婁邵升, 歐陽云珊, 曹玲玲, 林 晨

(新疆醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院病理學教研室, 2研究生學院, 烏魯木齊 830017)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內,宮頸癌的防治負擔仍很重,在發(fā)展中國家,宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍遠高于世界衛(wèi)生組織提出的“加速消除宮頸癌全球戰(zhàn)略”所設定的臨界值[1]。有研究預測,到2030年中國宮頸癌的發(fā)病率和死亡率都將上升[2]。因此,闡明宮頸癌進展的分子機制,尋找有效的治療靶點具有重要意義。外泌體是一類微小的細胞外囊泡,能夠通過胞吐作用將所攜帶的與源細胞相似的核酸、蛋白質、脂質和其他生物活性物質[3]釋放到細胞外微環(huán)境,導致受體細胞活性或功能發(fā)生變化[4]。研究表明,外泌體中豐富的miRNA在惡性腫瘤的形成、進展中發(fā)揮關鍵作用[5]。閉鎖小帶蛋白(TJP1)是閉合帶蛋白家族的成員,與細胞間的緊密連接功能相關[6],參與調節(jié)細胞旁通透性[7]。研究表明,癌源性外泌體miRNA可通過靶向TJP1來增加血管通透性,促進癌癥轉移[8]。前期研究表明,宮頸癌患者和正常女性陰道灌洗液提取的外泌體中的miRNA表達存在差異,其中miR-191-5p差異較顯著[9]。通過文獻資料發(fā)現(xiàn),miR-191-5p與TJP1存在靶向關系[10]。因此本研究旨在探究miR-191-5p通過靶向TJP1調控血管內皮細胞層通透性促進宮頸癌轉移的分子機制,為宮頸癌發(fā)生轉移提供理論依據(jù),也為尋找潛在的治療靶基因提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞人宮頸癌細胞系SiHa(貨號:CL-0210)和HeLa(貨號:CL-0101)購自普諾賽生命科技有限公司;人臍靜脈內皮細胞系HUVEC(貨號:iCell-h110)和人胚腎細胞系(貨號:293T)購自賽百慷生物技術股份有限公司。

1.2 試劑與儀器胎牛血清(FBS)(貨號:A5669701)、蛋白酶-EDTA溶液(貨號:25200114)、高糖培養(yǎng)基(DMEM)(貨號:11965118)、羅丹明鬼筆環(huán)肽(Rhodanmine phalloidin)(貨號:R415)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;內皮細胞培養(yǎng)基(ECM)(賽百慷生物,貨號:PriMed-iCell-002);無外泌體FBS(優(yōu)寧維生物,貨號:abs993);外泌體標志蛋白Alix(貨號:ab186728)、CD9一抗(貨號:ab109201)、TJP1一抗(貨號:ab276131)、GAPDH一抗(貨號:ab8245)、二抗(貨號:ab6702)均購自英國Abcam公司;RNA定量(貨號:RR047A、RR820A)、miRNA定量(貨號:638315、638316)購自日本TaKaRa公司;伊文思藍(美國MCE公司,貨號:HY-B1102);特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(貨號:P0018AM)、結晶紫染液(貨號:C0121)、Lipo8000TM轉染試劑(貨號:C0533-1.5 mL)均購自碧云天生物技術有限公司;DAPI熒光染料(貨號:ID2250)、牛血清白蛋白(貨號:A8020)、20×TBST (貨號:T1082)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:PC0020)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(貨號:P1200)均購自索萊寶科技有限公司;miRNA提取試劑盒(全式金生物,貨號:ER601);PKH67綠色熒光細胞連接試劑盒(德國sigma公司,貨號:MINI67-1KT);QuikChange定點突變試劑盒(英國Agilent公司,貨號:200515);mimics NC(貨號:miR01 102-1-5)、miR-191-5p mimics(貨號:miR2C M001)、inhibitor NC(貨號:miR02 102-1-5)、miR-191-5p inhibitor(貨號:miR1C M001)購自銳博生物有限公司;pCMV-NC(貨號:NJ0101343-3-BSND)、pCMV-TJP1質粒(貨號:NJ010134-4-BSND)購自擎科生物科技有限公司。常規(guī)細胞培養(yǎng)箱(Eppendorf公司,型號:Galaxy 170R);超凈工作臺(德國Hereaus公司,型號:KS-18);高速臺式冷凍離心機(湘儀實驗室儀器開發(fā),型號:CHT210R);超速離心機(日本日立公司,型號:CP100NX);透射電鏡(美國Phillips公司,型號:CM20);激光共聚焦顯微鏡(型號:Nikon C2)、倒置顯微鏡(型號:TI-DH 611624)均購自日本Nikon公司;酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:Multiskan GO);垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司,型號:1658001);蛋白質印跡儀(美國Bio-Rad公司,型號:Gel Doc XR);細胞電阻儀(美國Millipore公司,型號:Millicell ERS-2); 實時熒光定量 PCR 儀器(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:Applied Biosystems);雙熒光素酶報告分析儀(美國Promega公司,型號:GloMax);搖床(北京蘭杰柯科技,型號:L-RSK);渦旋混合儀(蘇州捷美電子,型號:VM-02U);迷你離心機(群安實驗儀器,型號:MC-4K)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) SiHa、HeLa、293T細胞在含有10%熱滅活FBS、1%雙抗(鏈霉素+青霉素)的DMEM中培養(yǎng)。HUVEC在含有10%熱滅活FBS、1%雙抗的ECM中培養(yǎng)。

