張秀梅，宋翠萍，譚 磊，孫英杰，劉煒瑋，廖 瑛，丁 鏟，仇旭升，羅廷榮

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

雞馬立克氏病（Marek's disease, MD）是由馬立克氏病毒（Marek's disease virus, MDV）感染引起的一種以雞的淋巴組織增生和腫瘤為特征的疾病。臨床上主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙、神經(jīng)麻痹癱瘓、臟器腫瘤和免疫器官損傷等癥狀[1]。MDV是基因組大小約為180 kb的雙股線性DNA病毒，根據(jù)病原血清學(xué)反應(yīng)，將MDV分為MDV1、 MDV2和MDV3三個(gè)血清型。MDV1型具有致瘤性，包括MDV分離的強(qiáng)毒株及其衍生物；根據(jù)免疫致病性差異，將MDV分為溫和型（mild mMDV）、強(qiáng)毒力型（virulent,vMDV）、超強(qiáng)毒力型（very virulent, vvMDV）和特超強(qiáng)毒力型（very virulent plus MDV, vv+MDV），MDV2、MDV3型均為非致瘤性皰疹病毒[2-3]。MDV具有很強(qiáng)的水平傳播能力，病毒粒子僅從感染雞的羽毛囊上皮細(xì)胞脫落，宿主通過攝入結(jié)合有MDV的灰塵或者皮屑而感染，進(jìn)而造成病雞器官組織淋巴細(xì)胞浸潤性的腫瘤性疾病，給家禽業(yè)造成了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（Reticuloendotheliosis,RE）是由單鏈RNA的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒引起的一種禽類的慢性腫瘤性疾病。有研究表明，在雞群感染MDV的同時(shí)往往伴隨有REV的混合感染。從1992年開始，人們陸續(xù)報(bào)道MDV和REV的共感染，Isfort等[4-5]發(fā)現(xiàn)MDV和REV在成纖維細(xì)胞中共感染并長期或短期連續(xù)傳代后，發(fā)現(xiàn)REV能夠整合到MDV的基因組中，且整合位點(diǎn)集中在MDV的內(nèi)部短重復(fù)序列（internal repeat short, IRS）和短獨(dú)特序列（unique short, US）的交界處。Davidson等[6]運(yùn)用熱點(diǎn)組合PCR的方法從雞的腫瘤組織樣品中擴(kuò)增出含有REV-LTR的MDV片段。2003年，張志等[7]首先報(bào)道從中國腫瘤病雞中分離出整合有REV LTR和MDV的天然重組野毒株GX0101株，該插入位點(diǎn)位于MDV的US區(qū)域。孫愛軍等[8-10]通過構(gòu)建細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC）克隆BAC-GX0101株及LTR敲除的BAC-GX0101△LTR株免疫雞后發(fā)現(xiàn)LTR的插入并沒有增強(qiáng)GX0101毒株的致病性，而是增強(qiáng)了其水平傳播能力，說明水平傳播能力不一定與MDV的致病性一致，這可能提供了一些選擇性優(yōu)勢(shì)，使其成為優(yōu)勢(shì)菌株。Witter等[11]發(fā)現(xiàn)整合 有REV-LTR序列的重組MDV RM1株的致瘤性減弱，但誘發(fā)了嚴(yán)重的淋巴器官萎縮和免疫抑制。 Mays等[12]將REV-LTR插入到強(qiáng)毒株MDV Md5的BAC克隆中，第40代時(shí)使所得重組病毒rMd5 REV-LTR BAC在陽性抗體雞中完全減毒，第70代時(shí)在母源抗體陰性雞中完全減毒，與CVI988/Rispens疫苗比較實(shí)驗(yàn)顯示，該重組毒株不會(huì)誘發(fā)法氏囊或胸腺萎縮，但無法提供與CVI988/Rispens相同水平的免疫保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)室將兩個(gè)REV-LTR序列插入到CVI988/Rispens基因組中構(gòu)建成重組馬立克氏病病毒rMDV-LTR株[13-14]。通過檢測(cè) rMDV-LTR株與親本CVI988/Rispens株皮下注射免疫1日齡SPF雞，比較對(duì)rMd5攻毒的免疫保護(hù)效力差異，結(jié)果顯示rMDV-LTR株重組毒株較CVI988/Rispens在雞體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)腫瘤、組織病變或明顯的病理改變。說明重組毒rMDV-LTR疫苗株是一種安全的、有效的、新型的重組MDV疫苗。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、疫苗毒株 1日齡SPF雞100羽，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雞馬立克氏病病毒Ⅰ型重組活疫苗（rMDV-LTR株）、MD pilot 006，2.2×106PFU/mL，CVI988/Rispens株，2000羽份/瓶，3080 PFU/羽份，均保存在本實(shí)驗(yàn)室液氮中。

