◎ 周 靜，張 鑫，陳旭雯，付 帥，王 練

（西昌新希望三牧乳業(yè)有限公司，四川 西昌 615000）

牦牛乳富含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，具有易消化吸收和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。牦牛乳的酪蛋白含量高，且酪蛋白組分豐富，具有良好的乳化性和發(fā)泡性。傳統(tǒng)牦牛乳酪蛋白的分離提取主要采用沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、高效液相色譜分離等方法，存在產(chǎn)率低、工藝復(fù)雜、分離效果不理想等問題，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此，本研究旨在為特色乳制品的深度開發(fā)和利用提供參考[1]。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)操作步驟

1.1.1 設(shè)計(jì)α-、β-、κ-酪蛋白分離工藝流程

設(shè)計(jì)α-、β-、κ-酪蛋白分離工藝流程，是實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟，需要考慮原料性質(zhì)、分離方法和操作條件等。①將牦牛奶樣品進(jìn)行初步處理，去除雜質(zhì)和沉淀物，采用離心法對(duì)牦牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理，去除脂肪和大分子蛋白。②對(duì)預(yù)處理后的樣品進(jìn)行pH 調(diào)節(jié)，使其處于適宜的分離條件下。在分離過程中，采用鈣鹽沉淀法，通過添加0.1～0.5 mol·L-1的CaCl2溶液，使酪蛋白沉淀，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)α-、β-、κ-酪蛋白的分離。分離后的沉淀經(jīng)過離心后，可得到不同酪蛋白的純化產(chǎn)物。③根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，調(diào)節(jié)CaCl2的濃度，通常在0.1～0.5 mol·L-1的范圍內(nèi)選擇合適的濃度，調(diào)節(jié)溶液的pH 為4.6～4.8，溫度通?？刂圃?～10 ℃，以促進(jìn)酪蛋白的沉淀和分離，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的穩(wěn)定性和分離效果的可靠性[2-3]。

1.1.2 進(jìn)行α-、β-、κ-酪蛋白分離工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

（1）調(diào)節(jié)CaCl2濃度對(duì)分離效果的考察。①準(zhǔn)備一系列不同濃度的CaCl2溶液，濃度范圍為0.1～0.5 mol·L-1，再將這些溶液分別與牦牛奶樣品混合，并進(jìn)行離心分離過程。②離心后，沉淀物為0.1～0.5 mol·L-1。其中，若CaCl2溶液≤0.1 mol·L-1，表明濃度過低，無法充分沉淀酪蛋白，分離效果不佳；若CaCl2溶液≥0.5 mol·L-1，表明濃度較高，會(huì)造成過度沉淀，使純化產(chǎn)物中雜質(zhì)含量超標(biāo)，導(dǎo)致分離效果不佳。因此，保持CaCl2溶液濃度在0.1～5 mol·L-1，即可實(shí)現(xiàn)高效、純凈的酪蛋白分離。

（2）調(diào)節(jié)冷卻溫度對(duì)分離效果的評(píng)估。調(diào)節(jié)冷卻溫度范圍通常在4～10 ℃。通過觀察可知，當(dāng)冷卻溫度為4 ℃時(shí)，雖然沉淀質(zhì)量評(píng)分較高，但分離純度和上清液殘留物質(zhì)評(píng)分較低，表明低溫下酪蛋白的沉淀速度較慢，導(dǎo)致分離時(shí)間延長(zhǎng)，但同時(shí)也有利于提高分離純度；當(dāng)溫度為10 ℃時(shí)，雖然沉淀質(zhì)量較低，但分離純度和上清液殘留物質(zhì)評(píng)分較高，因?yàn)楦邷囟燃铀倭顺恋磉^程，導(dǎo)致較多的雜質(zhì)殘留在產(chǎn)物中；當(dāng)溫度在6～8 ℃時(shí)，沉淀質(zhì)量、分離純度和上清液殘留物質(zhì)的評(píng)分都相對(duì)均衡，分離效果更佳，既能保證較高的分離純度，又能控制殘留物質(zhì)的含量。

1.2 利用SDS-PAGE 電泳方法評(píng)估牦牛奶中α-、β-、κ-酪蛋白的純度

樣品制備過程如下。①取出待分析的樣品2 mg，然后放入一個(gè)容量為1.5 mL 的離心管中。按照1 ∶4的比例，向離心管中加入4 倍樣品重量的純水，使樣品得以溶解。例如，如果樣品為2 mg，則需要加入8 mL 的純水。②待樣品充分溶解后，從中取出20 μL 的溶液，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中。在新的離心管中，向樣品溶液中加入20 μL 的β-巰基乙醇（β-ME）、15 μL 的飽和溴酚藍(lán)溶液，用于反應(yīng)和標(biāo)記樣品的試劑。③混合均勻后，將混合溶液置于金屬浴中，設(shè)定溫度為95 ℃，并進(jìn)行反應(yīng)處理，持續(xù)時(shí)間為10 min，處理完成后，備用樣品可用于后續(xù)的分析實(shí)驗(yàn)中。

電泳分析牦牛奶酪蛋白組分純度的具體步驟（見表1）。

表1 電泳分析牦牛奶酪蛋白組分純度步驟表

1.3 測(cè)定牦牛奶酪蛋白組分的功能特性

1.3.1 溶解性的測(cè)量方法

稱取2 mg 的酪蛋白樣品，將其溶解在水中或者緩沖液溶劑中，在室溫或者37 ℃條件下觀察其溶解過程。在溶解過程中，輕輕搖晃溶液，以促進(jìn)酪蛋白的充分溶解。同時(shí)，技術(shù)人員需要觀察溶液的透明度和均勻性，確保酪蛋白能夠完全溶解，不產(chǎn)生任何沉淀或凝固物。

