黃貝旭 劉昶 梁嫩 廖松潔

施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，是維持神經(jīng)正常功能的重要組分，在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)和神經(jīng)病理性疼痛過程中起關(guān)鍵性作用。研究表明，施萬細(xì)胞所形成的完整髓鞘促進軸索再生并抑制神經(jīng)纖維異位放電[1-2]，創(chuàng)造適合神經(jīng)修復(fù)的微環(huán)境，清除含軸索生長抑制物的自身髓鞘，并產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素等保護性物質(zhì)和抑制腫瘤壞死因子等，從而可促進痛性周圍神經(jīng)病的恢復(fù)[3-4]。并且，施萬細(xì)胞幫助建立神經(jīng)軸索與微血管的聯(lián)系[5]。但是，施萬細(xì)胞變性、功能異?？杉せ钛装Y因子，加劇神經(jīng)元軸索退化；炎性反應(yīng)過度的情況下，施萬細(xì)胞可進一步產(chǎn)生炎性介質(zhì)和趨化因子，向遠(yuǎn)端存留或再生的軸索及近端背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元滲透，誘導(dǎo)外周敏化[6]?？梢?，維持施萬細(xì)胞的正常功能可作為周圍神經(jīng)損傷的治療靶點，保護施萬細(xì)胞也是減輕神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展和慢性化的重要機制[7-9]。哺乳動物Ste20 樣激酶2（mammalian ste20-like kinase 2, MST2）是Hippo 生長抑制通路中關(guān)鍵的絲氨酸/蘇氨酸激酶之一，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖和分化中起重要作用[10]。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，敲低MST2的同源類似物可改善神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，并且逆轉(zhuǎn)施萬細(xì)胞的線粒體功能障礙[11]，但是調(diào)控的具體機制尚不清楚。為了開展進一步的機制研究，本實驗擬構(gòu)建工具細(xì)胞，即使用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)，構(gòu)建穩(wěn)定敲低及過表達(dá)MST2的大鼠施萬細(xì)胞系，檢測基因干預(yù)MST2的效率及對于線粒體膜電位的影響，為研究MST2 在施萬細(xì)胞的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建采用大鼠施萬細(xì)胞株（RSC96），慢病毒包裝采用人胚腎細(xì)胞株（HEK293 T），均來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。敲低Mst2基因的慢病毒重組質(zhì)粒、第二代慢病毒系統(tǒng)包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G、感受態(tài)大腸桿菌（貨號：TSC-C06）、Polybrene 及相關(guān)引物購自北京擎科生物科技股份有限公司。過表達(dá)慢病毒載體GV341 及相應(yīng)慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper 1.0 和pHelper 2.0、吉凱轉(zhuǎn)染試劑由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。限制性核酸內(nèi)切酶AgeI/NheI（貨號：R3552S；R3131V）來源于New England Biolabs公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：A233）、超保真PCR 預(yù)混液（貨號：A064）、無縫克隆試劑盒（貨號：T196）及膠回收試劑盒（貨號：D205）均購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。重組質(zhì)粒測序由廣州易錦生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 實驗分組 本實驗細(xì)胞株分為6 組：對照（control，CON）組，即正常對照組；氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）組，即氧糖剝奪模型組；sh-NC 組，即MST2 敲低對照組；sh-MST2 組，即MST2 敲低組；p-NC 組，即MST2 過表達(dá)對照組；p-MST2 組，即MST2 過表達(dá)組。每組實驗重復(fù)4～6次。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫上大鼠Mst2基因全長序列（NM_031735），以及GV341載體多克隆酶切位點AgeI/NheI進行引物設(shè)計：Primer F，5'CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGAGC AGCCGCCGGCGCC 3'，Primer R，5' AATGCCAACT CTGAGCTTGAAATTCTGCTGCCTCCTCTTTTTG 3'。引物包含無縫克隆交換配對堿基位點、酶切位點，并包含目的基因5'端部分序列用于與目的模板配對。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR 擴增大鼠施萬細(xì)胞Mst2全基因序列 使用TRIzol 法提取施萬細(xì)胞總mRNA，并取1 μg 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，使用上述引物進行大鼠Mst2全長序列擴增（PCR 儀，德國Biometra公司）。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，35 個循環(huán)反應(yīng)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將反應(yīng)產(chǎn)物進行DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳，對相應(yīng)片段進行凝膠回收，即獲得含有無縫克隆堿基位點、AgeI/NheI 酶切位點和Mst2全基因序列的DNA產(chǎn)物。

