王玉潔, 李 婷, 孜拉蘭·玉山江, 李鴻濤

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺甲狀腺外科, 烏魯木齊 830011)

據(jù)2020年WHO報道,乳腺癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率最高,超過了肺癌,位居第一位。乳腺癌的新發(fā)患者人數(shù)約260萬,中國約42萬,而且逐年呈現(xiàn)上升趨勢[1]。由于該疾病的致死率較高,嚴(yán)重威脅到女性患者的身心健康[2]。外泌體是一種細(xì)胞內(nèi)囊泡,它形成于多囊泡體和細(xì)胞膜的融合過程,并通過此過程被釋放出來[3]。外泌體是細(xì)胞內(nèi)多泡體內(nèi)形成腔內(nèi)囊泡,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)外泌體可基于和受體結(jié)合或被內(nèi)化的方式,進(jìn)入受體細(xì)胞,并對靶細(xì)胞產(chǎn)生影響[6]。因此,外泌體在向周圍或遠(yuǎn)處細(xì)胞傳遞信號中發(fā)揮著重要作用。

Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn),突觸后密度蛋白95(PSD-95,又稱DLG4)在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá),這與結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)分析突觸后密度蛋白95(PSD-95、DLG4)在三陰型乳腺癌患者中的表達(dá)情況及臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至2018年1月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺甲狀腺腫瘤研究中心的4例三陰型乳腺癌患者及4例乳腺良性腫瘤患者的樣本,通過生物信息學(xué)方法測定其相關(guān)基因表達(dá)情況,且進(jìn)行對比[8],選擇高通量測序方法進(jìn)行檢測[9],以獲得兩組樣品的mRNA-seq數(shù)據(jù)。同時收集同期36例三陰型乳腺癌患者的術(shù)前穿刺或術(shù)中病理組織標(biāo)本和30例乳腺良性腫瘤患者的組織標(biāo)本,用于對候選mRNA表達(dá)水平的分析。本研究已通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(K-2021076),并通過了所有參加研究的患者及其家屬的書面知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)參照中國癌癥學(xué)會《乳腺癌診療指南(修訂版)》2020年度報告編制的入選和剔除標(biāo)準(zhǔn)。 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)侵襲性無特異性乳癌的病理學(xué)確診者;(2)經(jīng)免疫組化檢驗(yàn);(3)首次就診時未接受化學(xué)藥物、放射和其他臨床療法者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床病理資料不完整者;(2)失訪患者。(3)不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的均予以剔除。

1.3 試劑和儀器包埋機(jī)(PBM-B)來源于常州普瑞斯星公司;微量移液器和離心機(jī)(TDZ5-WS)來源于湖南湘鑫儀器儀表有限公司;免疫組化染色試劑盒、DLG4抗體(#AF5283)購自Affinity抗體公司;外泌體提取試劑盒(76064)購自QIAGEN公司。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序和外泌體的分離純化將樣品迅速溶解后加1倍劑量的 XBP,反轉(zhuǎn)混合后向 exoEasy離心機(jī)中添加混合液進(jìn)行3 min的旋轉(zhuǎn)離心,再靜置5 min;然后將10 mL的緩沖劑 XWP添加到2 810×g的離心器中7 min,將剩余的緩沖劑去除。將轉(zhuǎn)動的色譜塔移至新的收集管內(nèi),在薄膜上添加600 μL的緩沖劑 XE,培養(yǎng)3 min。在500×g的條件下,5 min后,萃取洗脫劑,再回柱,再加入外部易旋柱,溫育3 min;對分離出的外泌體測序,據(jù)此確定出相應(yīng)mRNA-seq,然后篩選出品質(zhì)較好的外泌體。以已知的GRCh38為參照物完成測序。使用HISAT2軟件進(jìn)行比較,使用 StringTie軟件將比較得到的讀數(shù)進(jìn)行組合,以此為基礎(chǔ)建立多變量的剪切圖和交通網(wǎng)絡(luò);按照最大通信量的計(jì)算方法,將讀數(shù)組合起來,并對它們的表達(dá)量進(jìn)行估計(jì)。

1.5 差異表達(dá)的mRNA鑒定利用Limma分析技術(shù),以|log FC|>1,Pvalue<0.05為篩選條件,對獲得的外泌體進(jìn)行mRNA分析。差異倍數(shù)(Fold Change, FC)是指兩個群體之間的表達(dá)量之比。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 與mRNA差異表達(dá)有關(guān)的信號途徑分析對比以上各基因的 KEGG和GO數(shù)據(jù),基于GO富集性研究,深入研究其生物學(xué)過程、分子功能,以及其在細(xì)胞內(nèi)的組成。本研究發(fā)現(xiàn)相對于全基因組背景,這些mRNA具有顯著豐富度的KEGG通路和GO項(xiàng)目。說明這些mRNA在特定的生物學(xué)進(jìn)程和分子功能中發(fā)揮重要作用。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法驗(yàn)證候選mRNA將三陰乳腺癌組織及正常組織取材后用生理鹽水沖洗干凈后置于10%中性福爾馬林溶液中固定,然后根據(jù)取材、包埋、切片、烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)等免疫組化標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片,并按照評分標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行評分。一抗稀釋液一般為PBS,抗體名稱:PSD-95(DLG4),通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定準(zhǔn)確稀釋倍數(shù)為:1∶200。根據(jù)陽性染色強(qiáng)度分為4個等級:0分為陰性(無色),1分為淺黃色(弱陽性),2分為棕黃色(中等陽性),3分為棕褐色(強(qiáng)陽性)。根據(jù)陽性染色的腫瘤細(xì)胞比例分為5個等級:0分,陽性細(xì)胞<5%;1分,陽性細(xì)胞占6%～25%;2分,陽性細(xì)胞占26%～50%;3分,陽性細(xì)胞占51%～75%;4分,陽性細(xì)胞>75%。綜合兩項(xiàng)評分:總分范圍為0～8分,0分評級為不表達(dá),1～2分評級為低表達(dá),3～8分評級為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 外泌體測序分析差異表達(dá)的mRNA通過對基因序列的分析,發(fā)現(xiàn)90條基因在mRNA水平上的差異,11條在基因水平上顯著升高,79條在下降。圖1、圖2為 DEG的火山圖和熱流圖。

