趙欣華，張東旭，高獻敏，于文慧，張美君，趙 鋼

糖尿病是一種臨床常見的慢性、代謝性疾病，常使多器官功能受損，導(dǎo)致多種并發(fā)癥，糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer, DFU）是臨床中最常見的并發(fā)癥[1]。DFU 常因患者局部缺血、神經(jīng)病變、感染等因素，由外傷、壓力性損傷等誘發(fā)，出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)遠端皮膚及深部組織的潰爛。DFU 具有經(jīng)久不愈，愈后易復(fù)發(fā)，較高致殘率的特點，給患者生理及心理帶來極大的負擔(dān)，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，故對于DFU 的治療至關(guān)重要。目前，對于DFU 的研究已逐漸步入基因?qū)用?，越來越多的研究表明，非編碼小RNA （microribonucleic acid，miRNA）在DFU 皮膚中異常表達，并參與了DFU 的發(fā)生發(fā)展，對于miRNA 的調(diào)控可能成為DFU 治療的關(guān)鍵。本文通過miRNA 在DFU 炎癥期中的作用機制，以及中醫(yī)藥通過調(diào)控miRNA 治療DFU 研究進展的綜述，以期為中醫(yī)藥治療DFU 提供基因?qū)用娴睦碚撝С帧?/p>

1 miRNA 的發(fā)生機制

miRNA 即microRNA，又稱微小核糖核酸。其為內(nèi)源性長度為20～24 nt 的非編碼單鏈RNA 分子，存在于真核生物體內(nèi)。在細胞核內(nèi)存在的miRNA 的前體（pri-miRNA)可被加工成莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體miRNA (pre-miRNA)，經(jīng)過轉(zhuǎn)運，premiRNA 由細胞核移動到細胞質(zhì)，在這里被加工成miRNA，而人類近1/3 的基因都受這些miRNA 調(diào)控[2-3]。miRNA 在GW182 功能蛋白的調(diào)控下抑制靶向目標mRNA 的翻譯過程，破壞mRNA 的自身穩(wěn)定性，進而負調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達水平，即miRNA 在細胞質(zhì)中對基因表達進行負調(diào)控[4-5]。細胞質(zhì)內(nèi)的miRNA 還可以通過以下多種途徑調(diào)控生命活動，包括：直接參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程、靶向線粒體基因、與多種功能蛋白結(jié)合及促進靶向mRNA 表達作用[2]。

2 miRNA 在糖尿病足潰瘍炎癥期的作用機制

DFU 患者創(chuàng)面的愈合是一個由多種細胞及組織因子參與的復(fù)雜的生理過程，主要包括炎癥期、增殖期與重塑期3 個時期，3 個時期相輔相成，任何一個愈合過程反應(yīng)不及或過度都有可能造成愈合創(chuàng)面的再度損傷[6]。創(chuàng)面最先進入的時期為炎癥反應(yīng)期，這一時期對于創(chuàng)面愈合起重要作用。炎癥反應(yīng)期發(fā)揮作用的主要有兩種因子：抗炎因子和促炎因子。促炎因子的分泌加速了炎癥過程，而抗炎因子則可減緩炎癥的發(fā)生。兩類炎癥因子處于相對平衡狀態(tài)，才有利于創(chuàng)面的修復(fù)。若促炎因子生成過多，則會導(dǎo)致創(chuàng)面遷延不愈，從而形成慢性潰瘍[7]。若抗炎因子生成過多，同樣對于創(chuàng)面愈合不利。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在愈合過程的炎癥期發(fā)揮了重要作用。DFU 后巨噬細胞被激活，M1 型巨噬細胞可促使大量促炎因子生成，M2 型巨噬細胞則可促使抗炎因子表達，miRNA 靶向多種轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控巨噬細胞的極化，從而調(diào)節(jié)炎癥過程。