1.3.3 大鼠施萬細(xì)胞過表達(dá)Mst2重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 使用限制性核酸內(nèi)切酶AgeI/NheI 酶進行GV341 載體線性化，以Mst2DNA 產(chǎn)物∶線性化載體摩爾比為3∶1 的比例配制無縫克隆反應(yīng)體系，混勻后于PCR 儀中50 ℃反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后置于冰上，即可獲得Mst2過表達(dá)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，進行原核抗生素篩選，挑取單克隆菌落搖菌擴增，提取質(zhì)粒后進行PCR 鑒定，鑒定引物為Primer F，5' TGGACTACTTTGATAAGC AG 3'，Primer R，5' CCTTATAGTCCTTATCATCGT C 3'，將產(chǎn)物進行DNA 凝膠電泳，并挑選陽性轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒送測序。

1.3.4 慢病毒包裝及獲取 慢病毒包裝細(xì)胞HEK293T 均勻種于含有10% FBS DMEM 雙抗培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)皿。敲低Mst2基因的慢病毒重組質(zhì)粒是由特異性敲低Mst2的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, sh-RNA）與慢病毒載體pLKO.1-PURO 重組合成，序列為5' GCAAGTACCTGTTGAGTCA 3'。敲低MST2 慢病毒生成轉(zhuǎn)染體系，即按目標(biāo)質(zhì)?！胮SPAX∶pMD2.G為4∶3∶1的比例在無血清培養(yǎng)基中與3 倍于質(zhì)?？傎|(zhì)量的聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）混合，室溫靜置20 min 后轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。過表達(dá)MST2 慢病毒生成轉(zhuǎn)染體系，即按目標(biāo)質(zhì)?！胮Helper 1.0∶pHelper 2.0 為4∶3∶2 的比例與吉凱轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫孵育15 min后緩慢滴加至HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)基中。分別于48 h、72 h、96 h收取病毒上清液，同時更換新鮮培養(yǎng)基，并將收取后的上清液置于4 ℃冰箱保存。使用0.45 μm 濾器過濾收集的上清液，并加入5×慢病毒濃縮液4 ℃過夜，次日超速離心濃縮病毒，使用無菌PBS 稀釋病毒沉淀后分裝為每管50 μL，-80 ℃保存。根據(jù)以上步驟可獲取敲低及過表達(dá)MST2的慢病毒毒液。

1.3.5 敲低及過表達(dá)MST2 的施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立 大鼠施萬細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS DMEM 雙抗完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至60%～70%密度時將培養(yǎng)基更換為含有敲低或過表達(dá)MST2慢病毒毒液的完全培養(yǎng)基，并使用相應(yīng)空載慢病毒毒液作為對照，同時加入Polybrene 增加病毒感染效率，使其終濃度為8 mg/L，輕輕搖勻后置于37 ℃、5% CO2的孵箱中過夜培養(yǎng)。次日更換為普通完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度生長至80%～90%時，按（1∶2）～（1∶3）傳代。將慢病毒感染后48～72 h 的細(xì)胞培養(yǎng)于含有2.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中，篩選3～5 d后，未感染慢病毒組細(xì)胞全部死亡，即可認(rèn)為感染病毒組剩下的全是穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞，并將其標(biāo)記為第一代基因干預(yù)的施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，進一步進行MST2 的敲低及過表達(dá)鑒定。

1.3.6 實時熒光定量PCR 檢測Mst2基因 使用TRIzol 法提取細(xì)胞總mRNA，并取1 μg 進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以SYBR GREEN（貨號：K21203，Abclonal）作為染料按說明書配制qPCR 反應(yīng)體系，于實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）中進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR），反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，進行40 個循環(huán)反應(yīng)，最后測定解鏈曲線。所用引物序列為Mst2Primer F，5' AGGAACAGCAACGAGA ATTGG 3'，Mst2Primer R，5' CCCCTTCACTCATCG TGCTT 3'；β-actinPrimer F，5' ATTGCTGACAGGA TGCAGAA 3'，β-actinPrimer R，5' TAGAGCCACC AATCCACACAG 3'。以β-actin作為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計算結(jié)果并進行統(tǒng)計分析。

1.3.7 蛋白印記（western blot，WB）檢測MST2 使用RIPA 蛋白裂解液（貨號：89900，美國Thermo Fisher Scientific 公司）提取細(xì)胞蛋白，測定蛋白濃度后加入loading buffer 置于100 ℃水浴10 min 使蛋白充分變性。取20 μg 蛋白進行凝膠電泳，并進行充分轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜（MST2, 1∶10000；β-actin,1∶20000）。次日使用含有吐溫20 的Tris 緩沖鹽溶液洗滌3 次，每次10 min，加入HRP 偶聯(lián)的二抗（1:3000），室溫孵育1 h，充分洗膜后于化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國GE 公司）曝光。使用Image J 軟件（美國）按照條帶灰度值進行定量分析。

