蔣永春，雷學(xué)俊，鄭 佳，，3，覃鳳陽(yáng)，張建敏，彭志云，趙 東，，3*

(1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644005；2.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000；3.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000)

濃香型白酒是中國(guó)一種傳統(tǒng)的白酒類型，也是中國(guó)白酒的一個(gè)重要品類。它以其獨(dú)特的風(fēng)味和濃郁的香氣而聞名于世，主要產(chǎn)地是四川、貴州、湖南等地。其主要原料是高粱，采用以小麥制成的大曲為糖化生香劑，通過(guò)續(xù)糟配料、混蒸混燒、泥窖固態(tài)發(fā)酵的方式釀造而成。濃香型白酒具有獨(dú)特的香氣和風(fēng)格特點(diǎn)，其香氣主要來(lái)源于酒中產(chǎn)生的各類風(fēng)味物質(zhì)，例如酯類、醇類、酮類等化合物[1]。濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，發(fā)酵溫度、水分、酸度等條件會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生影響。有研究表明，溫度是影響發(fā)酵的主要因素之一[2-3]，會(huì)對(duì)白酒產(chǎn)量與質(zhì)量、微生物種類與數(shù)量與香氣成分產(chǎn)生影響。羅冰和張?chǎng)瓮ㄟ^(guò)研究發(fā)現(xiàn)，溫度會(huì)影響白酒質(zhì)量[2，4]；張超[5]通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中升溫和降溫的速率發(fā)現(xiàn)，溫度會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程中各類微生物的變化；陳丙友[6]發(fā)現(xiàn)酒醅溫度變化會(huì)對(duì)清香型白酒酒醅微生物群落生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生影響；杜連起[7]通過(guò)研究入窖條件與濃香型白酒己酸乙酯的生成量發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)白酒香味物質(zhì)形成有著重要影響。由此可見，研究發(fā)酵溫度對(duì)濃香型白酒的生產(chǎn)有著重要意義，本試驗(yàn)通過(guò)研究溫度對(duì)白酒酒醅發(fā)酵理化性質(zhì)、有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，以期為濃香型白酒釀造提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：酒醅樣品由五糧液股份有限公司提供，為入窖酒醅。

試劑及耗材：丙三醇、硫酸銅、葡萄糖、次甲基藍(lán)、鹽酸、氫氧化鈉、基準(zhǔn)苯二甲酸氫鉀、鹽酸、丙三醇等，均為市售分析純。

儀器設(shè)備：電子天平、酒度計(jì)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、AVC-4D1 垂直流超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱（BPC-250F），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；萬(wàn)分之一分析天平（AE200）、色譜儀（Agilent 8890），美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)（圖1）

圖1 實(shí)驗(yàn)方案

將從車間取回的入窖酒醅裝入已經(jīng)消毒的塑料罐，每罐裝1.7 kg 酒醅，并分為三組放入恒溫培養(yǎng)箱,按以下方案進(jìn)行發(fā)酵。

第一組：恒溫培養(yǎng)箱起始溫度設(shè)置為15 ℃，每天升溫1 ℃，20 d 后升溫至35 ℃，取樣為第一階段；隨后在35 ℃下穩(wěn)定7 d，取樣為第二階段；再每天降溫1 ℃，3 d 后降溫至32 ℃發(fā)酵結(jié)束，取樣為第三階段。

第二組：恒溫培養(yǎng)箱起始溫度設(shè)置為20 ℃，每天升溫1 ℃，15 d 后升溫至35 ℃，取樣為第一階段；隨后在35 ℃下穩(wěn)定7 d，取樣為第二階段；再每天降溫1 ℃，3 d 后降溫至32 ℃發(fā)酵結(jié)束，取樣為第三階段。

第三組：恒溫培養(yǎng)箱起始溫度設(shè)置為25 ℃，每天升溫1 ℃，10 d 后升溫至35 ℃，取樣為第一階段；隨后在35 ℃下穩(wěn)定7 d，取樣為第二階段；再每天降溫1 ℃，3 d 后降溫至32 ℃發(fā)酵結(jié)束，取樣為第三階段。