2.1 miRNA -155 miRNA -155 作為多功能miRNA，參與了多種生物學(xué)過程，且與炎癥密切相關(guān)。Cai 等[8]研究表明，miRNA-155 能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化狀態(tài)，在巨噬細胞由抗炎型M2 型向促炎型M1 型極化時高表達，而在M1 型向M2 型極化時低表達。同樣的，Li 等[9]研究也表明，miRNA-155 的缺乏可導(dǎo)致巨噬細胞的M1-M2 極化。有團隊研究表明，miRNA-155 通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-β、SHIP1 和IL13Rα1 促進M1 巨噬細胞的極化[10]。而Jin 等[11]研究表明，miRNA-155 的過表達直接促進了促炎細胞因子腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-1β 的產(chǎn)生，加重了炎癥狀態(tài)。譚仕廉等[12]研究發(fā)現(xiàn)也同樣佐證了這一結(jié)論，miRNA-155 可通過靶向抑制SOCS1 蛋白表達，促進LPS 所致的THP-1 巨噬細胞的激活，釋放炎性細胞因子TNF-α及IL-8，從而促進炎癥反應(yīng)。而TNF-α 作為被激活的巨噬細胞最先產(chǎn)生的細胞因子，又會誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 等細胞因子的分泌，從而產(chǎn)生連續(xù)反應(yīng)，更大程度加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]。細胞實驗表明miRNA-155 可通過靶向IL-13 受體α1的表達水平，介導(dǎo)STAT6 的激活減弱，從而抑制M2型巨噬細胞生成，加速炎癥反應(yīng)的進程；此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)miRNA-155 對IL-13 依賴性調(diào)節(jié)的巨噬細胞M2/pro-Th2 表型建立相關(guān)基因（SOCS1、DC-SIGN、CCL18、CD23 和SERPINE）的影響，可能也是其抑制巨噬細胞向M2 型極化的重要機制[14]。

2.2 miRNA-9 miRNA-9 是一種富集在腦內(nèi)的miRNA，既往研究多集中在其對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，而miRNA-9 在炎癥過程中也發(fā)揮了重要作用。miRNA-9 可通過調(diào)節(jié)核因子（NF）-κB 水平，抑制巨噬細胞釋放炎性細胞因子。NF-κB 是一種異聚轉(zhuǎn)錄因子,可通過介導(dǎo)激活促炎因子，從而調(diào)控TNFα、IL-1β 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等的生成[15]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA-9 過表達可減少RAW 264.7細胞釋放炎性因子TNF-α 和IL-1β，促進PPARs活化，調(diào)控M1/M2 極化狀態(tài)，降低炎性反應(yīng)狀態(tài)[16]。吳曉玲等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-9 可下調(diào)PPARδ 的表達，減少抗炎轉(zhuǎn)錄因子BCL-6 的生成，從而促進巨噬細胞M1 極化。細胞實驗表明，在OGD 模型中NF-κB、TNF-α、IL-1β 和iNOS 等炎性因子均處于高表達狀態(tài)，而將miRNA-9 轉(zhuǎn)染入細胞后，上述炎性因子表達降低，提示miRNA-9 可抑制上述炎性因子的表達[18]。同樣的，Bazzoni 等[19]及Qian 等[20]研究也證實miRNA-9 可通過抑制NF-κB下調(diào)TNF-α 和IL-1β 的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)。這些研究提示miRNA-9 可能是通過作用于關(guān)鍵靶點NF-κB 來治療DFU。

2.3 miRNA-146a 多項研究結(jié)果表明miRNA-146a 在炎癥反應(yīng)過程中起重要的調(diào)控作用[16-18]。細胞實驗表明，miRNA-146a 可通過抑制IRAK1 和TRAF6 表達，降低JNK 磷酸化水平，減少巨噬細胞M1 型極化，抑制TNF-α、IL-1β 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的生成，從而降低炎癥反應(yīng)[19]。Qian等[20]研究證實了miRNA-146a 可通過下調(diào)Notch1的表達使M1 型巨噬細胞的激活被抑制，還可以提高PPARγ 的表達增強M2 巨噬細胞的活化，以此發(fā)揮抗炎作用。miRNA-146a 還能夠直接抑制炎性因子在細胞中的表達，從而顯著降低炎癥反應(yīng)水平。研究表明，miRNA-146a 能夠直接抑制細胞中多種白細胞介素因子的表達，包括IL-6、8、17、13、1β等，從而直接抑制細胞炎癥反應(yīng)[21-22]。miRNA-146a還能夠通過TLR 途徑負反饋調(diào)節(jié)促炎性細胞因子的表達，從而抑制侵襲性炎癥的產(chǎn)生，阻止炎癥進展[23]。動物實驗表明，隨著大鼠體內(nèi)miRNA-146a 的分泌不斷增多，細胞因子IL-6、MCP-1 及TNF-α 的分泌明顯被抑制[24]。細胞實驗則證實，miRNA-146a的過表達直接抑制Nox4 的分泌，減少ROS 的產(chǎn)生從而降低氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥的發(fā)生[25]。這些研究都表明miRNA-146a 能夠通過多條途徑負向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，提示miRNA-146a 具有治療DFU 的重大潛力。