1.3.8 OGD模型的建立 使用PBS潤洗細(xì)胞2次，并將培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放于提前紫外消毒過夜的無氧罐中，并在罐中置入1 顆氧氣指示劑及鈀粒。抽走其中的氣體，并充入90% N2、5% CO2和5% H2的混合氣體，重復(fù)循環(huán)3 次。使用75%乙醇溶液消毒無氧罐后放入培養(yǎng)箱中孵育5～6 h，結(jié)束后即可進行下一步實驗。

1.3.9 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential， MMP）檢測 使用檢測試劑盒（JC-1，貨號：C2006，上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司）檢測細(xì)胞MMP。MMP 較高時，JC-1 形成聚合物發(fā)出紅色熒光；反之，JC-1 為單體發(fā)出綠色熒光。按照說明書提前配制1×JC-1 染色緩沖液及1×JC-1 染色工作液。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或細(xì)胞爬片并按實驗分組對細(xì)胞進行OGD處理后，使用PBS清洗細(xì)胞2次，加入適量1×JC-1染色工作液37 ℃避光孵育20 min，結(jié)束后使用1×JC-1染色緩沖液洗滌2次，并加入適量的完全培養(yǎng)基，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組細(xì)胞取9個視野（200×），使用Image J軟件分析每張照片平均熒光強度，取平均值，聚合物熒光強度/單體熒光強度即為MMP，比值降低提示異常。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 9.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤描述。兩組之間各結(jié)果比較用兩獨立樣本t檢驗；多組間各結(jié)果比較用單因素方差分析，采用Turkey's 檢驗進行兩兩比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)Mst2的慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定本研究利用特異性引物擴增出了大小約1500 bp的目的基因條帶，與預(yù)期的大鼠Mst2基因全長序列片段大小一致（圖1 A）。將該基因條帶切膠回收并連接至GV341 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過PCR 法對重組質(zhì)粒進行鑒定，并進行DNA 凝膠電泳，結(jié)果顯示Mst2基因的特異性引物可產(chǎn)生約370 bp 的產(chǎn)物（圖1 B）。將陽性轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與預(yù)期的Mst2基因序列完全相同。

Fig.1 Construction and identification of lentiviral expression vector overexpressing Mst2圖1 過表達(dá)Mst2 的慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 A. DNA 凝膠電泳獲取大鼠Mst2基因全長序列片段，約1500 bp。B. PCR 法結(jié)合凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒，可見約370 bp的Mst2特異性基因片段。

2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株具備施萬細(xì)胞的特征 培養(yǎng)施萬細(xì)胞并構(gòu)建MST2敲低和過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過光鏡觀察施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，可見細(xì)胞生長形態(tài)為神經(jīng)元樣長梭形，貼壁生長，細(xì)胞大小及形態(tài)與未干預(yù)的施萬細(xì)胞相同。S100 作為施萬細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白，是細(xì)胞鑒定的可靠指標(biāo)。MST2 敲低及過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株可于胞質(zhì)內(nèi)正常表達(dá)S100，表明穩(wěn)轉(zhuǎn)株未受到其他細(xì)胞株污染，并保持施萬細(xì)胞的特征（圖2）。

Fig.2 Knockdown and overexpression of MST2 do not alter Schwann cell morphology圖2 敲低及過表達(dá)MST2 不改變施萬細(xì)胞形態(tài) 光鏡：Brightfield，200×；綠色熒光：S100，200×。標(biāo)尺=100 μm，n=4/組。CON，正常對照組；sh-MST2，MST2敲低組；p-MST2，MST2過表達(dá)組。

2.3 成功構(gòu)建敲低及過表達(dá)MST2 的施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株 qRT-PCR 結(jié)果表明，相對于敲低及過表達(dá)各自病毒的對照，MST2 成功被敲低及過表達(dá)（P＜0.0001），敲低效率為對照的90%以上，過表達(dá)為其對照的大約40 倍（圖3 A）。進一步進行WB 檢測，與qRT-PCR 結(jié)果一致，MST2 均成功被敲低及過表達(dá)（P＜0.0001）（圖3 C、E）。將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5 代，使用qRT-PCR及WB方法檢測基因干預(yù)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，相對于對照組，施萬細(xì)胞敲低及過表達(dá)MST2 的效果仍然顯著（P＜0.0001）（圖3 B、D、F）。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了敲低及過表達(dá)MST2的施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

