)購自北京擎科生物科技股份有限公司;Trans2K?Plus Ⅱ DNA Marker(貨號:BM121-01)和Trans15K DNA Marker(貨號:BM161-01)均購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;T4 DNA 連接酶(貨號:M0202S)、FastDigest Van91I(貨號:FD0714)、Thermo ScientificTMPacI(貨號:ER2202)和Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(貨號:F530L)均購自美國賽默飛世爾科技公司;氨芐青霉素鈉(貨號:0339-25G)購自美國Amresco公司;潮霉素B(貨號:H7772)購自美國Sigma-Aldrich公司;包裝試劑盒(貨號:MP5120)購自美國Epicentre公司;質(zhì)粒提取試劑盒(貨號:DP105)購自天根生化科技(北京)有限公司;膠回收試劑盒(貨號:D2500-02)和細(xì)菌基因組提取試劑盒(貨號:D3350-02)均購自美國Omega公司;分枝桿菌藥敏檢測試劑盒(貨號:F1004)購自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。

3.主要儀器及軟件:液相色譜儀(ExionLC AD)、高分辨質(zhì)譜儀(TripleTOF 5600+)、數(shù)據(jù)采集軟件(Analyst TF 1.7.1)均來自美國AB SCIEX公司;MS-Dial(ver.3.70, April 17, 2019)內(nèi)置Lipidomics數(shù)據(jù)庫和MetaboAnalyst 4.0分析鑒定及作圖軟件均來自美國。

二、研究方法

1.噬菌體介導(dǎo)的ΔRv1411c菌株構(gòu)建:以H37Rv基因組DNA為模板,根據(jù)待敲除基因Rv1411c上下游基因片段序列設(shè)計(jì)左臂上/下游引物(LFP/LRP)和右臂上/下游引物(RFP/RRP),其中,引物L(fēng)RP和RFP分別包含Rv1411c基因左、右端部分DNA序列;使用引物L(fēng)FP/LRP及RFP/RRP高保真擴(kuò)增獲得Rv1411c基因左臂和右臂PCR產(chǎn)物(940 bp和698 bp),并使用Van91I酶切PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒p0004s連接并轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌菌體蛋白(E.coliDH5α)感受態(tài)細(xì)胞,篩選成功后轉(zhuǎn)入敲除Rv1411c基因的E.coliDH5α陽性克隆子并提取質(zhì)粒測序;進(jìn)一步使用限制性內(nèi)切酶PacI酶切質(zhì)粒p0004s-ΔRv1411c后,與同樣經(jīng)PacI酶切后的質(zhì)粒phAE159連接、包裝并轉(zhuǎn)化入E.coliB101細(xì)胞中,篩選獲得陽性噬菌粒phAE159-ΔRv1411c并電轉(zhuǎn)化入感受態(tài)mc2155細(xì)胞中,涂板培養(yǎng)2～3 d后篩選噬菌斑并擴(kuò)增制備高滴度噬菌體;感染H37Rv并涂布7H10固體平板,37 ℃培養(yǎng)4～5周后,挑取單克隆接種于7H9液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)4～5周后,分別設(shè)計(jì)左/右臂上/下游敲除驗(yàn)證引物L(fēng)YZFP/LYZRP和RYZFP/RYZRP,在LFP引物匹配序列上游100～200 bp處設(shè)計(jì)上游驗(yàn)證引物L(fēng)YZFP,在RRP引物匹配序列下游100～200 bp處設(shè)計(jì)下游驗(yàn)證引物RYZRP,LYZRP引物設(shè)計(jì)于sacB基因,RYZFP引物設(shè)計(jì)于hyg基因,使用敲除驗(yàn)證引物L(fēng)YZFP/LYZRP和RYZFP/RYZRP,以及左、右臂引物L(fēng)FP/LRP和RFP/RRP對H37Rv菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增及PCR驗(yàn)證,獲得Rv1411c基因敲除的ΔRv1411c菌株,并排除樣本問題導(dǎo)致的陰性結(jié)果。PCR引物設(shè)計(jì)部位及驗(yàn)證原理見圖1,擴(kuò)增及驗(yàn)證引物序列見表1。