每個(gè)階段取三個(gè)平行樣品進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2 理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.2.1 水分的檢測(cè)[8]

稱取10 g 均勻酒醅放入烘干至恒重的坩堝，105～110 ℃烘3 h，取出放入干燥器冷卻30 min，稱量，記為w1。含水量計(jì)算公式：f=(10-w1)／10×l00%。

1.2.2.2 酸度的檢測(cè)[8]

稱取均勻酒醅20 g 放入250 mL 燒杯中，加入200 mL 水?dāng)噭颍覝亟?0 min，前15 min 勤攪拌，后15 min 靜置。取20 mL 上清液于250 mL 三角瓶，加入25 mL 水，酚酞指示劑2 滴，以0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為其終點(diǎn)，平行試驗(yàn)滴定允許誤差不得超過(guò)0.1 mL。

1.2.2.3 淀粉的檢測(cè)[8]

①水解：稱取試樣10 g 于250 mL 三角瓶中，加入1∶4 鹽酸溶液，輕輕搖動(dòng)三角瓶，在瓶口裝上回流管，于電爐上回流水解30 min，取出，迅速冷卻，并用20 %氫氧化鈉溶液中和至微酸性，用脫脂棉過(guò)濾，濾液定容至250 mL。

②定糖：用斐林試劑滴定糖液，平行試驗(yàn)滴定允許誤差不超過(guò)0.1 mL。

1.2.2.4 殘?zhí)堑臏y(cè)定[8]

吸取5 mL 已測(cè)酸度的酒醅液于三角瓶中，用斐林試劑滴定，平行試驗(yàn)滴定允許誤差不超過(guò)0.1 mL，同時(shí)做平行空白試驗(yàn)。

1.2.2.5 酒精度的測(cè)定

稱取酒醅100 g，加入10 %的乙醇200 mL，蒸餾出100 mL的酒樣，測(cè)定酒精度。

1.2.3 有機(jī)酸測(cè)定

1.2.3.1 糟醅中有機(jī)酸的提取

稱取酒醅樣品10 g，加入100 mL 30 %的乙醇溶液，置于搖床150 r/min搖30 min，隨后靜置過(guò)夜，然后用0.45 μm濾膜過(guò)濾，制成有機(jī)酸提取液。

1.2.3.2 有機(jī)酸等微量成分的測(cè)定

色譜條件：Venusil ASB C18色譜柱（4.6×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相：0.12% H3PO4溶液，0.2 μm 濾膜過(guò)濾，流動(dòng)相流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫箱30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)

稱取酒醅100 g，加入10 %的乙醇200 mL，蒸餾出100 mL 的酒樣，運(yùn)用GC-MS 對(duì)酒醅中的重要有機(jī)酸及醇酯進(jìn)行分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用origin 2021軟件作折線圖和PCA圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度脅迫下不同起始溫度酒醅理化性質(zhì)變化規(guī)律