1.3.2 外泌體提取 將SiHa/HeLa細胞用上述培養(yǎng)基培養(yǎng),當細胞生長至70%時,PBS清洗3次,改用含有10%無外泌體FBS的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h至細胞完全長滿,取上清,常溫,500 r/min離心10 min, 去除脫落細胞。取上清, 常溫, 2 500 r/min離心15 min,去除細胞碎片。取上清,4℃,11 000 r/min離心35 min,去除凋亡小體。取上清,4℃,100 000 r/min離心95 min。去除上清,得到的沉淀物為含雜質的外泌體。將上述沉淀物,用PBS重懸,4℃,100 000 r/min離心95 min,去除上清,將得到的沉淀用適量的PBS溶液重懸,即為外泌體懸液。隨后分裝轉移至無RNA酶的EP管中,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 透射電鏡 取15 μL外泌體懸液滴于封口膜表面,夾取聚醋酸甲基乙烯酯-碳(Formvar-carbon)載樣銅網(wǎng)(400 目),將銅網(wǎng)膜面朝下放在懸液上輕輕蘸取,吸收20 min。網(wǎng)格用1%戊二醛后固定5 min,PBS漂洗2次,磷鎢酸染色5 min,PBS漂洗2次。待網(wǎng)格風干后,使用透射電鏡在 80 kV下拍攝顯微圖像。

1.3.4 蛋白質印跡實驗(Western blot) 使用BCA蛋白質測定試劑盒制備蛋白質樣品。聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離總蛋白(30 μg),隨后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用1×TBST 洗滌后,用5%牛奶封閉2 h,用1×TBST洗滌后,加入一抗,4℃,孵育10 h。第二天用1×TBST洗滌后,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,孵育1.5 h,用1×TBST洗滌后,使用增強化學發(fā)光試劑檢測蛋白質。

1.3.5 外泌體攝取測定 按照操作說明書用PKH67綠色熒光細胞連接試劑盒標記外泌體。100 μL PBS中重懸20 μg外泌體,并添加至1×105個HUVEC中。共培養(yǎng)24 h后,用Rhodanmine Phalloidin對HUVEC中的細胞骨架進行染色,用DAPI熒光染料對HUVEC中細胞核進行染色,在共聚焦顯微鏡下觀察典型的外泌體攝取情況。

1.3.6 跨內皮電阻(TEER)測定 將HUVEC常規(guī)消化、計數(shù),取1×105個HUVEC接種于Transwell小室上室,待細胞貼壁,分別在上室加入等體積PBS、40 μg S-exo、40 μg H-exo,并分為PBS組、S-exo組、H-exo組。每24 h使用細胞電阻儀測量一次TEER并記錄數(shù)值,直至測到TEER達到最大值后一天,最大值當天即認為HUVEC單層細胞形成。

