付琳琳，馬保東，張書娟，霍彥平

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院乳腺外科,河南 鄭州 450001;2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心,河南 鄭州 450001;3.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院檢驗科,河南 鄭州 450001)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,也是女性癌癥死亡的主要原因[1]。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計顯示,全球新發(fā)乳腺癌病例230萬例,占所有癌癥患者的11.7%;其中2020年死亡人數(shù)超過 68.5萬例[2]。近年來,乳腺癌的診斷和治療取得了巨大進(jìn)展,但乳腺癌患者的預(yù)后仍然較差。目前,乳腺癌的治療仍以手術(shù)為主,聯(lián)合化學(xué)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等其他輔助治療[3-4]。近期,針對不同亞型乳腺癌靶向免疫治療研究取得了突破性進(jìn)展,程序性死亡受體1 (programmed cell death protein 1,PD-1)/程序性死亡-配體1 (programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)通路的拮抗劑可以在一些轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌患者中誘導(dǎo)持久的臨床效果[5-6]。因此,開發(fā)預(yù)測新的免疫治療靶點將對治療乳腺癌以及改善患者的預(yù)后帶來更多希望。三重基序蛋白28(tripartite motif-containing 28,TRIM28)是1個包含多個結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白,屬于人類三聚體蛋白家族中的一員,也被稱為KRAB相關(guān)蛋白1或轉(zhuǎn)錄中間因子1β[7]。TRIM28參與調(diào)控多種生物進(jìn)程,包括細(xì)胞增殖、侵襲、分化和衰老等[7]。不僅如此,TRIM28還在T細(xì)胞活化和T細(xì)胞耐受中起著至關(guān)重要的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn),黑色素瘤[9]、腎透明細(xì)胞癌[10]和肺腺癌[11]等均與TRIM28相關(guān)的免疫應(yīng)答有關(guān)。目前,TRIM28對乳腺癌細(xì)胞的影響及其與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系尚不清楚?；诖?本研究旨在通過生物信息學(xué)方法結(jié)合體外實驗探索TRIM28在乳腺癌中的表達(dá)水平及其對乳腺癌細(xì)胞的影響,并分析TRIM28與乳腺癌中免疫浸潤細(xì)胞之間的關(guān)系,為后續(xù)進(jìn)一步發(fā)掘乳腺癌免疫治療的新靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本收集

收集2020年9月至2022年1月在鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院進(jìn)行診治的39例乳腺癌患者的石蠟包埋腫瘤組織標(biāo)本及配對的癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌;(2)所取癌組織標(biāo)本位于瘤體中央,無出血、壞死及囊性病變。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)手術(shù)前經(jīng)化學(xué)治療、放射治療和免疫治療;(2) 乳腺癌合并其他器質(zhì)性疾病及惡性腫瘤。本研究由鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器

MCF7乳腺癌細(xì)胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、40 g·L-1多聚甲醛、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染液購自北京索萊寶科技有限公司,Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國賽默飛世爾科技有限公司,siRNA購自蘇州吉瑪基因股份有限公司,TRIM28抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin,IgG)購自英國Abcam公司,Omni-ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色液購自美國Biogradetech公司,細(xì)胞計數(shù)盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;正置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司,細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司,超凈工作臺、細(xì)胞計數(shù)儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司,電泳儀、凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司,酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測乳腺癌組織及癌旁組織中TRIM28蛋白的表達(dá)

取石蠟包埋的乳腺癌組織和癌旁組織,應(yīng)用二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,高溫抗原修復(fù),體積分?jǐn)?shù)3% 過氧化氫溶液室溫孵育15 min,滴加TRIM28一抗(滴度為1：50),4 ℃孵育過夜;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG二抗(滴度為1：5 000),室溫孵育30 min。DAB顯色液顯色,蘇木精復(fù)染,自來水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,應(yīng)用正置顯微鏡觀察細(xì)胞染色結(jié)果;使用免疫組織化學(xué)評分(histochemistry score,H-score) 半定量評估染色強度和在特定強度范圍內(nèi)染色細(xì)胞的百分比。H-score=Σpi(i+1),式中pi表示陽性細(xì)胞數(shù)量占切片中所有細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù);i代表著色強度。H-score的范圍為0～300,數(shù)值越大表示TRIM28蛋白表達(dá)水平越高。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF7細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3 siRNA干擾實驗敲低TRIM28