1.2 試驗(yàn)分組及免疫接種情況

1.2.1 分組 將同源同批1日齡SPF雞分成6個(gè)試驗(yàn)組，每組10羽試驗(yàn)雞，G1～G3試驗(yàn)組免疫rMDV-LTR，G4～G6試驗(yàn)組免疫CVI988/Rispens株；另設(shè)GC1作為攻毒對(duì)照組，GC2組作為健康對(duì)照組，每組20羽雞，具體分組情況如表1所示。

表1 試 驗(yàn)分組及免疫情況Table 1 Experimental grouping and immunization status

1.2.2 接種 使用馬立克氏病疫苗稀釋液將雞馬立克氏病病毒Ⅰ型重組活疫苗（rMDV-LTR株）和CVI988/Rispens株稀釋為125、250和500 PFU/0.2 mL。G1～G3組1日齡SPF雞分別經(jīng)頸背部皮下接種125、250和500 PFU的rMDV-LTR株；G4～G6組1日齡SPF雞分別經(jīng)頸背部皮下接種125、250和500 PFU的CVI988/Rispens株。GC1和GC2組均注射0.2 mL的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。

1.2.3 攻毒 疫苗接種后第7 d，G1～G6組、GC1組各腹腔注射接種500 PFU馬立克氏病強(qiáng)毒rMd5；GC2組接種PBS，作為空白對(duì)照。持續(xù)觀察60 d。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 免疫后對(duì)雞體重增重的影響 各組雞分別于攻毒后14、28、42、60 d時(shí)進(jìn)行稱重并記錄，判斷各組疫苗免疫后對(duì)雞體重增 重的影響。接種60 d后，將各組雞剖殺，對(duì)心臟、肝臟、脾臟及法氏囊等組織進(jìn)行稱重，用S PSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 觀察記錄雞發(fā)病及死亡情況 攻毒后連續(xù)觀察60 d，記錄各組試驗(yàn)雞死亡和發(fā)病情況。病毒接種后的臨床觀察期間發(fā)生死亡的病例，以及觀察期結(jié)束后存活的試驗(yàn)雞，全部剖檢，肉眼觀察是否有可見病變。采集疑似病變的內(nèi)臟組織，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察組織病理變化。

發(fā)病判定標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)雞死亡（排除非特異性死亡），出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙麻痹綜合征；剖檢胸腺和法氏囊萎縮，內(nèi)臟器官包括心臟、肝臟、腎臟、脾臟等出現(xiàn)彌散性腫大或腫瘤，外周神經(jīng)橫紋消、褪色、腫大，可判定為雞馬立克氏病發(fā)病。免疫攻毒保護(hù)率（PI）計(jì)算公式：

2 結(jié)果

2.1 攻毒后不同組試驗(yàn)雞的發(fā)病和死亡情況 攻毒后第3周，攻毒對(duì)照組雞GC1出現(xiàn)羽毛凌亂松散無光澤，精神不振、萎靡，飲食欲下降，個(gè)別雞只出現(xiàn)腳趾畸形、劈叉癱瘓等特征性癥狀（圖1），第4周開始陸續(xù)死亡，癥狀持續(xù)到攻毒后第60 d。G3、G6和空白對(duì)照組雞精神狀態(tài)良好，飲食 欲正常，羽毛整潔有光澤。G2和G5組各有1只試驗(yàn)雞出現(xiàn)羽毛凌亂無光澤、精神不振、萎靡等臨床癥狀，直至試驗(yàn)結(jié)束未出現(xiàn)死亡，兩個(gè)試驗(yàn)組的其他試驗(yàn)雞未出現(xiàn)任何臨床癥狀。G1和G4組試驗(yàn)雞在攻毒后各有2只試驗(yàn)雞出現(xiàn)羽毛凌亂無光澤，精神不振、萎靡等臨床癥狀，直至試驗(yàn)結(jié)束，G1組發(fā)病試驗(yàn)雞未死亡，而G4組2只發(fā)病雞全部死亡。