2.1.1 發(fā)酵過(guò)程中酒醅理化性質(zhì)隨時(shí)間的變化規(guī)律

不同起始溫度下酒醅理化性質(zhì)隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖2所示。

圖2 不同起始溫度下理化性質(zhì)變化規(guī)律

水分在發(fā)酵過(guò)程中總體呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，起始溫度15 ℃和25 ℃水分均在發(fā)酵第一階段達(dá)到最大值，分別為60.73%和60.35%。發(fā)酵第一階段水分均快速上升，說(shuō)明發(fā)酵第一階段淀粉快速下降產(chǎn)生酒精，因此酒醅水分快速增加，發(fā)酵第三階段由于進(jìn)入酯化期，水分下降，此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[9]。酸度總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到最大值。發(fā)酵第一階段酸度緩慢上升，說(shuō)明此時(shí)酵母菌生長(zhǎng)代謝旺盛抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，因此酸度上升緩慢；發(fā)酵第二階段開始，酒醅內(nèi)細(xì)菌開始生長(zhǎng)繁殖，因此酸度快速上升。pH 值總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。淀粉呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，發(fā)酵第一階段快速下降，因此發(fā)酵第一階段水分、酒精度快速上升，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[10]。殘?zhí)浅鹗紲囟?5 ℃的酒醅呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)外，均呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。酒精度發(fā)酵第一階段快速增長(zhǎng)，第二階段平穩(wěn)，第三階段下降。發(fā)酵剛開始酒醅內(nèi)氧氣含量豐富，益于酵母菌生長(zhǎng)繁殖，此時(shí)酒精度迅速上升并達(dá)到最高值，隨后進(jìn)入生酸期，產(chǎn)生的酒精與消耗的酒精基本持平，酒精度基本持平，最后進(jìn)入酯化期，部分酒精用于酯化反應(yīng)，因此酒精度下降。此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[11]。

發(fā)酵結(jié)束后，起始溫度15 ℃下殘?zhí)?、殘淀均最高，分別為1.55%、13.07%，酸度最低，為3.34°；起始溫度20 ℃下水分和酒精度含量最高，分別為60.1 %、6.83 %vol；起始溫度25 ℃下酸度最高，為3.68 °，pH 值、殘?zhí)?、殘淀、酒精度均最低，分別為3.41 °、1.27 %、10.98 %、6.49 %vol。起始溫度15 ℃、20 ℃、25 ℃淀粉利用率分別為4.48 %、5.61 %、6.57 %，酒精度增加量分別為4.93 %vol、4.96%vol、4.63%vol，可知起始溫度15 ℃下淀粉利用率最高。

2.2 溫度脅迫下酒醅有機(jī)酸含量變化

有機(jī)酸是濃香型白酒的重要呈味物質(zhì)，乳酸、乙酸、丁酸、己酸在有機(jī)酸中占比最高，其總和占有機(jī)酸總含量的90 %以上，被稱之為四大酸[12]。乳酸、乙酸、丁酸、己酸分別是乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的前體物質(zhì)[13-14]。乳酸、乙酸、丁酸、己酸是影響白酒酸度的主要因素。不同起始溫度下酒醅有機(jī)酸隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖3所示。

圖3 不同起始溫度下有機(jī)酸變化規(guī)律

乳酸在濃香型白酒酒醅酸類物質(zhì)中含量最高，適量的乳酸可以抑制雜菌生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)酸度；過(guò)量的乳酸會(huì)造成淀粉糖化率低，酒醅殘?zhí)歉?，出酒率低[15]。乳酸可以溶解其他香氣成分，具有定香作用，酒中乳酸和乳酸乙酯含量過(guò)高會(huì)降低酒的放香，使酒體香氣淡雅。因此生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)降低乳酸在酒中的含量[16]。發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量在發(fā)酵第一階段下降，在發(fā)酵二階段、三階段呈上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵第一階段窖內(nèi)氧氣充足，微生物生長(zhǎng)繁殖快，酒醅內(nèi)能源物質(zhì)供應(yīng)不足，乳酸作為反應(yīng)物被消耗，因此乳酸下降，發(fā)酵第二階段、三階段酒醅內(nèi)細(xì)菌含量增多，產(chǎn)生大量乳酸，因此乳酸呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[12]。

乙酸是白酒四大酸之一，其主要由醋桿菌生成，具有刺鼻的醋香味，揮發(fā)性很強(qiáng)。在白酒呈味有機(jī)酸中地位僅次于己酸，乙酸含量高會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)，因此在白酒生產(chǎn)中應(yīng)將乙酸的含量控制在較低水平[17]。乙酸含量在發(fā)酵第一階段緩慢上升，發(fā)酵二階段、三階段快速上升。發(fā)酵第一階段酒醅內(nèi)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，足夠醋酸菌生長(zhǎng)代謝，醋酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌種產(chǎn)生乙酸，部分酵母菌在無(wú)氧呼吸的情況下生成酒精的同時(shí)伴隨著乙酸的生成，因此乙酸含量上升。此結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[12]。