取對數(shù)生長期MCF7細(xì)胞,隨機分為si-control組和si-TRIM28組;在50 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基中加入0.5 μg DNA制備為A液(si-control組加入空載質(zhì)粒,si-TRIM28組加入敲低TRIM28的質(zhì)粒);用50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋1 μg的RNAi-Mate制備為B液,室溫孵育5 min。將A液和B液混勻后室溫孵育30 min;將所得到的DNA/RNAi-Mate復(fù)合物加入到接種MCF7細(xì)胞(每孔1×105)的24孔板中,補充Opti-MEM培養(yǎng)基至500 μL,培養(yǎng)48 h后更換為含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的無雙抗DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行后續(xù)實驗操作。

1.3.4 Western blot法檢測MCF7細(xì)胞中TRIM28蛋白表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后的si-control組和si-TRIM28組MCF7細(xì)胞,使用免疫沉淀裂解緩沖液裂解,提取細(xì)胞的總蛋白后定量測定蛋白濃度,將2組中等量的蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠上進(jìn)行電泳分離,在冰浴條件下以200 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。室溫下使用50 g·L-1的脫脂牛奶和含Tween20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液將膜封閉2 h,滴加TRIM28、β-actin一抗(滴度為1：1 000)室溫孵育1 h,并4 ℃孵育過夜;滴加相應(yīng)二抗(滴度為1：5 000)室溫下孵育2 h,每次10 min洗脫3次。使用Omni-ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒配制顯影液,將顯影液滴加至PVDF膜上,放至顯影儀中曝光拍照保存。使用Image J 軟件分析條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參,TRIM28蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次,取均值。

1.3.5 CCK-8實驗檢測MCF7細(xì)胞增殖能力

取轉(zhuǎn)染后的si-control組和si-TRIM28組MCF7細(xì)胞,按每孔3×103個細(xì)胞接種于96孔板中,每組設(shè)3個復(fù)孔,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。然后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,并置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。通過細(xì)胞存活率反映細(xì)胞的增殖能力,細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100% (As為si-TRIM28組吸光度值,Ac為si-control組吸光度值,Ab為空白組吸光度值),細(xì)胞存活率越高表示細(xì)胞的增殖能力越強。

1.3.6 平板克隆形成實驗檢測MCF7細(xì)胞集落形成能力

取轉(zhuǎn)染后的si-control組和si-TRIM28組對數(shù)生長期MCF7細(xì)胞,胰蛋白酶消化,使用完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液,按每孔3×103個細(xì)胞接種于6孔板,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的克隆形成時停止培養(yǎng)。使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌1次,每孔加入40 g·L-1多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌1次;每孔加入1 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染色 20 min,PBS清洗后晾干并拍照,觀察集落形成的數(shù)量。

1.3.7 基于美國癌癥腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌組織中免疫浸潤細(xì)胞

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載乳腺癌患者的mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均為原始Count數(shù)據(jù),對所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。通過CIBERSORT算法來計算所有樣本組織中22種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的差異。從CIBERSORT網(wǎng)站下載R腳本,使用R軟件對所有樣本的mRNA表達(dá)矩陣進(jìn)行分析,基于P<0.05選擇具有顯著差異的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞。

1.3.8 基于基因組富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)獲取TRIM28基因介導(dǎo)的免疫/癌癥相關(guān)信號通路

為了闡明TRIM28基因表達(dá)水平信號通路的顯著差異,使用GSEA軟件4.3.2中的c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt作為對照基因組;以標(biāo)準(zhǔn)化富集得分>1、P<0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.25定義為具有顯著差異的信號通路。

1.3.9 免疫調(diào)節(jié)因子的獲取及富集分析

在TISIDB數(shù)據(jù)庫中選擇“Gene Symbol”,使用“Immunomodulator”模塊獲取與TRIM28蛋白具有相關(guān)性的免疫調(diào)節(jié)因子。將上述獲得的免疫調(diào)節(jié)因子導(dǎo)入WebGestalt網(wǎng)站進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 信號通路富集分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中TRIM28蛋白表達(dá)水平比較

乳腺癌組織中TRIM28蛋白陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)中,呈棕黃色細(xì)顆粒狀。TRIM28蛋白在癌旁組織中呈陰性或弱陽性表達(dá),在乳腺癌組織中呈強陽性表達(dá),結(jié)果見圖1。腫瘤組織和癌旁組織中TRIM28蛋白表達(dá)水平分別為75.91±54.99、50.96±41.71;腫瘤組織中TRIM28蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.258,P=0.027)。

A:腫瘤組織;B:癌旁組織。圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中TRIM28蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)Fig.1 Expression of TRIM28 protein in breast cancer tissues and paracancerous tissues(immunohistochemical staining,×200)