圖1 對(duì)照組的雞攻毒后的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of chickens in the challenged control group

2.2 試驗(yàn)雞剖檢情況 攻毒后第4周GC1攻毒 對(duì)照組雞開始陸續(xù)死亡，60 d后對(duì)剩余試驗(yàn)雞進(jìn)行解剖（圖2）。結(jié)果顯示，GC1組剩8只試驗(yàn)雞存活，將病死雞剖檢，可見心臟、肝臟、脾臟出現(xiàn)灰白色彌散性腫瘤灶，肝臟、腎臟、脾臟腫大，法氏囊萎縮等均為MD特征性病變的病理變化。G2、G3、G5和G6組接種組雞以及空白對(duì)照組試驗(yàn)雞在各主要組織臟器中均未觀察到臨床病理學(xué)變化或任何疑似腫瘤。G1組10羽試驗(yàn)雞，包括兩只發(fā)病雞在各主要組織臟器中均未觀察到臨床病理學(xué)變化或任何疑似腫瘤；而在G4組存活的8只眼觀健康試驗(yàn)雞中有1只雞檢出脾臟 存在彌散性腫瘤灶，其他試驗(yàn)雞未檢出病變。

圖2 攻毒后60 天試驗(yàn)雞剖檢臟器Fig.2 Autopsy of chicken viscera after challenge 60 days

圖3 GC1 組感染MDV 雞的特征性病理變化Fig.3 Characteristic pathological changes of MDV infected group GC1 chickens

2.3 病理組織學(xué)觀察 連續(xù)觀察60 d，剖檢將各內(nèi)臟組織HE染色后，顯微鏡下觀察其病理變化。結(jié)果顯示攻毒對(duì)照組由于送檢的組織臟器含有腫瘤灶，故病理變化和圖5病理情況相似，而疫苗免 疫組則沒有出現(xiàn)明顯的病理改變（圖4，圖5）。對(duì)含有腫瘤灶的臟器HE染色結(jié)果分析可知：含有腫瘤灶的心臟可見較嚴(yán)重的心肌間質(zhì)炎和實(shí)質(zhì)炎，較多心肌纖維斷裂，有較大量的淋巴細(xì)胞浸潤（圖5A）；肝組織可見幾處壞死灶，肝細(xì)胞壞死，局部可見鈣化，可見幾處淋巴細(xì)胞浸潤小灶，較多血管淤血，血液含有大量淋巴細(xì)胞，廣泛肝竇中可見小的淋巴細(xì)胞浸潤（圖5B）；脾臟可見極其大量的淋巴細(xì)胞浸潤，白髓正常結(jié)構(gòu)消失，形態(tài)不規(guī)則，大小不一，被大量的“MD細(xì)胞”替代，“MD細(xì)胞”可能是一種腫瘤化的淋巴細(xì)胞，胞漿具有強(qiáng)嗜堿性，形態(tài)多樣，胞質(zhì)較豐富，核仁明顯，有的還具有核分裂相，紅髓中也可見這種細(xì)胞樣（圖5C）；肺臟肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，有大量的淋巴細(xì)胞浸潤（圖5D）；腎臟組織腎小管數(shù)量大量減少并壞死，組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見極其大量的淋巴細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞胞核固縮、碎裂、消失等病理變化（圖5E）；法氏囊表現(xiàn)為壓迫性萎縮，壞死和大量的淋巴細(xì)胞浸潤（圖5F）。

圖4 免疫后60 天對(duì)各組織器官的HE 染色結(jié)果 (HE, 40×)Fig.4 HE staining results of tissues and organs at 60 days after immunization (HE, 40×)

圖5 感染MDV 特征病變組織切片, 各組織器官的HE 染色結(jié)果Fig.5 The results of HE staining of each tissue and organ infected with MDV

2.4 攻毒后不同組試驗(yàn)雞的體重增重情況 試驗(yàn)組7日齡SPF雞攻毒后連續(xù)觀察60 d，同源同批GC2試驗(yàn)組SPF雞作為陰性對(duì)照。攻毒后在14、28、42、60 d對(duì)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的SPF雞進(jìn)行稱重，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphP ad-Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制出體重隨時(shí)間增長情況。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，試驗(yàn)雞的體重均在不同程度的增長，免疫組試驗(yàn)雞的體重差別不大，但在60 d時(shí)rMDV-LTR株免疫組試驗(yàn)雞體重較CVI98 8/Rispens株免疫組雞的體重輕，攻毒對(duì)照組的試驗(yàn)雞體重較健康對(duì)照組體重輕（圖6）。對(duì)各試驗(yàn)組雞剖檢的臟器進(jìn)行稱重，結(jié)果顯示，rMDV-LTR株免疫組和CVI988/Rispens株免疫組雞心臟、脾臟和法氏囊重量無顯著差異；rMDV-LTR株免疫組試驗(yàn)雞肝臟比其他組略輕（圖7）。

