寧宇春，王圓赫，郭祥杰，朱宏陽，田萬年

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 132101；2.圖們市涼水鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，圖們 133100）

羊泰勒蟲?。╫vine and caprine theileriosis）是一種經(jīng)蜱傳播的寄生于羊紅細(xì)胞內(nèi)血液原蟲病[1]。本病對羔羊和外地引進(jìn)羊危害較嚴(yán)重，病羊多表現(xiàn)為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿，嚴(yán)重時可引起死亡，從而限制了地方性養(yǎng)羊的發(fā)展，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成較大危害[2-3]。嗜吞噬細(xì)胞無漿體（A.phagocytophilum, AP）于1932年在蘇格蘭地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，引起羊不明發(fā)熱，是一類經(jīng)蜱傳播的寄生于紅細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌性病原[5]。嗜吞噬細(xì)胞無漿體是一種人畜共患傳染病，屬于自然疫源性疾病，可引起宿主動物貧血，血小板減少，消瘦等臨床癥狀[6-7]。嗜吞噬細(xì)胞無漿體可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥和免疫反應(yīng)，同時能夠介導(dǎo)免疫活性細(xì)胞及炎性因子對宿主細(xì)胞的攻擊，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制。

以上兩種病原都由硬蜱傳播，主要發(fā)生于媒介硬蜱活動期間，易發(fā)生混合感染，且其臨床癥狀表現(xiàn)相似。因此，血液涂片檢測易出現(xiàn)漏診或誤診的弊端，采用PCR檢測具有更高的特異性和敏感性，從而使病原體的診斷更加可靠。目前尚未見羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體的雙重PCR檢測方法，本研究旨在通過建立更加快速、特異的雙重PCR檢測方法，為羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了適用先進(jìn)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 血液樣本于2020年5月，采自吉林省圖們市散養(yǎng)的綿羊60份，無菌采取抗凝血，同時制作血液涂片供鏡檢，-20℃保存?zhèn)溆?。弓形蟲、牛瑟氏泰勒蟲、無漿體和附紅細(xì)胞體標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院薛書江博士惠贈。

1.2 主要試劑 DNA回收試劑盒、血液DNA試劑盒、DL2000 DNA marker均購自天根生化科技（北京）有限公司，TaqPreMix購自華美生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI已經(jīng)收錄羊泰勒蟲MPSP基因（G Q 2 8 1 0 4 4）和 無漿體1 6 S r R N A 基因（JN558815），設(shè)計了兩對引物。P1上游引物：5'-CACGCTATGTTGTCCAAGAG-3'，下游引物：5'-TGTGACACTCAATGCGCCTA-3'。擴(kuò)增片段大小為875 bp，P2上游引物5'-TCGTGTCGTGAGATGT TGGTT-3'，下游引物：5'-TGGCTGCTTCCTT TCGGTTAG-3'，片段大小394 bp，以上引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 雙重PCR方法擴(kuò)增 提取過程依據(jù)試劑盒操作手冊進(jìn)行，獲取的DNA低溫保存。以提取的羊基因組DNA為模板，PCR體系（25 μL）為：ddH2O 9 μL，TaqPreMix 12.5 μL，羊基因組DNA 2.5 μL，MPSP和16S rRNA上、下游引物各0.5μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸30 s，共33個循環(huán)；72℃再延伸7 min。陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.5 退火溫度的篩選 在54℃～60℃范圍內(nèi)進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，篩選出雙重PCR最佳的退火溫度。

1.6 特異性試驗 用優(yōu)化的雙重PCR分別以羊泰勒蟲、嗜吞噬細(xì)胞無漿體、附紅細(xì)胞體、弓形蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，分析該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 用紫外分光光度計測定已提取的羊基因組DNA的D260值，計算DNA含量，進(jìn)行10倍稀釋后，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.8 臨床樣本的檢測 對臨床中60份綿羊抗凝血進(jìn)行雙重PCR檢測和血涂片鏡檢，比較兩種方法的陽性檢出率和陽性符合率。

2 結(jié)果

2.1 血涂片鏡檢 羊血涂片經(jīng)吉姆薩染色后，經(jīng)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞內(nèi)呈圓形、桿狀和梨籽形蟲體，初步診斷紅細(xì)胞內(nèi)含有羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體（圖1）。

圖1 血液涂片吉姆薩染色鏡檢結(jié)果（1000×）Fig.1 Microscopic examination of Giemsa stained blood smears (1000×)