2.2 2組MCF7細(xì)胞中TRIM28蛋白相對表達(dá)量比較

si-control組和si-TRIM28組MCF7細(xì)胞中TRIM28蛋白相對表達(dá)量分別為1 058 456.33±21 557.87、206 617.00±10 389.57;si-TRIM28組MCF7細(xì)胞中TRIM28蛋白相對表達(dá)量顯著低于si-control組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=61.654,P<0.05)。結(jié)果見圖2。

1:si-control組;2:si-TRIM28組。圖2 si-control組和si-TRIM28組MCF7細(xì)胞中TRIM28蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of TRIM28 protein in MCF7 cells in the si-control group and si-TRIM28 group

2.3 2組MCF7細(xì)胞增殖能力比較

培養(yǎng)第0天,2組MCF7細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)第4天,si-TRIM28組MCF7細(xì)胞存活率顯著低于si-control組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 si-control組和si-TRIM28組MCF7細(xì)胞增殖能力比較Tab.1 Comparison of MCF7 cell proliferation ability between the si-control group and si-TRIM28 group

2.4 2組MCF7細(xì)胞集落形成能力比較

si-control組和si-TRIM28組MCF7細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(338.0±9.2)、(236.3±12.2)個;si-TRIM28 組MCF7細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著少于si-control組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.528,P<0.05)。結(jié)果見圖3。

A:si-control組;B:si-TRIM28組。圖3 si-control組和si-TRIM28組MCF7細(xì)胞克隆形成Fig.3 Clone formation of MCF7 cells in the si-control group and si-TRIM28 group

2.5 乳腺癌組織中免疫細(xì)胞浸潤情況

基于TCGA分析乳腺癌組織中免疫浸潤細(xì)胞結(jié)果顯示,乳腺癌組織和癌旁組織樣本中巨噬細(xì)胞亞群(M0、M1和M2)、B細(xì)胞亞群(初始B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞)、T細(xì)胞亞群(CD8 T細(xì)胞、靜息記憶CD4 T細(xì)胞、活化的記憶CD4 T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)、活化的自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明免疫微環(huán)境密切參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。結(jié)果見圖4。

A:熱圖。B:小提琴圖。Monocytes M0:單核細(xì)胞M0;B cells naive:幼稚B細(xì)胞;T cells CD8:CD8型T細(xì)胞;T cells follicular helper:濾泡輔助性T細(xì)胞;Macrophages M1:M1型巨噬細(xì)胞;Mast cells resting:靜息肥大細(xì)胞;Plasma cells:漿細(xì)胞;T cells regulatory (Tregs):調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;Dendritic cells resting:靜息樹突狀細(xì)胞;T cells CD4 memory activated:活化的記憶CD4 T細(xì)胞;NK cells resting:靜息NK細(xì)胞;Neutrophils:中性粒細(xì)胞; B cells memory:記憶B細(xì)胞;T cells gamma delta:γδT細(xì)胞;T cells CD4 naive:CD4幼稚型T細(xì)胞;Eosinophils:嗜酸性粒細(xì)胞;NK cells activated: 活化的NK細(xì)胞;Mast cells activated:活化的肥大細(xì)胞;T cells CD4 memory resting:靜息的記憶CD4 T細(xì)胞;Macrophages M2:M2型巨噬細(xì)胞。圖4 TCGA-BRCA組織樣本中免疫細(xì)胞的差異Fig.4 Differences of immune cells in TCGA-BRCA tissue samples

2.6 乳腺癌組織中TRIM28蛋白表達(dá)水平與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的關(guān)系

乳腺癌組織中TRIM28蛋白表達(dá)水平與浸潤的單核細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.150、0.100,P<0.05),與活化的樹突狀細(xì)胞、活化的記憶CD4 T細(xì)胞、靜息的記憶CD4 T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(r=-0.100、-0.160、-0.099、-0.190,P<0.05),結(jié)果見圖5。

A:TRIM28與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相關(guān)性;B:TRIM28與單核細(xì)胞的相關(guān)性;C:TRIM28與活化的樹突狀細(xì)胞的相關(guān)性;D:TRIM28與活化的記憶CD4 T細(xì)胞的相關(guān)性;E:TRIM28與靜息記憶CD4 T細(xì)胞的相關(guān)性;F:TRIM28與γδT細(xì)胞的相關(guān)性。圖5 乳腺癌組織中TRIM28蛋白表達(dá)水平與浸潤免疫細(xì)胞的相關(guān)性Fig.5 Correlation between TRIM28 protein expression level and infiltrating immune cells in breast cancer tissues