圖6 攻毒后60 d 試驗(yàn)雞體重比較Fig.6 Comparison of weight of test chickens 60 days after challenge

圖7 攻毒后60 d 試驗(yàn)雞臟器重量比較Fig.7 Comparison of organ weight of test chickens 60 days after challenge

2.5 各試驗(yàn)組免疫保護(hù)指數(shù) 通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較rMDV-LTR株、CVI988/Rispens株不同免疫劑量組和對(duì)照組雞群的生長增重差異。統(tǒng)計(jì)各組試驗(yàn)雞發(fā)病、死亡情況、腫瘤檢出率，并計(jì)算各免疫組的免疫保護(hù)指數(shù)。結(jié)果顯示，在分別以500PFU/羽和250PFU/羽劑量的rMDV-LTR株或親本CVI988/Rispens株免疫雛雞都可以提供大于80%的免疫保護(hù)效率。以125 PFU/羽劑量的rMDV-LTR株或親本CVI988/Rispens株雖均不能提供大于80%的免疫保護(hù)效力，但前者免疫組試驗(yàn)雞未出現(xiàn)死亡，僅有2只雞臨床消瘦癥狀記為陽性，剖解未見腫瘤；而后者免疫組出現(xiàn)2只死亡，1只檢出腫瘤，死亡率為20%（表2）。

表2 試驗(yàn)組免疫保護(hù)指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of immune protection index of experimental group

3 討論

馬立克氏病是第一個(gè)使用疫苗就能夠達(dá)到有效防治的病毒性腫瘤疾病，現(xiàn)有疫苗如減毒血清1型CVI988/Rispens、血清2型SB1和血清3型FC126疫苗株已經(jīng)被廣泛使用。MDV多價(jià)苗表現(xiàn)出較良好的保護(hù)效果在市場(chǎng)上得到了推廣和應(yīng)用，如二價(jià)活疫苗CVI988/Rispens株+ HVT FC126株，三價(jià)疫苗Md11/75+ SB1+HVT FC126株等毒株提供了比單獨(dú)使用一種疫苗更好的保護(hù)[15-16]。然而近些年來，可能由于疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，以及新的MDV突變體逃避免疫壓力使得MDV毒力不斷增強(qiáng)，MDV與其他病毒共感染等復(fù)雜疾病日漸突出，使用傳統(tǒng)疫苗已經(jīng)無法提供完全有效的免疫保護(hù)[17]。因此需要不斷研發(fā)新的更為安全有效的疫苗以積極預(yù)防應(yīng)對(duì)因MDV毒力增強(qiáng)而引發(fā)的新型MD。

REV是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，為了其自身復(fù)制，可以整合進(jìn)任何雙鏈DNA中，包括宿主、MDV、禽痘病毒基因組等[4-6]。研究表明，REV-LTR顯示出強(qiáng)大的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子作用，根據(jù)其插入的位置，各種基因能夠被反式激活，當(dāng)整合到MDV的基因組中時(shí)，可以影響MDV基因的表達(dá)，有可能產(chǎn)生新的MDV表型特性，但REV和MDV發(fā)生自然重組的概率非常低[4-7,18-19]。目前，國內(nèi)外已多次分離鑒定出REV的基因序列整合進(jìn)MDV的重組病毒，且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因重組疫苗應(yīng)用于MDV已成為一個(gè)被廣泛研究的課題[19]。利用BAC系統(tǒng)構(gòu)建的BACGX0101株和敲除LTR的BAC-GX0101△LTR株，說明REV LTR的插入能夠提高病毒在體內(nèi)復(fù)制和水平傳播能力，同時(shí)降低病毒的致病性，表明這種重組方式可能具有一定的生存優(yōu)勢(shì)[8]。而從強(qiáng)毒株JM衍生的病毒，通過在MDV的 US和IRS和短末端重復(fù)序列（terminal repeat short, TRS）的交界處插入REVLTR基因組導(dǎo)致該重組毒株RM1的致癌性減弱，超過了CVI988/Rispens疫苗株的保護(hù)水平，但保留了其親本病毒的免疫抑制特性，使其不適用于商業(yè)用途[4]。CVRM毒株是REV LTR通過與NotⅠ線性化的B40-RM1Pac粘粒和從CVI988感染的雞胚成纖維細(xì)胞中分離的基因組DNA同源重組產(chǎn)生的，該毒株在細(xì)胞培養(yǎng)中復(fù)制效率表現(xiàn)出比親本CVI988更高的水平，并且對(duì)雞保持無病原性，在免疫保護(hù)試驗(yàn)中，CVRM與CVI988病毒提供的保護(hù)指數(shù)相似或更好的保護(hù)指數(shù)，但卻有12%的死亡率[20]。