上述研究表明，miRNA 在DFU 炎癥期的異常表達發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，這為炎癥期DFU 的治療提供了重要參考。miRNA 通過多種途徑調(diào)控巨噬細胞表型，平衡促炎因子與抗炎因子在創(chuàng)面的表達，從而減輕創(chuàng)面炎癥狀態(tài)，避免過度炎癥反應(yīng)，保護創(chuàng)面，促使創(chuàng)面順利進入下一修復(fù)期。

3 中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)miRNA 干預(yù)糖尿病足潰瘍

中醫(yī)藥治療DFU 的療效顯著、歷史悠久，治療疾病具有多層次、全方位、多靶點共同作用的特點。近年來，大量研究結(jié)果表明，中藥單體提取物、中藥組成成分及中藥復(fù)方均能夠通過調(diào)控miRNA 來影響DFU 進程。

3.1 中藥單體及提取物 中藥單體及提取物是從單味中藥中提取的有效化學(xué)成分，由現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)融合而成。相較于中藥復(fù)方，其成分單一、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，便于進行安全性及有效性評價。研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷、黃芪總皂苷、人參皂苷、葛根素、龍血素、山奈酚、黃芩苷等多種中藥單體及提取物可通過調(diào)節(jié)miRNA 治療DFU。

五加科植物三七具有化瘀止血、活血定痛功效，豆科植物黃芪具有健脾補中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌等多重功效，二者的提取物三七總皂苷及黃芪總皂苷能夠通過上調(diào)miRNA-146a的表達,活化IRAKl 和TRAF6，抑制TLR 信號通路，降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生，改善創(chuàng)面微循環(huán)，從而加速創(chuàng)面修復(fù)[26]。這與此前論述一致[23]，此外動物實驗還表明，三七花總皂苷水凝膠能夠促進肉芽組織的形成，增強對炎性滲出物的吸收，從而加速大鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)[27]。Xue 等[28]研究表明，人參提取物人參皂苷Rg1 通過miRNA-2113/RP11-982M15.8/Zeb1 通路調(diào)控降低高糖誘導(dǎo)的間充質(zhì)活化和組織纖維化。人參皂苷Rg1 還可通過抑制miRNA-489e3p 的表達，負調(diào)控Sirt1，激活PI3K/AKT/eNOS 信號，增強eNOS 和iNOS 的表達，促進NO 的產(chǎn)生和血管生成，加速傷口愈合[29]。Xu 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，豆科植物葛根主要成分葛根素通過上調(diào)miRNA-145-5p 表達水平，抑制TLR4/MyD88/NF-κB（p65）通路的激活，降低多種炎性因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等的表達，從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，促進創(chuàng)面愈合。血竭作為血管外科常用中藥，能夠活血定痛，化瘀止血，生肌斂瘡，主要成分龍血素A 抑制miRNA-339-5p的表達，增加了同源異形盒基因5 的表達，從而激活了Wnt 信號通路，促進細胞增殖與分化，從而修復(fù)創(chuàng)面[31]。當(dāng)歸補血復(fù)合微囊由當(dāng)歸主要成分阿魏酸及黃芪主要成分黃芪甲苷復(fù)合而成，體外實驗結(jié)果表明，20 μg/mL 當(dāng)歸補血復(fù)合微囊能夠上調(diào)miRNA-21 的表達，通過JAK2/STAT3 信號通路促進血管生成，加速創(chuàng)面愈合[32]。姜科植物姜黃具有破血、行氣止痛的作用，其主要成分姜黃素具有抗炎、抗氧化及抗癌多種作用。Qiu 等[33]研究結(jié)果表明，姜黃素能夠上調(diào)miRNA-143 和miRNA-124 的水平，降低靶基因NF-κB、ROCK1 及因子TLR9 的分泌，以此降低炎癥水平。中藥肉桂的提取物桂皮醛能夠顯著抑制TLR4、NO、MMP-13 等炎性因子的分泌，當(dāng)其與miRNA-146a 模擬劑聯(lián)合使用時，其抑制效果更為顯著，而當(dāng)其與miRNA-146a 抑制劑聯(lián)合使用時，抗炎作用明顯降低，這提示桂皮醛可能通過協(xié)同miRNA-146a 發(fā)揮抗炎作用[34]。毛茛科植物芍藥提取物芍藥內(nèi)酯苷能夠促進miRNA-149-5p 的表達，從而抑制WISP1 表達，減低IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平，抑制細胞凋亡，改善創(chuàng)面環(huán)境[35]。連翹及山奈提取物山奈酚屬于黃酮類化合物，其通過上調(diào)miRNA-130a 調(diào)控STAT3 水平，降低細胞內(nèi)炎性因子的分泌，抑制細胞凋亡[36]。同屬于黃酮類化合物的黃芩苷，主要來源于中藥黃芩，細胞實驗表明，黃芩苷能夠促進IL-1β 處理過的細胞中miRNA-766-3p 的表達，并且抑制細胞凋亡，促進ECM 的合成[37]，這可能加速了創(chuàng)面的愈合。