1.3.2 乳化性的檢測(cè)程序

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和所需乳化性能，取2 mg 的酪蛋白樣品，溶解于pH 5.5～7.0、1.5 mL的緩沖液中。準(zhǔn)備1∶1的油相和水相，將酪蛋白樣品溶液加入油相和水相中，輕輕攪拌使其充分混合。觀察乳液10 min，看其是否形成了穩(wěn)定的乳液，并詳細(xì)記錄乳液的外觀、穩(wěn)定性以及乳化度等參數(shù)[4]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 牦牛奶中α-、β-、κ-酪蛋白的提取與分離效果

2.1.1 鈣離子濃度調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

一方面，α-CN 具有較多的磷酸絲氨酸基團(tuán)，在堿性條件下帶有更多的負(fù)電荷，與鈣離子結(jié)合的能力更強(qiáng)。隨著Ca2+濃度的增加，其與αs-酪蛋白的親和性也增加，導(dǎo)致αs-酪蛋白的沉淀。另一方面，在低溫條件下，β-酪蛋白往往處于游離態(tài)，溫度越低分離到β-酪蛋白的可能性就越高。

2.1.2 冷卻溫度調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

隨著冷卻溫度的降低，分子的運(yùn)動(dòng)減弱，導(dǎo)致分子間的相互作用減弱。在低溫下（2 ℃）β-CN 處于游離狀態(tài)，其含量較高，達(dá)到16.90 g。隨著溫度升高，α-CN 和β-CN 的含量逐漸降低，0 ℃時(shí)α-CN和β-CN 的含量低于2 ℃時(shí)。因此，選擇2 ℃作為不同酪蛋白分離溫度是合理的。此外，在溫度為2 ℃、CaCl2溶液濃度為0.065 mol·L-1的條件下，也能成功分離得到αs-CN 和β-CN 組分，進(jìn)一步表明選擇2 ℃是適宜的。

2.2 牦牛奶α-、β-、κ-酪蛋白功能特性的分析

2.2.1 不同pH 對(duì)酪蛋白組分溶解性的影響分析

對(duì)牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白進(jìn)行溶解性的研究，可以揭示它們?cè)诓煌瑮l件下的溶解行為。研究發(fā)現(xiàn)，隨著溶液pH 的變化，牦牛奶中的酪蛋白溶解度也會(huì)發(fā)生變化。隨著pH 增大，酪蛋白溶解度呈先降低后增加的趨勢(shì)，達(dá)到峰值后趨于平緩。特別是在等電點(diǎn)附近，酪蛋白的溶解度最低。這一現(xiàn)象與其他研究結(jié)果相符，由于pH變化引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變性，疏水基團(tuán)外露，影響與水分子的相互作用，從而影響了溶解度。另外，牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白的溶解度還受溫度的影響。研究證實(shí)，在40～80 ℃之間時(shí)，溫度與酪蛋白的溶解度呈負(fù)相關(guān)，其原因可能在于加熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性基團(tuán)暴露，引起蛋白分子極化和構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致溶解度的下降。

2.2.2 不同pH 對(duì)酪蛋白組分乳化性的影響分析

牛乳中的α-、β-、κ-酪蛋白在不同pH 下的乳化能力表現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)。隨著pH 從酸性到堿性的變化，乳化能力先降后升，直至趨于平緩。當(dāng)pH 為2.1 時(shí)，牦牛乳中的α-、β-、κ-酪蛋白乳化能力最佳，表現(xiàn)較好的乳化特性。這可能是由于pH 變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化，增加了靜電斥力，使得疏水基團(tuán)暴露增多，從而提升了乳化性能[5]。相反，在pH 為4～5 時(shí)，蛋白質(zhì)的可溶性減少，影響乳化穩(wěn)定性。當(dāng)pH 偏離等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)帶電，乳化液之間的相互作用有效抑制了液滴的聚集，乳化穩(wěn)定性得以提高。當(dāng)pH 為6.15 時(shí)，乳化穩(wěn)定性達(dá)到最佳狀態(tài)。

2.2.3 pH 變化對(duì)酪蛋白組分發(fā)泡性的影響分析

當(dāng)pH 為2.1 時(shí)，三者的起泡性達(dá)到最佳狀態(tài)；當(dāng)pH 為4.26 時(shí)，泡沫穩(wěn)定性表現(xiàn)最佳，可能是蛋白質(zhì)的兩性電解質(zhì)性質(zhì)所致。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的電荷與溶液的pH 相近時(shí)，其帶電荷為0，導(dǎo)致溶解性下降，從而影響了其在氣－液界面的排列和展開能力，進(jìn)而降低了起泡性。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的電荷偏離等電點(diǎn)時(shí)，其溶解性增加，分子間的自由度提高，促進(jìn)蛋白質(zhì)在氣－液界面的快速排列和展開，從而提高了起泡性。這表明，蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)和溶解性對(duì)其在液體中的表現(xiàn)具有重要影響，特別是在液體界面的作用。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白進(jìn)行研究，觀察了蛋白質(zhì)在不同pH 下的溶解性變化，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)先降低后增加的規(guī)律。當(dāng)pH 為2.1 時(shí)，溶解度達(dá)到最高值，與其他研究結(jié)果相符合；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，牦牛奶中的α-、β-、κ-酪蛋白的溶解度較高，隨著溫度升高，溶解度逐漸降低；當(dāng)pH 為2.1時(shí)，牦牛奶中的酪蛋白表現(xiàn)較好的乳化能力和泡沫穩(wěn)定性。因此，本研究結(jié)果可以為牦牛奶蛋白質(zhì)的功能特性提供重要參考，對(duì)牦牛奶產(chǎn)品的生產(chǎn)和質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。