rMDV-LTR株是先前本實(shí)驗(yàn)室利用基因重組技術(shù)將兩個(gè)REV-LTR序列插入到CVI988/Rispens基因組中構(gòu)建成的重組馬立克氏病病毒[14]。本試驗(yàn)將rMDV-LTR株與親本CVI988/Rispens株以三個(gè)不同劑量接種1日齡SPF雛雞。接種后第7 d，使用500 PFU馬立克病毒強(qiáng)毒rMd5攻毒，對(duì)各組雞的臨床癥狀觀察，體重增長情況監(jiān)測(cè)，發(fā)病死亡和剖檢情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，綜合評(píng)價(jià)雞馬立克氏病病毒Ⅰ型重組活疫苗（rMDV-LTR株）和同類產(chǎn)品的免疫保護(hù)效力差異。在接種后第7 d用500 PFU馬立克病毒強(qiáng)毒rMd5攻毒的情況下，分別以500 PFU/羽份和250 PFU/羽劑量的rMDV-LTR株或親本CVI988/Rispens株免疫1日齡SPF雛雞都可以提供大于80%的免疫保護(hù)效率。以125 PFU/羽劑量的rMDV-LTR株或親本CVI988/Rispens株雖均不能提供大于80%的免疫保護(hù)效力，但rMDV-LTR株免疫組試驗(yàn)雞未出現(xiàn)死亡，僅有2只雞臨床消瘦癥狀記為陽性，但剖解未見腫瘤。而CVI988/Rispens株免疫組出現(xiàn)2只死亡，1只檢出腫瘤，死亡率為20%。rMDV-LTR株和CVI988/Rispens株免疫組的免疫保護(hù)指數(shù)分別為77.78%和66.67%。經(jīng)病理檢驗(yàn)，剖檢有腫瘤的器官主要集中在心臟、肝臟、脾臟及腎臟，均有彌散的腫瘤灶，且含有大量的淋巴細(xì)胞浸潤。rMDV-LTR株免疫組和CVI988/Rispens株免疫組雞體重差異不大，且除肝臟略輕外，其他臟器重量也無顯著差異。因此，在較小免疫劑量下，7日齡攻毒，rMDV-LTR 疫苗免疫組比經(jīng)典的CVI988/Rispens疫苗免疫組死亡率明顯降低，且整體免疫保護(hù)率也高于CVI988/Rispens株疫苗免疫組。根據(jù)之前本實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)顯示，rMDVLTR株提供了比親本CVI988/Rispens株更快的體外復(fù)制能力，但免疫雞無MD臨床癥狀，體重、器官重量無明顯差異，也無明顯的MD病理病變，在周圍環(huán)境中也無法檢測(cè)到MDV[13]。表明雞馬立克氏病病毒Ⅰ型重組活疫苗（rMDV-LTR株）可以開發(fā)為一種安全有效的疫苗。

以實(shí)驗(yàn)室制備的雞馬立克氏病病毒Ⅰ型重組活疫苗rMDV-LTR株和親本CVI988/Rispens株皮下注射免疫1日齡SPF雞，對(duì)兩者攻毒免疫效力進(jìn)行比較的結(jié)果顯示，在相同免疫劑量下，rMDV-LTR株對(duì)1日齡SPF雞可以提供比親本CVI988/Rispens對(duì)照組更高的保護(hù)率。表明雞馬立克氏病病毒Ⅰ型重組活疫苗（rMDV-LTR株）可以提供的免疫保護(hù)效力優(yōu)于經(jīng)典疫苗CVI988/Rispens株。