2.2 雙重PCR方法擴(kuò)增 用羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體引物分別對羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體的DNA和混合感染DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示分別出現(xiàn)875 bp和394 bp特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

圖2 羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplication result of ovine and caprine theileriosis and AP

2.3 雙重PCR退火溫度的篩選 通過對不同退火溫度的篩選，結(jié)果顯示在56℃時，羊泰勒蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和嗜吞噬細(xì)胞無漿體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶均較亮（圖3），56℃為最佳退火溫度。

圖3 PCR 退火溫度的篩選試驗Fig.3 Screening test for annealing temperature

2.4 雙重PCR特異性試驗 將以羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體混合感染及單一感染的DNA、附紅細(xì)胞體、無漿體、弓形蟲和瑟氏泰勒蟲DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，羊泰勒蟲和無漿體混合感染和單一感染均可擴(kuò)增出預(yù)期條帶，而作為對照樣本均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)（圖4）。

圖4 特異性擴(kuò)增試驗Fig.4 The result of specif ic test

2.5 雙重PCR敏感性試驗 將混合感染羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體的抗凝血提取DNA，分光光度法測定DNA濃度，依次做10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖5）。檢測羊泰勒蟲DNA最低含量為16 fg/μL，嗜吞噬細(xì)胞無漿體的DNA最低含量為1 fg/μL。

圖5 敏感性試驗Fig.5 The result of sensitivity experiment

2.6 臨床樣本檢測 雙重PCR對60份羊血液樣本檢測顯示（表1），嗜吞噬細(xì)胞無漿體陽性率為13.33%（8/60），羊泰勒蟲陽性率46.67%，混合感染率為10%。血涂片鏡檢顯示，嗜吞噬細(xì)胞無漿體陽性率為6.67%，羊泰勒蟲陽性率15%，混合感染為5%，雙重PCR與血涂片鏡檢陽性符合率為100%。

表1 臨床樣品的檢測結(jié)果Table 1 Results of PCR assay for clinical samples

3 討論

目前，對羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體的病原檢測方法主要有血涂片方法和PCR方法[8-12]。血液涂片檢測很難與其他血液病原體區(qū)分診斷，且在感染早期，血液中的無漿體數(shù)量較少，不易通過血液涂片檢測到。血清學(xué)檢測對抗原和抗體要求較高，還需要篩選多種條件才能建立。分子生物學(xué)檢測中，熒光定量PCR雖然敏感性、特異性及準(zhǔn)確性較高，可以進(jìn)行定量分析，但存在試劑及實驗儀器昂貴的弊端，普通PCR方法因具有操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)分析。目前，對某種病原的檢測多采用單PCR方法，但一般只能檢測一種病原，臨床中當(dāng)多種病原發(fā)生混合感染時，應(yīng)用普通PCR需要多次擴(kuò)增篩選，費時費力，使檢測成本顯著增加。本試驗所建立的雙重PCR表明，該方法不但節(jié)約試劑、反應(yīng)時間，而且還具有高效、經(jīng)濟(jì)的特點，更適合在基層獸醫(yī)部門應(yīng)用。

羊泰勒蟲主要表面蛋白（major piroplasm surface proteins, MPSP）是泰勒蟲感染階段分泌的一種蛋白，是泰勒蟲特有的蛋白，具有較好的保守性[13]。嗜吞噬細(xì)胞無漿體選取了保守基因16S rRNA基因，這2種基因自身無特異性結(jié)合。試驗結(jié)果表明，無論是普通PCR還是雙重PCR擴(kuò)增除目的條帶外均無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，不出現(xiàn)交叉反應(yīng)。李宏旺等[14]對吉林省琿春牛嗜吞噬細(xì)胞無形體調(diào)查顯示，牛東方牛嗜吞噬細(xì)胞無形體陽性率為12.5%。應(yīng)用本試驗建立的雙重PCR方法對吉林省圖們市臨床60份綿羊血樣本檢測，結(jié)果顯示，羊嗜吞噬細(xì)胞無漿體陽性率為13.33%。進(jìn)一步證明嗜吞噬細(xì)胞無漿體在吉林省延邊地區(qū)流行，豐富了嗜吞噬細(xì)胞無漿體流行病學(xué)資料。綜上，本研究建立了一種可同時檢測羊泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體的雙重PCR方法，特異性、重復(fù)性好，操作簡便，可用于兩種病原體感染的快速鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查。