表1 構(gòu)建及驗(yàn)證引物序列

圖1 兩片段法PCR引物設(shè)計(jì)部位及驗(yàn)證原理

2. PCR擴(kuò)增和凝膠電泳:提取待檢測菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板,使用特異性引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為:10 ng DNA模板、正向引物和反向引物各1 μl(濃度約為10 pmol/μl)、脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)混合液2.5 μl、10×PCR緩沖液2.5 μl及Taq DNA聚合酶1 U,補(bǔ)足至總體積25 μl的滅菌去離子水;PCR循環(huán)條件為:95 ℃,5 min;94 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,1 min;72 ℃,5 min;30個(gè)循環(huán),4 ℃保存以終止反應(yīng)。制備

含有1%(w/v)瓊脂糖、適量的電泳緩沖液及核酸染料的溶液,加熱溶解并在恒溫條件下冷卻至凝固形成凝膠板,將處理后的PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)品(DNA ladder)均勻地加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔內(nèi),在恒定電壓下運(yùn)行電泳,電泳結(jié)束后,使用紫外透射儀觀察并記錄凝膠圖像,通過對比DNA ladder 確定PCR產(chǎn)物大小。

3. H37Rv及ΔRv1411c菌株的復(fù)蘇與培養(yǎng):取H37Rv和ΔRv1411c菌株凍存菌液各100 μl置于羅氏培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3～4周時(shí)刮取少量菌,研磨后轉(zhuǎn)接到7H9培養(yǎng)基(含有10% OADC添加劑+0.5%甘油+0.05% 吐溫80)培養(yǎng)至對數(shù)生長期,按照1∶10進(jìn)行傳代,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3～4周,待菌液的濃度增長至對數(shù)生長期A600值≈0.6～1.0時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。A600值為在600 nm波長下測定的菌液吸光度值。

4.繪制菌株生長曲線:將對數(shù)生長期的H37Rv和ΔRv1411c菌株接種于7H9液體培養(yǎng)基中,調(diào)整菌液起始A600值約為0.1并將其分裝至3只管中,每管10 ml,以保證起始濃度一致,再將其放置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27天時(shí)檢測菌株A600值,并通過計(jì)算A600值均值繪制H37Rv與ΔRv1411c菌株在不同時(shí)間點(diǎn)的生長曲線。

5.脂質(zhì)組學(xué)樣品的收集及處理:將處于對數(shù)生長期的H37Rv和ΔRv1411c菌液加入到7H9培養(yǎng)基,調(diào)整菌液起始A600值約為0.1并將其分裝至6只管中,每管5 ml,待菌株生長至A600值約為1.0時(shí),離心收取菌液上清并過濾,每管取上清樣本500 μl,凍存于-80 ℃待后續(xù)進(jìn)行脂質(zhì)組檢測?？紤]樣品在進(jìn)行脂質(zhì)提取過程中的損失及結(jié)合脂質(zhì)組學(xué)的樣本量需求,研究選擇了6份平行樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

6.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及非靶向脂質(zhì)組學(xué)檢測:每管菌液上清樣品加入588.2 μl甲基叔丁基醚(MTBE)、117.6 μl甲醇(MeOH)和294.1 μl水(H2O),MTBE∶MeOH∶H2O=10∶2∶5(v/v),渦旋吹打混勻后超聲10 min,3000 r/min離心15 min分離有機(jī)相與水相,取上層的MTBE層100 μl冷凍干燥。使用AB SCIEX TripleTOF 5600+質(zhì)譜儀和AB SCIEX ExionLC AD液相色譜儀對脂質(zhì)樣品進(jìn)行分析。流動相A相為50%水+50%乙腈(ACN)+10 mM羧基氫氧化銨(NH4COOH);流動相B相為10%硝酸鈰銨(CAN)+90%異丙醇(IPA)+10 mM NH4COOH。液相色譜洗脫梯度為:0～0.5 min,10% B相;0.5～17 min,100% B相;17～20 min,10% B相。使用電噴霧電離源(ESI)的正負(fù)離子電離模式進(jìn)行電離,ESI質(zhì)譜條件為霧化電壓5.5 kV(正離子模式)和4.5 kV(負(fù)離子模式),離子源溫度為550 ℃,去簇電壓為80 V,碰撞能量為TOF-MS:80 V;TOF-MS/MS:(35±15) V。在質(zhì)量-電荷比(m/z)為50～1500范圍內(nèi)采集全掃描光譜。