Fig.3 Rat Schwann cell lines that stably knock down and overexpress MST2 were successfully constructed圖3 成功構(gòu)建敲低及過表達(dá)MST2的施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株 A～B. qRT-PCR 技術(shù)分別檢測第一代及第五代施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株Mst2 mRNA 表達(dá)水平。C～D. WB技術(shù)分別檢測第一代及第五代施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株MST2蛋白水平，β-actin作為參照。E～F. 第一代及第五代施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株MST2蛋白表達(dá)水平灰度值量化分析結(jié)果。****P＜0.0001，每組n=4。sh-NC，MST2 敲低對照組；sh-MST2，MST2 敲低組；p-NC，MST2 過表達(dá)對照組；p-MST2，MST2過表達(dá)組。

2.4 施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株在OGD 模型中穩(wěn)定表達(dá)MST2 培養(yǎng)的施萬細(xì)胞經(jīng)OGD處理6 h后，通過光鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化，可見OGD 組施萬細(xì)胞突觸消失，細(xì)胞由雙極樣轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，同時胞質(zhì)內(nèi)顆粒度增加，表明OGD 可損傷施萬細(xì)胞（圖4 A）。WB檢測發(fā)現(xiàn)，OGD 組MST2 蛋白水平增高（P＜0.05）。在Mst2基因敲低的施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，MST2 蛋白水平顯著下降（P＜0.001）；而在基因過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，MST2 蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.001）（圖4 B），表明該穩(wěn)轉(zhuǎn)株可穩(wěn)定應(yīng)用于OGD病理模型。

Fig.4 The MST2 level of the stably transfected Schwann cell lines in OGD model圖4 施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株在OGD 模型中的MST2 蛋白水平 A. OGD處理施萬細(xì)胞后形態(tài)學(xué)改變。光鏡：Bright-field，200×。B. WB 技術(shù)檢測OGD 處理6 h 后施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的MST2 蛋白表達(dá)水平，β-actin 作為參照。C. MST2 表達(dá)水平灰度值量化分析結(jié)果，*P＜0.05，***P＜0.001，每組n=4。CON，正常對照組；OGD，氧糖剝奪模型組；sh-NC，MST2 敲低對照組；sh-MST2，MST2 敲低組；p-NC，MST2過表達(dá)對照組；p-MST2，MST2過表達(dá)組。

2.5 OGD 模型中MST2 參與線粒體膜電位的調(diào)控使用JC-1探針裝載施萬細(xì)胞，以檢測MMP，在熒光顯微鏡下拍照分析。結(jié)果顯示，OGD導(dǎo)致紅綠熒光比值明顯下降，證實MMP 受損（P＜0.001）；而MST2敲低后，紅綠熒光比值顯著回升，提示逆轉(zhuǎn)了OGD導(dǎo)致的MMP 損傷（P＜0.001）。但是，與p-NC 對照組相比，過表達(dá)MST2對已受損MMP 的影響并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。上述結(jié)果表明，MST2參與施萬細(xì)胞線粒體膜電位的調(diào)控，敲低MST2 可以起保護作用。

Fig.5 MST2 participates in the regulation of mitochondrial membrane potential圖5 MST2 參與線粒體膜電位的調(diào)控 A. 使用JC-1 探針標(biāo)記線粒體膜電位。紅色熒光，多聚體（J-aggregates），200×；綠色熒光為單體（Jmonomers），200×。標(biāo)尺=100 μm。B. 紅綠平均熒光強度比值量化分析結(jié)果，*** P＜0.001，nsP＞0.05，每組n=6。CON，正常對照組；OGD，氧糖剝奪模型組；sh-NC，MST2敲低對照組；sh-MST2，MST2敲低組；p-NC，MST2過表達(dá)對照組；p-MST2，MST2過表達(dá)組。

3 討論

本研究構(gòu)建重組質(zhì)粒，并使用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)成功構(gòu)建穩(wěn)定敲低及過表達(dá)MST2的大鼠施萬細(xì)胞株；將該細(xì)胞株應(yīng)用在OGD 模型中，敲低MST2 可改善線粒體膜電位，提示其對線粒體具有保護作用。