丁酸是濃香型白酒中重要的不揮發(fā)性有機(jī)酸，適量的丁酸使?jié)庀阈桶拙茙в形⑻鸬慕严阄?，有助于白酒呈味助香；過(guò)量的丁酸會(huì)使白酒窖泥臭明顯，降低白酒品質(zhì)[18]。丁酸含量在發(fā)酵第一階段呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵二階段、三階段除起始溫度15 ℃的酒醅丁酸呈上升趨勢(shì)，起始溫度20 ℃、25 ℃酒醅丁酸均緩慢下降。發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酸期后，窖內(nèi)呈厭氧環(huán)境，丁酸菌、異性乳酸菌生長(zhǎng)旺盛，這些細(xì)菌利用酒醅中的還原糖、乙醇和乙酸等物質(zhì)生成丁酸，發(fā)酵后期由于部分丁酸酯化生成丁酸乙酯，因此丁酸含量下降[15]。

己酸作為己酸乙酯的前體物質(zhì)，同時(shí)也是白酒中一種重要的呈香呈味物質(zhì)。發(fā)酵過(guò)程中己酸呈先下降后上升的趨勢(shì)，均在第一階段下降到最低值，在第三階段達(dá)到最高值。

起始溫度15 ℃發(fā)酵結(jié)束后，酒醅丁酸含量最高，為246.41 mg/L，乳酸、乙酸、己酸含量最低，分別為5250.74 mg/L、294.90 mg/L、29.09 mg/L。起始溫度20 ℃發(fā)酵結(jié)束后有機(jī)酸含量均處于起始溫度15 ℃和20 ℃之間。起始溫度25 ℃發(fā)酵結(jié)束后，酒醅乳酸、乙酸、己酸含量最高，分別為5958.57 mg/L、323.71 mg/L、33.88 mg/L，丁酸最低，為233.95 mg/L。發(fā)酵結(jié)束后，起始溫度越高，乳酸含量越高，可能是因?yàn)槿虢褱囟雀卟焕诮湍妇浞职l(fā)酵，導(dǎo)致其快速衰亡，細(xì)菌在整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程中占優(yōu)勢(shì)，因此乳酸含量高[12]。

2.3 溫度脅迫下酒醅酯類物質(zhì)含量變化

酯類物質(zhì)是白酒中一類重要的風(fēng)味成分，它們組成了白酒的各種香型，其絕對(duì)含量占濃香型白酒風(fēng)味組分第一。不同起始溫度下酒醅酯類物質(zhì)隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖4所示。

圖4 不同起始溫度下酯類物質(zhì)變化規(guī)律

乳酸乙酯香氣稍弱、微甜，是濃香型白酒重要的呈味物質(zhì)。發(fā)酵過(guò)程中乳酸乙酯呈不斷上升的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到最大值，此結(jié)果與周新虎研究結(jié)果一致[19]。乙酸乙酯主要呈現(xiàn)水果香和甜香，香氣稍弱、微甜,是濃香型白酒重要的呈味物質(zhì)。乙酸乙酯在發(fā)酵過(guò)程中呈不斷上升的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到最大值。己酸乙酯是判定濃香型白優(yōu)劣的重要因素，有菠蘿的香味和辛辣的味道。己酸乙酯除起始溫度為25 ℃的酒醅呈先下降后上升的趨勢(shì)外，起始溫度15 ℃和25 ℃的酒醅己酸乙酯都呈上升趨勢(shì)，均在發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到最大值。

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，起始溫度15 ℃下己酸乙酯生成量最大，為0.84 mg/100 mL，乳酸乙酯、乙酸乙酯生成量最小，分別為36.25 mg/100 mL、7.80 mg/100 mL；起始溫度20 ℃下乙酸乙酯生成量最大，為8.27 mg/100 mL；起始溫度25 ℃下乳酸乙酯生成量最大，為49.23 mg/100 mL，己酸乙酯生成量最小，為0.7 mg/100 mL。由結(jié)果可知，起始溫度15 ℃下，乙酸乙酯生成量最低，己酸乙酯生成量最高，符合濃香型白酒“增己降乳”的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 溫度脅迫下酒醅醇類物質(zhì)含量變化