三、脂質(zhì)組數(shù)據(jù)處理與分析

使用MS-Dial(ver.3.70)軟件對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識別、峰過濾和峰對齊等處理,進(jìn)一步通過質(zhì)量測定與結(jié)構(gòu)表征分析,將代謝物與軟件內(nèi)置的Lipidomics數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,實(shí)現(xiàn)對代謝物的鑒定。利用MetaboAnalyst 4.0平臺對樣本進(jìn)行歸一化處理。使用單變量統(tǒng)計(jì)分析、多元變量統(tǒng)計(jì)分析、差異分析等方法對MS-Dial提取得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。單變量統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)和變異倍數(shù)(FC)分析,多元變量統(tǒng)計(jì)分析采用有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析方法(PLS-DA),使用模型決定系數(shù)R2及預(yù)測能力得分Q2評估PLS-DA模型的擬合效果和預(yù)測效果,一般R2、Q2值越接近于1說明模型越好,越低說明模型的擬合準(zhǔn)確性越差,當(dāng)R2為0.7或0.8時(shí)可表示模型解釋能力較好,Q2>0.5也可表示預(yù)測能力較好,并且R2與Q2的值應(yīng)該比較接近。在PLS-DA法中,變量權(quán)重(variable importance in projection,VIP)值被用來評估變量在模型中的重要性,VIP值>1被公認(rèn)為是一個(gè)有效的閾值,用于識別在PLS-DA回歸等多元統(tǒng)計(jì)分析方法中具有顯著預(yù)測能力的變量或生物標(biāo)志物,一般認(rèn)為該變量在區(qū)分不同組別中有顯著的重要性,故在研究中以VIP值>1、FC>1.5或<0.67且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物,以確保結(jié)果的可靠性和可比性。使用京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析和拓?fù)浞治龇椒ǚ治霾町愔|(zhì)代謝物相關(guān)的代謝通路。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、H37Rv菌株基因Rv1411c敲除與鑒定

對H37Rv菌株Rv1411c基因進(jìn)行敲除,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測以驗(yàn)證Rv1411c基因敲除是否成功。如圖2所示,使用引物L(fēng)YZFP/LYZRP和RYZFP/RYZRP對ΔRv1411c菌株基因組DNA擴(kuò)增,分別得到長度為1160 bp和1225 bp的片段(泳道1和3);使用上述引物對H37Rv菌株基因組DNA擴(kuò)增,未能得到擴(kuò)增片段(泳道2和4);使用引物L(fēng)FP/LRP和RFP/RRP對H37Rv菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,得到長度為940 bp和698 bp的擴(kuò)增片段(圖3),驗(yàn)證基因成功敲除,成功獲得ΔRv1411c菌株。

注 泳道M為菌株DNA Marker梯段標(biāo)志;泳道1和2分別為以ΔRv1411c菌株和H37Rv菌株DNA為模板使用引物L(fēng)YZFP/LYZRP進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;泳道3和4分別為以ΔRv1411c菌株和H37Rv菌株DNA為模板使用引物RYZFP/RYZRP進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果

注 泳道M為菌株DNA Marker梯段標(biāo)志;泳道1和2分別為以H37Rv菌株DNA為模板使用引物L(fēng)FP/LRP和RFP/RRP進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果

二、Rv1411c蛋白對MTB體外生長的影響

測定H37Rv與ΔRv1411c菌液在培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的A600值,結(jié)果顯示,H37Rv和ΔRv1411c菌株在培養(yǎng)的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27天的A600值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2,圖4)。

表2 培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)H37Rv和ΔRv1411c菌株的吸光度值檢測結(jié)果

注 A600值為波長600 nm下測定的菌液吸光度值

三、Rv1411c蛋白對MTB脂質(zhì)代謝的影響

1. H37Rv與ΔRv1411c菌液培養(yǎng)上清脂質(zhì)代謝譜差異分析:采用PLS-DA法對H37Rv和ΔRv1411c菌株的脂質(zhì)代謝進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,H37Rv及ΔRv1411c菌液上清的脂質(zhì)代謝成分具有良好的區(qū)分度,模型決定系數(shù)R2接近于1,預(yù)測能力得分Q2>0.34,說明PLS-DA模型擬合效果較好,模型具有一定預(yù)測能力且預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確度較高(圖5,表3)。樣品通過色譜分離及質(zhì)譜的精確質(zhì)量測定與結(jié)構(gòu)表征分析,成功鑒定出28種脂質(zhì)亞類及460個(gè)不同的脂質(zhì)分子,進(jìn)一步通過PLS-DA模型分析獲得17種脂質(zhì)亞類的158個(gè)差異脂質(zhì)分子(VIP值>1),部分VIP值>1.8的脂質(zhì)分子見圖6。