對比其他研究應(yīng)用的小干擾RNA 敲低或普通質(zhì)粒載體過表達(dá)目的基因的方法，慢病毒能將外源基因整合至宿主細(xì)胞，從而在細(xì)胞中穩(wěn)定長期表達(dá)，且不會產(chǎn)生化學(xué)轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞損傷。同時，在過表達(dá)基因中加入標(biāo)簽序列，可使用高濃度且價格優(yōu)惠的標(biāo)簽抗體進行實驗，提高檢測的陽性率[12-15]。目前，慢病毒實驗系統(tǒng)已廣泛用于分子實驗的研究中。由于感染慢病毒的細(xì)胞在未使用相應(yīng)抗生素時，有逐漸被正常細(xì)胞取代而丟失基因干預(yù)效果的可能性，故本研究采用了合適濃度的嘌呤霉素維持篩選流程，并在感染慢病毒第一代及第五代的施萬細(xì)胞中，從mRNA 及蛋白水平雙重驗證了基因干預(yù)MST2 的穩(wěn)定性。值得注意的是，WB 技術(shù)檢測過表達(dá)MST2 的穩(wěn)轉(zhuǎn)株可見MST2 雙條帶，這與添加了蛋白標(biāo)簽的外源性MST2 有關(guān)。S100在神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于施萬細(xì)胞，可作為細(xì)胞鑒定的特異性指標(biāo)[16]。本研究通過S100 免疫熒光證明了MST2敲低及過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株仍保持施萬細(xì)胞的特征。

在成功構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的基礎(chǔ)上，本研究對施萬細(xì)胞進行OGD 處理。OGD 是研究線粒體穩(wěn)態(tài)方向較為理想的細(xì)胞模型，可模擬體內(nèi)因缺血缺氧引起的神經(jīng)損傷。多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究以O(shè)GD 作為細(xì)胞模型可一定程度上模擬體內(nèi)環(huán)境，如腦血管疾病、神經(jīng)壓迫性損傷等[11,17]。本研究結(jié)果證實，OGD可以損傷施萬細(xì)胞。在OGD 處理的施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，基因敲低組MST2蛋白水平顯著下降，而基因過表達(dá)組MST2 蛋白水平顯著上調(diào)，表明基因干預(yù)MST2的效果仍然穩(wěn)固。

利用施萬細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株這一工具細(xì)胞建立OGD模型，本研究進一步進行線粒體功能指標(biāo)檢測，初步探討MST2對于線粒體的作用。線粒體是細(xì)胞能量來源的核心，參與細(xì)胞代謝、鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡調(diào)控及脂質(zhì)合成等過程[18]。正常的MMP 是線粒體氧化磷酸化穩(wěn)態(tài)的重要前提，MMP 的丟失可導(dǎo)致電子從線粒體呼吸鏈外溢，引起活性氧大量生成[19]。因此，MMP是反映線粒體功能的可靠指標(biāo)之一[19]。既往關(guān)于MST2 在線粒體功能上的研究結(jié)論尚不一致，與細(xì)胞類型不同有關(guān)。在脂肪細(xì)胞中，MST2 可過度激活線粒體自噬，導(dǎo)致線粒體丟失和功能障礙[20]；但在巨噬細(xì)胞中，MST2 可募集至受損線粒體，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白的穩(wěn)定性而減輕細(xì)胞內(nèi)過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)[21]。在本研究的施萬細(xì)胞中，MST2 參與MMP 的調(diào)控，敲低MST2 可以改善OGD 誘導(dǎo)的MMP損傷，提示具有保護線粒體作用。但在過表達(dá)MST2 的施萬細(xì)胞中，MMP 沒有明顯改變，推測OGD條件下MMP已明顯受損，進一步上調(diào)MST2 并不能帶來顯著改變；此外，在OGD 條件下，MST2的功能可能已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，上調(diào)MST2并不能增加其發(fā)揮功能的效果。以往研究表明，MST2 在自噬及線粒體自噬中發(fā)揮重要作用[10,20,22-24]。本課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)，敲低MST2同源類似物可改善線粒體自噬、減少氧化應(yīng)激，并保護線粒體功能[11]。故推測MST2 調(diào)控施萬細(xì)胞MMP 的作用可能與自噬或線粒體自噬有關(guān)，這仍需進一步實驗驗證。

綜上，本研究成功構(gòu)建穩(wěn)定敲低及過表達(dá)MST2 的大鼠施萬細(xì)胞株，并對其在調(diào)控線粒體膜電位方面進行了初步研究。未來研究將利用成功構(gòu)建的細(xì)胞株進一步探究MST2在線粒體功能及神經(jīng)病理性疼痛等疾病模型中的作用。