1.3.7 HUVEC轉染 配置20 pmol/μL的轉染劑。提前將1×105個HUVEC細胞/孔,鋪入6孔板中。細胞貼壁后,對6孔板進行常規(guī)換液,PBS清洗2次。配置轉染工作液:ECM(125 μL)+SiRNA(5 μL)+lipo 8000(5 μL),混勻,室溫孵育20 min。取125 μL轉染工作液與1 875 μL的5% FBS,ECM培養(yǎng)液混勻,并分為PBS組、mimics NC組、miR-191-5p mimics組、inhibitor NC組、miR-191-5p inhibitor組,將混勻的培養(yǎng)液加入6孔板中,培養(yǎng)48 h。

1.3.8 內皮細胞層通透性測定 將HUVEC常規(guī)消化,計數(shù),取1×105個HUVEC接種于Transwell小室上室,待細胞貼壁,加入外泌體后,分為PBS組、S-exo組、H-exo組。轉染后,分為PBS組、mimics NC組、miR-191-5p mimics組、inhibitor NC組、miR-191-5p inhibitor組。根據(jù)TEER測定結果得出的培養(yǎng)條件,繼續(xù)培養(yǎng)細胞,待單層細胞屏障形成時,取出Transwell小室,PBS清洗2次,置于新的24孔板中,下室加入600 μL的4%牛血清白蛋白(BSA)溶液,上室加入100 μL的伊文思藍-血清白蛋白(EB-BSA)(0.67 mg/mL)工作液,并保持上、下室液面的高度一致,于細胞培養(yǎng)箱中平衡1 h。取出Transwell小室,將下室液體置于1.5 mL的EP管中,1 000 r/min離心5 min,取200 μL加入96孔板。另將EB-BSA工作液(初始濃度為0.67 mg/mL)倍比稀釋,分別取200 μL加入96孔板,使用多功能酶標儀在620 nm處測量光密度值(OD)并制作標準曲線。根據(jù)標準曲線計算Transwell下室液體中EB-BSA濃度,EB-BSA濃度提示單層內皮細胞的通透性。其濃度越大,說明HUVEC細胞層通透性越大。

1.3.9 內皮細胞層穿透實驗 將HUVEC常規(guī)消化,計數(shù),取1×105個HUVEC接種于Transwell小室上室,轉染后,分為Control組、PBS組、mimics NC組、miR-191-5p mimics組、inhibitor NC組、miR-191-5p inhibitor組。其中Control組表示只有HUVEC細胞層,上層不添加宮頸癌細胞,排除HUVEC遷移至下室的干擾。根據(jù)TEER測定結果得出的培養(yǎng)條件,繼續(xù)培養(yǎng)細胞,待單層細胞形成時,加入1×105個宮頸癌細胞,下室更換為低FBS完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,收獲上室,用棉簽小心拭去上室細胞,用4%多聚甲醛固定15 min,結晶紫染色液孵育15 min,PBS漂洗,風干后,倒置顯微鏡下觀察,根據(jù)三個獨立實驗計算每個高倍視野的遷移細胞。

1.3.10 實時熒光定量(qRT-PCR)分析 使用試劑盒從細胞和外泌體樣本中提取總RNA。U6作為miRNA的內參,GAPDH作為mRNA的內參,引物序列詳見表1。RQ=2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

表1 序列引物設計

1.3.11 雙熒光素酶報告基因實驗 將TJP1基因的非翻譯區(qū)(3′UTR)片段通過PCR擴增并插入載體中。使用定點突變試劑盒生成破壞TJP1的3′UTR區(qū)域miR-191-5p結合位點的突變構建體。使用Lipo8000TM將TJP1-wt或TJP1-mut質粒與miR-191-5p mimics或mimics NC共轉染至細胞中。將使用TJP1-wt質粒的組作為野生組,使用TJP1-mut質粒的組作為突變組,使用pmirGLO質粒的組作為對照組,mimics NC作為組內對照。轉染48 h后,通過雙熒光素酶報告分析儀分析熒光素酶活性。