表3 PLS-DA模型性能評估結(jié)果

圖5 H37Rv與ΔRv1411c菌株經(jīng)偏最小二乘法判別分析法獲得脂質(zhì)代謝成分得分圖 (n=6)

注 縱坐標(biāo)代表脂質(zhì)分子的質(zhì)荷比分子量信息,其中,PE:磷脂酰乙醇胺,PC:磷脂酰膽堿,SM:鞘磷脂,FA:脂肪酸,TAG:甘油三脂,DAG:甘油二酯,Cer-NS:神經(jīng)酰胺-NS;橫坐標(biāo)為各脂質(zhì)分子的變量權(quán)重(VIP)值,介于1.8～2.8;右側(cè)紅紫色方塊代表脂質(zhì)分子在兩組中表達(dá)量的高低

2. H37Rv與ΔRv1411c菌株中差異脂質(zhì)分子的篩選:正、負(fù)離子模式下,進(jìn)一步結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,在VIP值>1的基礎(chǔ)上以FC>1.5或<0.67且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),從158個(gè)差異脂質(zhì)分子中篩選H37Rv與ΔRv1411c菌株上清的差異脂質(zhì)代謝物,共獲得36個(gè)具有顯著差異的脂質(zhì)分子。與H37Rv相比,ΔRv1411c培養(yǎng)上清中有12個(gè)脂質(zhì)分子上調(diào),24個(gè)脂質(zhì)分子下調(diào)(圖7,表4)。差異脂質(zhì)歸屬為11個(gè)亞類,分別為磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)、磷脂酰膽堿(phosphotidylcholine, PC)、鞘磷脂(sphingomyelin, SM)、甘油二酯(diglyceride, DAG)、脂肪酸(fatty acid, FA)、TAG、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside, GM)、溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidyl ethanolamine, LPE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)和磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS),以前三者脂質(zhì)亞類為主(圖8)。

表4 H37Rv與ΔRv1411c菌株差異脂質(zhì)成分分析結(jié)果

注 橫坐標(biāo)為log2轉(zhuǎn)換后的差異表達(dá)倍數(shù)(FC)值,縱坐標(biāo)為log10轉(zhuǎn)換后的P值,-lg(P)是確保當(dāng)P值減小時(shí),對應(yīng)的-y軸坐標(biāo)值增大,即縱坐標(biāo)越往上代表統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性越高。紅點(diǎn)及藍(lán)點(diǎn)分別代表符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的上調(diào)及下調(diào)的差異脂質(zhì)

注 DAG:甘油二酯,FA:脂肪酸,GM:神經(jīng)節(jié)苷脂,LPC:溶血磷脂酰膽堿,LPE:溶血磷脂酰乙醇胺,PC:磷脂酰膽堿,PE:磷脂酰乙醇胺,PI:磷脂酰肌醇,PS:磷酯酰絲氨酸,SM:鞘磷脂,TAG:甘油三脂

3.差異脂質(zhì)分子代謝通路的富集分析和拓?fù)浞治?利用MetaboAnalyst 4.0平臺,對篩選出的36個(gè)顯著差異的脂質(zhì)分子進(jìn)行KEGG代謝通路分析。結(jié)果顯示,差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物主要富集于以下8條通路,即:甘油磷脂代謝、亞麻酸代謝、α-亞麻酸代謝、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨的生物合成、甘油脂代謝、鞘脂代謝、花生四烯酸代謝及不飽和脂肪酸的生物合成通路。根據(jù)拓?fù)浞治鲇绊懸蜃訑?shù)值進(jìn)行分析及篩選,敲除Rv1411c造成的菌株間差異脂質(zhì)與甘油磷脂代謝通路密切相關(guān),其次為甘油脂代謝及糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨的生物合成通路(圖9)。甘油磷脂代謝通路中有PE(C00350)、PC(C00157)和LPC(C04230)類所在的3個(gè)位點(diǎn)被映射(圖10),其中,PE類映射的脂質(zhì)分子包含PE 34:1、PE 34:2、PE 35:1、PE 35:2,在敲除菌株中表現(xiàn)為普遍的下調(diào);PC類映射的脂質(zhì)分子包含PC 30:0e、PC 36:5e、PC 38:2和PC 42:6,在敲除菌株中存在上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)(圖11);LPC類映射的脂質(zhì)分子包含LPC 18:1e,在敲除菌株中表現(xiàn)為下調(diào)。