2.7 TRIM28基因參與的免疫/癌癥相關(guān)信號通路

GSEA分析結(jié)果表明,TRIM28參與了多種免疫/癌癥相關(guān)的信號通路,包括癌癥通路、T細(xì)胞受體信號通路、Notch信號通路和Wnt信號通路;結(jié)果見圖6。

A:癌癥通路;B:T細(xì)胞受體信號通路;C:Notch信號通路;D:Wnt信號通路。圖6 TRIM28參與免疫/癌癥相關(guān)信號通路Fig.6 TRIM28 is involved in immune/cancer-related signaling pathways

2.8 TRIM28基因相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)因子

從TISIDB數(shù)據(jù)庫中獲取了TRIM28相關(guān)的58個免疫調(diào)節(jié)因子,其中免疫刺激因子包括C10orf54、CD27、CD276、CD28、CD40、CD40LG、CD48、CD80、CD86、C-X-C基序趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)、C-X-C基序趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)、外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1,ENTPD1)、誘導(dǎo)性T細(xì)胞共刺激分子(inducible T cell costimulatory,ICOS)及其配體、白細(xì)胞介素2受體α(interleukin-2 receptor subunit alpha, IL2RA)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及其配體、殺傷細(xì)胞凝集素樣受體亞家族成員(killer cell lectin-like receptor subfamily member,KLRC1,KLRK1)、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha,LTA)、組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)基因B (MHC class I polypeptide-related sequence B, MICB)、胞外5′-核苷酸酶(ecto-5′-nucleotidase,NT5E)、脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(poliovirus receptor,PVR)、視黃酸早期轉(zhuǎn)錄1e (retinoic acid early transcript 1E,RAET1E)、跨膜蛋白173(transmembrane protein 173,TMEM173)、UL16 結(jié)合蛋白 1 (UL16 binding protein 1,ULBP1)、TNF受體超家族成員(TNF receptor superfamily member,TNFRSF)和TNF超家族成員 (TNF superfamily member,TNFSF);免疫抑制因子包括ADORA2A、BTLA、CD160、CD244、CD274、CD96、 集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor,CSF1R)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)、甲型肝炎病毒細(xì)胞受體 2 (hepatitis A virus cellular receptor 2,HAVCR2)、人吲哚胺2,3-雙加氧酶1 (indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及其受體,激酶插入域受體(kinase insert domain receptor,KDR)、淋巴細(xì)胞激活基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG3)、細(xì)胞程序性死亡蛋白1配體2(programmed cell death protein 1 ligand 2,PDCD1LG2)、脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)分子2(poliovirus receptor related protein 2,PVRL2)、轉(zhuǎn)化生長因子β受體 1(transforming growth factor beta receptor 1,TGFBR1)、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell immune receptor with immunoglobulin and ITIIM domain,TIGIT)、 C10orf54、含V-Set域T-細(xì)胞激活抑制因子1(V-set domain containing T-cell activation inhibitor 1,VTCN1)。對這58個免疫調(diào)節(jié)因子進(jìn)行KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示,免疫調(diào)節(jié)因子CSF1R、CXCL12、CD27、CD40和CD40LG共同參與了T細(xì)胞受體信號通路、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、NF-κB信號通路等信號通路,見圖7。

圖7 TRIM28相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子的KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of TRIM28-related immunomodulatory factors