圖1 兩組患者外泌體中差異表達(dá)的mRNA

圖2 差異性顯著mRNA的聚類分析

2.2 mRNA功能性富集分析的差異性表達(dá)結(jié)果經(jīng)GO、KEGG-Pathway等方法檢測,篩選出差異表達(dá) mRNAs,其主要參與細(xì)胞自噬、NIK/NF-κB信號的調(diào)節(jié)等;在細(xì)胞器成分領(lǐng)域中涉及到胞漿、突觸部分等,其參與的生物過程包括蛋白磷酸酶結(jié)合、GTP酶抑制劑活性的調(diào)控等(圖3)。同時,在KEGG-Pathway中,這些mRNA涉及到的信號途徑有硫酸鹽代謝途徑、半胱氨酸等(圖4)。

圖3 差異表達(dá)mRNA 的GO富集分析氣泡圖

圖4 差異表達(dá)mRNA的KEGG富集分析柱狀圖

PSD-95(DLG4)為其中一個具有顯著差異性的mRNA。因此將PSD-95(DLG4)確定為候選mRNA,并應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測三陰型乳腺癌和乳腺良性腫瘤中該基因的表達(dá)。

2.3 PSD-95(DLG4)在三陰型乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤組織中的表達(dá)水平PSD-95(DLG4)在三陰型乳腺癌組織中的表達(dá)水平(4.17±2.13)顯著低于乳腺良性腫瘤組織(7.87±0.346)。三陰型乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤組織PSD-95(DLG4)免疫組化染色結(jié)果見圖5。

樣本分類40×100×200×400×三陰型乳腺癌組織乳腺良性腫瘤組織

2.4 三陰型乳腺癌中PSD-95(DLG4)蛋白的表達(dá)及其與臨床病理的相關(guān)性與PSD-95(DLG4)低表達(dá)的三陰型乳腺癌相比,PSD-95(DLG4)高表達(dá)的三陰型乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(N)大幅度下降;PSD-95(DLG4)的差異表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(χ2=9.506,P<0.05),而與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、Ki67表達(dá)水平、腫瘤大小(T)及組織學(xué)分級等無關(guān)(P均>0.05),見表1。

表1 DLG4表達(dá)與三陰型乳腺癌患者病理特征相關(guān)性

3 討論

三陰型乳腺癌由于ER/PR、ERBB2基因缺失因此得名,由于它對內(nèi)分泌治療和靶向治療不敏感,所以預(yù)后相對較差,并且容易在早期出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等情況?；熞恢笔桥R床上對三陰型乳腺癌的主要一線治療選擇。尋求三陰型乳腺癌的高效治療靶標(biāo),實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)靶向治療,是減少三陰型乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要途徑。

DLG4編碼PSD-95蛋白,其是MAGUK家族的一個成員。它與PSD-93一起被招募到相同的N-甲基-D-天氡氨酸(NMDA)受體和鉀通道群中。有研究表明,Syntenin是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的主要蛋白質(zhì),已被確定為外泌體生物行為中的關(guān)鍵參與者,該蛋白包括4個功能區(qū):N末端、DLG4、PDZ1、PDZ2和 CTD。相關(guān)分子研究結(jié)果表明,PDZ結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞內(nèi)或質(zhì)膜中,并與伴侶蛋白的C端肽結(jié)合。在乳腺癌中,syntenin-1過度表達(dá)[11-13],導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[14]。通過miRNA上調(diào)或下調(diào)表達(dá)來干預(yù)乳腺癌的遷移和侵襲能力,因而在治療過程中選擇相應(yīng)的基因作為靶點(diǎn),對其進(jìn)行針對性的調(diào)節(jié)可起到更好的治療效果,這也是在針對腫瘤生物學(xué)行為對其進(jìn)行靶向干預(yù)研究領(lǐng)域中的重要方向[15]。

外泌體作為一種新型的胞外囊泡,在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要的作用[16]。本研究在三陰型乳腺癌和乳腺良性腫瘤患者外泌體中篩選差異表達(dá)基因,并將PSD-95(DLG4)做為本研究中一個具有顯著差異性的mRNA,通過KEGG和GO富集分析發(fā)現(xiàn)其可能參與NIK/NF-κB信號通路的調(diào)節(jié),而該信號通路對乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移會產(chǎn)生一定促進(jìn)作用[17],由此推測PSD-95(DLG4)可能通過調(diào)控或干預(yù)該信號通路來影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果表明,PSD-95(DLG4)低表達(dá)可能影響三陰型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,并且PSD-95(DLG4)低表達(dá)與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此,盡早了解和此類患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有助于制定更加精準(zhǔn)的治療方案。PSD-95(DLG4)作為編碼RNA,若能在基因?qū)用鎸ζ溥M(jìn)行早期干預(yù)有望降低患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險。由于本研究的樣本例數(shù)較少,因此無法對患者進(jìn)行生存分析。從數(shù)據(jù)庫分析得出PSD-95(DLG4)可能參與NF-κB通路的調(diào)節(jié),但其參與的具體機(jī)制尚不清楚,本課題組今后將對該機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究和探討。