3.2 中藥復(fù)方 中藥復(fù)方是包含兩種或兩種以上藥物的方劑，依據(jù)君臣佐使的組方原則，針對某一證型的疾病進行配伍使用。中藥復(fù)方是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的精髓，通過多種藥物的配伍使用，有著同病異治、異病同治的功效，多種藥物通過聯(lián)合應(yīng)用，既可以增強藥效，又能夠減輕藥物不良反應(yīng)，有著良好的治療效果。相比于中藥單體及提取物，中藥復(fù)方成分復(fù)雜，研究難度較高，通過調(diào)節(jié)miRNA 來治療DFU 的中藥復(fù)方主要有生肌玉紅膏、回陽生肌方和紫朱軟膏。

生肌玉紅膏是治療創(chuàng)面的常用方劑，主要成分是白芷、甘草、歸身等，有活血祛腐、解毒生肌的功效。體外實驗表明，生肌玉紅膠原可以通過調(diào)控脂肪干細胞來促進miRNA-21 的表達，并且這種表達呈劑量依賴性，高表達的miRNA-21 可能促進下游p-p38 蛋白表達的增加，從而促進血管新生，加速血液流通及創(chuàng)面愈合[38]?；仃柹》接扇藚?5 g，鹿茸15 g，雄黃1.5 g，乳香30 g，琥珀7.5 g 及京紅粉3 g組成，功能主治為回陽生肌,止痛收斂。高通量測序分析顯示，回陽生肌方應(yīng)用于創(chuàng)面的LncRNA 及mRNA 可能通過調(diào)節(jié)PPAR、局灶性黏附及內(nèi)吞作用等信號通路參與創(chuàng)面愈合的調(diào)控[39]。紫朱軟膏是臨床治療DFU 的常用方劑，是在奚九一先生“煨膿長肉膏”方義上化裁而來，包含朱砂、紫草、冰片、黃芪、龍血竭及阿膠六味中藥。李文惠等[40]應(yīng)用高通量測序方法分析發(fā)現(xiàn)，DFU 大鼠在紫朱軟膏治療前后，存在122 種miRNAs 差異表達，用藥后下調(diào)差異顯著性最大的5 種為miR-379-3p、miR-496-3p、miR-434-5p、miR-411-5p、miR-122-5p，上調(diào)差異顯著性最大的5 種為miR-1b、miR-1-3p、miR-133b-3p、miR-133a-3p、miR-133a-5p，這一研究結(jié)果為紫朱軟膏干預(yù)糖尿病潰瘍的治療提出了基因?qū)用嫔系目赡芡緩健?/p>

4 結(jié)語

據(jù)統(tǒng)計，約有1/4 的糖尿病患者最終發(fā)展為DFU[41]。較高的發(fā)病風(fēng)險及發(fā)病率嚴重影響了個人、家庭及社會。早期的預(yù)防、診斷與治療能夠大大改善DFU 患者的癥狀，降低發(fā)病率及截肢率。近年來，隨著基因組學(xué)的深入發(fā)展，miRNA 參與調(diào)控DFU取得了較大進展。本文分別探討了miRNA-155、miRNA-9 及miRNA-146a 三種常見的miRNA 在DFU 炎癥期的作用機制，以及多種中藥單體及提取物、中藥復(fù)方通過上調(diào)或下調(diào)不同miRNA 來實現(xiàn)對DFU 的有效干預(yù)，從而達到治療目的。這些研究為中醫(yī)藥治療DFU 提供了基因?qū)用娴睦碚撘罁?jù)，雖然中醫(yī)藥通過調(diào)控miRNA 治療DFU 的療效肯定，但由于其多成分、多靶點的作用特點，治療機制并未完全清晰，尤其是中藥復(fù)方的相關(guān)研究較少，研究層面不夠深入，且僅有少數(shù)miRNA 應(yīng)用于臨床。未來期冀科研工作者們運用更多新技術(shù)，繼續(xù)探索中藥單體及復(fù)方，為中醫(yī)藥調(diào)控miRNA 應(yīng)用于臨床治療提供更多方案。