3 討論

迄今為止,許多研究表明,乳腺癌組織中TRIM28蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)[12-13]。WEI等[12]研究發(fā)現(xiàn),TRIM28蛋白在晚期乳腺癌組織中高度表達(dá),并通過穩(wěn)定TWIST1來增強乳腺癌轉(zhuǎn)移,表明靶向TRIM28蛋白可能是乳腺癌治療的有效策略。除此之外,有研究報道,TRIM28蛋白的高表達(dá)還是乳腺癌患者預(yù)后不良的預(yù)測指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果顯示,腫瘤組織中TRIM28蛋白的表達(dá)顯著高于癌旁樣本,這與先前的研究結(jié)果一致[12-13]。此外,本研究使用siRNA敲低了MCF7乳腺癌細(xì)胞系中的TRIM28,結(jié)果發(fā)現(xiàn),si-TRIM28組細(xì)胞中TRIM28蛋白相對表達(dá)量顯著低于si-control組;2組細(xì)胞培養(yǎng)第0天的存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,si-TRIM28組細(xì)胞培養(yǎng)第4天的存活率顯著低于si-control組,si-TRIM28組MCF7細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著少于si-control組;提示,TRIM28能夠提高M(jìn)CF7細(xì)胞的增殖和集落形成能力,從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受到導(dǎo)管微環(huán)境中多種因素的影響,既包含了免疫細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和一系列微生物,也包括可溶性生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、前列腺素等[14]。在這些因素中,免疫細(xì)胞所發(fā)揮的作用至關(guān)重要。從正常乳腺組織的免疫監(jiān)視,一直到原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌,免疫細(xì)胞貫穿整個乳腺癌發(fā)生過程[15]。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌組織樣本分析發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織與癌旁組織中巨噬細(xì)胞亞群、B細(xì)胞亞群、T細(xì)胞亞群、活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)均有顯著差異。目前,免疫療法在乳腺癌的臨床治療中取得了巨大的突破,發(fā)現(xiàn)新的免疫治療靶標(biāo)對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制和防治具有重要意義[16]。為了明確TRIM28蛋白和乳腺癌中腫瘤浸潤免疫細(xì)胞之間的關(guān)系,本研究計算了TRIM28蛋白和免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示,TRIM28蛋白與浸潤的單核細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞呈正相關(guān),與活化的樹突狀細(xì)胞、活化的記憶CD4 T細(xì)胞、靜息的記憶CD4 T細(xì)胞和γδ T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。CAR-T 細(xì)胞療法是一種由過繼性 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移開發(fā)的免疫療法[17-18],該治療方法也是近些年乳腺癌免疫治療的新方法[19]。本研究證實TRIM28蛋白與T細(xì)胞密切相關(guān),這為后續(xù)進(jìn)一步研究TRIM28蛋白是否成為CAR-T細(xì)胞治療的潛在靶點提供了依據(jù)。

此外,本研究結(jié)果顯示,TRIM28基因和相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)因子參與了多種癌癥/免疫信號通路,如癌癥通路、T細(xì)胞受體信號通路、Notch信號通路、Wnt信號通路和NF-κB信號通路;對與TRIM28基因相關(guān)的58個免疫調(diào)節(jié)因子進(jìn)行KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示,免疫調(diào)節(jié)因子CSF1R、CXCL12、CD27、CD40和CD40LG共同參與了T細(xì)胞受體信號通路、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、NF-κB信號通路等信號通路。而Notch信號通路是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞間通訊機制,在許多細(xì)胞類型和不同的發(fā)育階段發(fā)揮作用[20]。在哺乳動物的發(fā)育過程中,Notch信號通路控制著器官發(fā)育的各個方面,還與細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)有關(guān)[21-23]。Notch信號通路在乳腺癌中異常激活,主要通過如Notch1、2和3的PEST結(jié)構(gòu)域激活性突變以及破壞NRR和異構(gòu)化結(jié)構(gòu)域的突變等誘導(dǎo)[22]。Notch還與其他的生長因子、促炎細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和促癌通路相互作用。Notch可以聯(lián)合缺氧誘導(dǎo)因子1-α和G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的血管生成和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展[21]。更重要的是,Notch還與Wnt通路相互串?dāng)_以調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展[24]。Wnt信號通路不僅僅局限于健康乳房和乳腺的發(fā)育和維持,而且還在乳腺癌發(fā)病機制中也起著同樣突出的作用[25]:一方面,激活的Wnt信號通路通過Notch依賴性機制觸發(fā)人乳腺上皮細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化[26];另一方面,異常的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)也是乳腺癌的一個重要特征[24]。因此,NF-κB信號通路參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)癌癥和炎癥中的免疫反應(yīng)。在乳腺癌基質(zhì)中浸潤的白細(xì)胞通過NF-kB信號通路導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞惡性腫瘤的增加[27]。因此,推測TRIM28基因通過以上信號通路交叉作用參與調(diào)節(jié)乳腺癌中的免疫微環(huán)境。

4 結(jié)論

TRIM28蛋白在乳腺癌中高度表達(dá),敲低TRIM28基因可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力和集落形成能力;TRIM28蛋白與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞密切相關(guān),可能通過多種免疫/癌癥相關(guān)信號通路參與調(diào)節(jié)乳腺癌免疫微環(huán)境。因此,TRIM28蛋白與乳腺癌的腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān),這為臨床靶向免疫治療轉(zhuǎn)化提供了基礎(chǔ)。但是還需進(jìn)一步的實驗驗證乳腺癌中TRIM28蛋白與免疫細(xì)胞之間的聯(lián)系和相關(guān)作用機制。