1.3.12 恢復實驗 如前所述對HUVEC進行轉染,分為mimics NC組、miR-191-5p mimics組、pCMV-NC組、pCMV-TJP1組和pCMV-TJP1+miR-191-5p mimics(pCMV-T+mimics)組,轉染48 h后,檢測各組TJP1的表達情況。

2 結果

2.1 外泌體的鑒定和攝取透射電鏡下觀察到所提取的微小囊泡呈杯狀,有明顯雙層膜結構,大小在100 nm左右,符合外泌體的典型特征,見圖1A。Western blot實驗結果顯示,外泌體標志蛋白Alix、CD9呈陽性,而腫瘤細胞不表達,見圖1B。將提取的外泌體與HUVEC共培養(yǎng)后,HUVEC中存在PKH67標記的外泌體,證實宮頸癌源外泌體可被HUVEC攝取,見圖1C。

注： A, 外泌體透射電子顯微鏡下的代表圖(比例尺= 100 nm); B, 外泌體Western blot鑒定結果圖; C, 外泌體攝取測定結果圖,DAPI標記的細胞核呈藍色熒光,Rhodanmine Phalloidin標記的細胞骨架呈紅色熒光,PKH67標記的外泌體呈綠色熒光。S-exo、H-exo代表由SiHa、 HeLa培養(yǎng)上清液提取的外泌體; S、H代表細胞裂解物,用作對照。

2.2 宮頸癌源外泌體對HUVEC細胞層通透性的影響TEER隨時間增加而增大,在培養(yǎng)3 d時細胞形成單層,TEER達到最大值,見表2。根據(jù)TEER的結果,本研究選用培養(yǎng)3 d的HUVEC細胞進行內皮細胞層通透性實驗。結果顯示,與PBS組比較,S-exo組和H-exo組的EB-BSA濃度增大,即在宮頸癌源性外泌體的作用下,HUVEC細胞層通透性增大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1),見圖2。

注: 與PBS組比較, ****P<0.000 1。

表2 各組平均電阻值比較

2.3 miR-191-5p富集情況及靶向TJP1作用qRT-PCR實驗結果顯示,miR-191-5p在宮頸癌源外泌體中富集,并被轉運至HUVEC細胞中,見圖3A。雙熒光素酶報告基因實驗顯示,野生組TJP1可與miR-191-5p結合,而突變組TJP1不能與之結合,miR-191-5p mimics顯著降低了野生組TJP1的熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。但對突變組TJP1熒光素酶活性無影響,見圖3B。因此,miR-191-5p靶向TJP1。

注: A, miR-191-5p的qRT-PCR分析結果圖; B, 雙熒光素酶報告基因實驗結果圖; **P<0.01, ***P<0.001。

2.4 轉染后各組miR-191-5p、TJP1表達情況及HUVEC細胞層通透性結果qRT-PCR和Western blot結果顯示,與PBS組比較,miR-191-5p mimics組的miR-191-5p相對表達水平升高,TJP1的相對表達水平下降,而miR-191-5p inhibitor組的miR-191-5p相對表達水平下降,TJP1的相對表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖4A-C。證實了miR-191-5p靶向TJP1使其表達水平降低。內皮細胞層通透性實驗結果顯示,與PBS組比較,miR-191-5p mimics組通透性增加,而miR-191-5p inhibitor組通透性減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1),見圖4D。

注：A,miR-191-5p的qRT-PCR分析結果圖;B,TJP1的qRT-PCR分析結果圖;C,Western blot 結果圖,GAPDH作內參;D,HUVEC層通透性結果圖;與PBS組比較, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1。

2.5 各組內皮細胞層穿透實驗結果比較內皮細胞層穿透實驗結果顯示,在SiHa細胞中,與PBS組比較,miR-191-5p mimics組穿透的平均細胞數(shù)增加,miR-191-5p inhibitor組穿透的平均細胞數(shù)下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在HeLa細胞中,與PBS組比較,miR-191-5p mimics組穿透的平均細胞數(shù)增加,miR-191-5p inhibitor組穿透的平均細胞數(shù)下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5。