注 圖中每個(gè)氣泡代表1條代謝途徑;縱坐標(biāo)和氣泡顏色深淺代表富集分析的P值[lg(P)],顏色深的代謝途徑富集程度較高;橫坐標(biāo)及氣泡面積則共同表示拓?fù)浞治鲋性撀窂接绊懸蛩氐拇笮?/p>

注 圖中方框內(nèi)字母和數(shù)字表示MetaboAnalyst 4.0平臺對接的KEGG中的化合物代號,紅色方框?yàn)樘幱诖x通路中重要節(jié)點(diǎn)的脂質(zhì)分子

注 橫坐標(biāo)為紅色和綠色代表的兩種菌株,每種菌株均包含6個(gè)平行樣品;縱坐標(biāo)表示不同的脂質(zhì)分子,顏色強(qiáng)度表示各脂質(zhì)分子表達(dá)量的高低,由藍(lán)色(下調(diào))至紅色(上調(diào))變化

討 論

MTB感染宿主后,機(jī)體可產(chǎn)生以巨噬細(xì)胞為核心的一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng);同時(shí),MTB也進(jìn)化出不同的免疫逃逸機(jī)制來應(yīng)對機(jī)體免疫細(xì)胞的殺傷[18]。脂質(zhì)在MTB與宿主之間的免疫博弈中扮演著復(fù)雜的角色,一方面,MTB可以通過釋放自身脂質(zhì)成分參與宿主免疫的激活;另一方面,組成MTB包膜的糖脂成分參與協(xié)助入侵巨噬細(xì)胞及免疫逃逸[19-22]。除此之外,脂質(zhì)也是MTB在宿主細(xì)胞中可利用的主要碳源[8]。研究發(fā)現(xiàn),MTB可通過釋放自身代謝產(chǎn)物,影響宿主的免疫反應(yīng)及脂質(zhì)代謝,維持自身在宿主體內(nèi)的生存[23]。由此可見,MTB釋放的脂質(zhì)代謝成分與其致病機(jī)制密切相關(guān)。

本研究利用噬菌體介導(dǎo)的MTB基因敲除技術(shù)構(gòu)建了Rv1411c敲除的菌株ΔRv1411c,發(fā)現(xiàn)體外生長的ΔRv1411c顯示出與H37Rv菌株相似的倍增時(shí)間和生長特性,提示Rv1411c敲除并不影響標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的菌株生長,與Bigi等[11]研究結(jié)果一致。本研究通過非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)敲除Rv1411c可顯著影響MTB的脂質(zhì)代謝,與H37Rv相比,ΔRv1411c上清中下調(diào)的差異脂質(zhì)分子占總差異脂質(zhì)的2/3,且下調(diào)的脂質(zhì)分子涉及多種脂質(zhì)亞類?；诖?筆者推測脂蛋白Rv1411c可能參與協(xié)助多種脂質(zhì)從胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)的過程,進(jìn)而有助于維持MTB內(nèi)部的脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)。但目前的研究僅證明了脂蛋白Rv1411c具有對TAG、LAM、PIM等三?；|(zhì)的結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)功能,而對其他亞類脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和探索[13-14, 16]。因此,本研究為進(jìn)一步探索MTB脂蛋白對于細(xì)菌脂質(zhì)和能量運(yùn)輸中的作用機(jī)制提供了線索,也為今后探索其與細(xì)菌毒力的關(guān)系提供了思路。

MTB作為一種胞內(nèi)寄生菌,可通過能量代謝的調(diào)節(jié)適應(yīng)宿主微環(huán)境[24]。有研究發(fā)現(xiàn),某些脂類代謝物與MTB在宿主體內(nèi)的長期持留有關(guān),在感染宿主期間MTB利用FA作為主要碳源,通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)FA等脂質(zhì)的積聚來作為自身碳和能量的來源[25-27]。FA脂類有助于PDIM等MTB毒力分子的生成,可被直接同化成細(xì)胞膜磷脂,與細(xì)胞膜的完整性相關(guān)[28-29]。據(jù)此,筆者通過分析這些可能被分泌到胞外的脂質(zhì)的變化和功能,間接揭示出它們在整體脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中的動態(tài)角色和潛在的生物學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn),ΔRv1411c上清中的FA亞類脂質(zhì)成分發(fā)生明顯變化,相較于H37Rv明顯上調(diào),提示敲除Rv1411c可能通過促進(jìn)FA亞類脂質(zhì)在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的外排或減弱FA亞類脂質(zhì)在細(xì)胞壁上的錨定發(fā)揮作用,與MTB的毒力及胞內(nèi)存活能力相關(guān)。以上說明MTB FA亞類的脂質(zhì)與MTB的毒力及胞內(nèi)存活能力密切相關(guān),FA亞類脂質(zhì)代謝對于MTB具有重要意義。對于其他差異脂質(zhì)亞類的研究目前尚存不足。