醇類化合物是酒醅中占比最高的一類風(fēng)味物質(zhì)，具有沸點(diǎn)低、易揮發(fā)、口感刺激的特點(diǎn)。異戊醇、正丙醇、異丁醇和正丁醇是白酒的主要高級(jí)醇，適宜濃度的高級(jí)醇對(duì)白酒風(fēng)味有重要作用，濃度過(guò)高會(huì)有異味感[20-21]。不同起始溫度下酒醅醇類物質(zhì)隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖5所示。

圖5 不同起始溫度下醇類物質(zhì)變化規(guī)律

發(fā)酵過(guò)程中甲醇含量呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。正丙醇呈先上升再平穩(wěn)再上升的趨勢(shì)。正丁醇是白酒中的高級(jí)醇，口感苦，含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酒體味辣苦澀[22]，除起始溫度15 ℃的呈先上升再下降再上升的趨勢(shì)外，其余入窖溫度下酒醅正丁醇含量皆呈上升趨勢(shì)。異丁醇除起始溫度15 ℃呈持續(xù)上升的趨勢(shì)外，其余皆呈先上升再平穩(wěn)最后上升的趨勢(shì)；異戊醇除起始溫度15 ℃呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)外，其余起始溫度發(fā)酵下皆呈先上升再下降再上升的趨勢(shì)。

發(fā)酵結(jié)束后，起始溫度15 ℃下，正丙醇、異戊醇生成量最大，分別為3.49 mg/100 mL、1.10 mg/100 mL，甲醇生成量最小，為1.05 mg/100 mL；起始溫度20 ℃下，異戊醇生成量最大，為3.49 mg/100 mL，正丙醇、正丁醇、異丁醇生成量最低，分別為1.04 mg/100 mL、0.31 mg/100 mL、0.77 mg/100 mL；起始溫度25 ℃下，甲醇、正丁醇、異丁醇生成量最大，分別為1.18 mg/100 mL、0.42 mg/100 mL、0.8mg/100 mL，異戊醇生成量最低，為3.33 mg/100 mL。

2.5 理化、有機(jī)酸及揮發(fā)性風(fēng)味主成分分析

不同起始溫度發(fā)酵下，理化、有機(jī)酸及風(fēng)味主成分分析如圖6所示。

圖6 理化性質(zhì)、有機(jī)酸、風(fēng)味物質(zhì)PCA圖

如圖6 所示，第1 主成分PC1 和第2 主成分PC2可以解釋90.4%的原變量信息，3 種發(fā)酵溫度不同發(fā)酵時(shí)間的酒醅可以在PCA 雙標(biāo)圖的PCA 1 上明顯區(qū)分。不同發(fā)酵階段下的酒醅樣品能明顯分開，因此發(fā)酵階段對(duì)酒醅有著重要影響。起始溫度15 ℃的酒醅與pH 值、丁酸、正丁醇、甲醇、己酸呈正相關(guān)；起始溫度20 ℃的酒醅與pH 值、己酸、正丁醇、甲醇呈正相關(guān)；起始溫度25 ℃的酒醅與pH 值、乙酸、己酸乙酯呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)設(shè)置不同的起始溫度對(duì)濃香型酒醅發(fā)酵的理化性質(zhì)、有機(jī)酸和主要風(fēng)味物質(zhì)的生成開展研究，結(jié)果表明不同入窖起始溫度對(duì)酒醅發(fā)酵有明顯影響。其中，起始溫度為15 ℃的實(shí)驗(yàn)組出窖糟醅結(jié)果為最優(yōu)，其淀粉利用率最高，乙酸乙酯生成量最低，己酸乙酯生成量最高。

本研究進(jìn)一步明確了入窖溫度對(duì)濃香型白酒酒醅的影響，為濃香型白酒釀造工藝的優(yōu)化提供了一定的理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。