注: 與PBS組比較, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1。

2.6 各組恢復實驗結果比較恢復實驗結果顯示,與PBS組比較,mir-191-5p mimics組TJP1的相對表達量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與miR-191-5p mimics組比較,pCMV-T+mimics組TJP1的相對表達量增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。證實過表達TJP1能恢復miR-191-5p對TJP1的靶向抑制作用,見圖6。

注： A, TJP1的qRT-PCR分析結果圖; B, Western blot結果圖, GAPDH為內參; 與PBS組比較, **P<0.01; 與miR-191-5p mimics組比較, *P<0.05, **P<0.01。

3 討論

近年來,宮頸癌的發(fā)病率呈上升趨勢[11],嚴重威脅著女性健康。研究表明,癌源性外泌體miRNA在宮頸癌的進展中起關鍵作用[12]。本研究提取宮頸癌細胞系培養(yǎng)上清外泌體,經透射電鏡和Western blot實驗證實形態(tài)、標志物,其結果符合既往報道[13]。將外泌體與HUVEC共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)外泌體能被HUVEC攝取,這是外泌體發(fā)揮輸送miRNA作用的基礎。在乳腺癌[14]、結腸癌[15]、卵巢透明細胞癌[16]等腫瘤中的miR-191-5p表達異常,這促進癌癥的進展。本研究發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)后的HUVEC中miR-191-5p的表達水平升高,可見宮頸癌源外泌體能將miR-191-5p遞送進入HUVEC中。共培養(yǎng)HUVEC細胞層的通透性增加,提示宮頸癌外泌體來源的miR-191-5p可促進HUVEC細胞層通透性增加。瘤內和瘤旁血管在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。與正常血管網(wǎng)絡相比,腫瘤相關的血管網(wǎng)絡是異常的[17],而異常的腫瘤血管通透性增加,會促進腫瘤細胞的轉移[18]。研究表明,miRNA在血管生成的調節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[19]。腫瘤細胞可通過外泌體將特定的miRNA轉運至HUVEC層中從而減弱血管屏障功能,增加血管通透性,促進腫瘤細胞轉移[20]。本研究發(fā)現(xiàn),HUVEC高表達miR-191-5p時,HUVEC細胞層通透性增加,穿透HUVEC細胞層的宮頸癌平均細胞數(shù)增加。He等[21]的研究發(fā)現(xiàn),結直腸癌源性外泌體中的miR-21-5p高表達,導致血管通透性增加,這與本研究結果一致。

TJP1是構成緊密連接(TJs)的關鍵蛋白[22]。當TJP1表達下調時,TJs結構破壞,細胞旁通透性屏障作用減弱,促進癌細胞穿過內皮細胞屏障,發(fā)生遷移及侵襲[23]。本研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌源miR-191-5p靶向抑制HUVEC中的TJP1,導致HUVEC中的TJs減少,進而導致內皮細胞層通透性增加,癌細胞容易穿過HUVEC細胞層,促進癌細胞遷移。Xie等的[24]研究發(fā)現(xiàn),缺氧鼻咽癌外泌體miR-455通過靶向TJP1增加血管通透性以促進鼻咽癌細胞轉移。高度轉移性肝癌細胞分泌的miR-638可通過下調血管內皮細胞的TJP1表達,促進血管通透性[25]。上述研究結果均與本研究結果一致。因此,可認為TJP1是研究血管通透性的關鍵基因。

綜上所述,宮頸癌源性外泌體中miR-191-5p富集,miR-191-5p通過靶向調控TJP1導致HUVEC細胞層通透性增加,促進癌細胞轉移。過表達TJP1可恢復miR-191-5p靶向抑制TJP1的作用。可認為癌源性外泌體miR-191-5p具有作為臨床生物學標志物的潛力,但其能否成為有效的生物標記物需要進一步探究。