通過對差異脂質(zhì)的代謝通路分析,我們發(fā)現(xiàn)差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物主要富集于以下8條通路,即:甘油磷脂代謝、亞麻酸代謝、α-亞麻酸代謝、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨的生物合成、甘油脂代謝、鞘脂代謝、花生四烯酸代謝及不飽和脂肪酸的生物合成通路。經(jīng)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn),與菌株間差異脂質(zhì)最相關(guān)的代謝通路為甘油磷脂代謝,其次是甘油脂代謝和糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨的生物合成通路。甘油磷脂包括PE、PC、PI和PS等多種亞類,敲除Rv1411c后PE和PC類脂質(zhì)相較于H37Rv發(fā)生了較明顯的變化,24個(gè)下調(diào)的脂質(zhì)分子中有17個(gè)集中分布于PE和PC類脂質(zhì),提示脂蛋白Rv1411c與上述脂質(zhì)向胞外運(yùn)輸有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),甘油磷脂(特別是PE)與PIM和LAM等脂質(zhì)成分存在于MTB胞膜的最外層,是MTB與宿主之間相互作用的重要成分[30]。MTB可將PE和PI等脂質(zhì)分子釋放到宿主體內(nèi),以促進(jìn)MTB在宿主體內(nèi)的持久感染[31]。由此可見,脂蛋白Rv1411c可能是甘油磷脂從胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體,間接介導(dǎo)了MTB與宿主之間的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)敲除Rv1411c可顯著影響MTB在小鼠體內(nèi)的生存,推測與敲除Rv1411c所導(dǎo)致的毒力衰減相關(guān)[11, 16]。我們的結(jié)果也進(jìn)一步佐證了該研究的假說,即脂蛋白Rv1411c有可能通過協(xié)助PE和PI等脂質(zhì)分子向宿主細(xì)胞的釋放發(fā)揮毒力作用?？紤]本文主要集中于菌株的脂質(zhì)代謝,故將在未來對后兩者通路脂質(zhì)代謝的變化規(guī)律及可能的分子機(jī)制研究詳細(xì)解析,以提供新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)和理論支持。

總之,本研究構(gòu)建了Rv1411c敲除的MTB菌株ΔRv1411c,考慮到脂蛋白Rv1411c在前期研究中主要參與脂質(zhì)從包膜內(nèi)到包膜外的轉(zhuǎn)運(yùn),且部分脂質(zhì)可脫離至菌體外,故研究聚焦于上清中菌株外排的分泌型脂質(zhì)組學(xué)代謝差異,發(fā)現(xiàn)敲除Rv1411c后,菌株培養(yǎng)上清的脂質(zhì)代謝譜發(fā)生明顯差異,且以脂質(zhì)下調(diào)為主。差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物主要富集于甘油磷脂代謝通路,提示脂蛋白Rv1411c參與多種甘油磷脂類代謝產(chǎn)物由胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。本研究也存在一定局限性,如未結(jié)合菌株內(nèi)部的脂質(zhì)代謝情況進(jìn)行分析,后續(xù)研究有必要從MTB調(diào)控自身整體脂質(zhì)代謝的改變?nèi)胧?進(jìn)一步探索脂質(zhì)代謝與MTB的毒力、致病力和胞內(nèi)生存的關(guān)系,以及通過脂質(zhì)層面調(diào)控清除宿主體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的機(jī)制,這對于進(jìn)一步揭示MTB與脂質(zhì)相關(guān)的致病機(jī)制及開發(fā)新的抗結(jié)核藥物和減毒疫苗均具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)孫玉亭:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、開展實(shí)驗(yàn)研究、采集和分析數(shù)據(jù)、撰寫文章;全舒婷、孫柏旭和田雪:參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施、收集分析和解釋數(shù)據(jù);綦輝、焦偉偉、申阿東和孫琳:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱/指導(dǎo),提供技術(shù)、材料和經(jīng)費(fèi)支持