張 燕，董洪燕，于圣青，楊靜靜，吳 植，吳 雙，洪雙鵬，朱善元，邢 華

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.江蘇桂柳牧業(yè)集團有限公司，徐州 221000）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer, RA）是一種革蘭氏陰性、無芽孢桿菌，該菌主要引起雛鴨的急性或慢性、敗血性傳染病，以纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征，傳染性強，致死率高，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，已成為危害水禽養(yǎng)殖的最重要傳染病之一[1]。RA血清型復(fù)雜，迄今為止，世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的血清型有20多種，且不同血清型間交叉保護性較低[2]；我國發(fā)現(xiàn)的RA血清型大約10種，其中血清1型和2型被認為是主要的優(yōu)勢血清型[3]。

近年來，由于臨床治療中抗生素的不斷濫用，鴨疫里默氏桿菌對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，其耐藥譜也越來越廣泛，因此對鴨疫里默氏桿菌的耐藥性研究成為熱點。經(jīng)研究表明不同地區(qū)的RA分離株對抗生素的敏感性差異較大[4]，因此了解不同地區(qū)的RA耐藥性對準(zhǔn)確指導(dǎo)各地的臨床用藥具有重要意義。整合子是細菌耐藥性傳播的重要原因之一，目前已有學(xué)者證明RA中也存在整合子[5]，這使得RA的耐藥機制更加復(fù)雜。本研究將安徽地區(qū)分離鑒定的34株RA進行藥敏試驗以確定其耐藥表型，再根據(jù)耐藥表型選取相應(yīng)的耐藥基因和Ⅰ型整合子進行驗證，為了解臨床廣泛使用抗菌藥物與細菌多重耐藥性產(chǎn)生之間的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 34株鴨疫里默氏桿菌（AH1-AH34）分別分離自安徽省淮北市（3株），安徽省天長市（10株），安徽省宿州市（18株），安徽省蚌埠市（3株）不同養(yǎng)鴨場。

1.2 主要的試劑 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；TSB培養(yǎng)基購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；細菌微量生化鑒定管購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；2×TaqMaster Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

1.3.1 鴨疫里默氏桿菌的PCR鑒定 無菌取病死鴨肝臟、心臟及腦部等臟器，劃線于血平板，37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌生長情況以及菌落特征；再挑取疑似菌落，接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃條件下220 r/min振蕩培養(yǎng)18～24 h，運用鴨疫里默氏桿菌16S rRNA基因[6]對其鑒定后，送擎科生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。

1.3.2 革蘭氏染色鏡檢 挑取陽性菌株的典型菌落進行革蘭氏染色，具體步驟按珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供的說明書進行，最后鏡檢觀察細菌形態(tài)。

1.3.3 生化鑒定 選取20種常見生化鑒定管包括棉子糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、β-半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、西蒙氏枸櫞酸鹽、碳酸鹽（產(chǎn)氣）、色氨酸肉湯、VP、MR、硫化氫、賴氨酸、鳥氨酸和氧化酶，按照北京陸橋技術(shù)股份有限公司說明書要求將細菌接種于每個生化管中，37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)24～48 h，觀察顏色變化，再根據(jù)說明書中結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進行判定。

1.4 藥敏試驗 選取24種藥敏紙片包括甲氧芐氨嘧啶、頭孢曲松、氟苯尼考、克林霉素、氯霉素、頭孢噻吩、四環(huán)素、新霉素、頭孢拉定、阿奇霉素、紅霉素、氨芐西林、阿莫西林、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、磺胺異噁唑、利福平、諾氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、丁胺卡那、多粘菌素B、慶大霉素和大觀霉素。采用紙片擴散法將新鮮菌液涂布于血平板，將24種紙片貼在血平板上，37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)24～48 h，記錄抑菌圈大小，再根據(jù)杭州微生物試劑有限公司的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)進行判定耐藥株、中介、敏感株。

1.5 Ⅰ類整合子檢測 以34株RA分離株的基因組為模板，根據(jù)文獻[7]設(shè)計引物5'CS和3'CS（表1）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：2× PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 12 μL。Ⅰ類整合子5'CS/3'CS采用遞減PCR，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45s，61℃（每個循環(huán)降低1℃）復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，5個循環(huán)；94℃變性45 s，56℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。循環(huán)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。隨后將陽性片段經(jīng)膠回收試劑盒回收后，送測序，再通過NCBI中的BLASTn搜索進行DNA的同源性分析。

表1 耐藥基因引物序列Table 1 The primer sequence of drug resistance gene

1.6 氨基糖苷類耐藥基因檢測 參照文獻[7-12]設(shè)計并由賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成氨基糖苷類（aac(3)Ⅰ、aac(3)Ⅱ、aac(3)Ⅲ、aac(3)Ⅳ、aadB、strA-B、rmtA、rmtB、rmtC、aph(3')Ⅰa、aph(3')Ⅱa、aph(3')Ⅳ、aac(6')Ⅰb、aac(6')Ⅱ、armA）共15對耐藥基因引物，引物序列、退火溫度以及擴增產(chǎn)物大小詳見表1。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：2 ×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 12 μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s，退火（溫度見表1）45 s，72℃延伸45 s，共33個循環(huán)；最后再72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定

2.1.1 RA分離株的菌落形態(tài) 34株安徽地區(qū)RA分離株經(jīng)培養(yǎng)后在綿羊血平板長出表面光滑，半透明，有光澤，邊緣整齊的白色菌落（圖1A），其中2株有溶血現(xiàn)象（圖1B）。

圖1 RA 分離株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of RA isolates

2.1.2 PCR鑒定 運用16S rRNA基因鑒定鴨疫里默氏桿菌，均擴增出片段大小為750 bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期相符，經(jīng)序列比對分析確定為鴨疫里默氏桿菌。

圖2 RA 分離株的PCR 鑒定Fig.2 Identif ication of RA isolates by PCR

2.1.3 革蘭氏染色鑒定 34株安徽地區(qū)RA分離株經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡下觀察均為革蘭氏陰性、無芽孢、短小桿菌，以單個或成雙存在（圖3）。

圖3 部分RA 分離株革蘭氏染色鏡檢圖（1000×）Fig.3 Gram stained microscopic images of RA isolates(1000×)

2.1.4 生化鑒定 生化試驗鑒定結(jié)果顯示34株安徽地區(qū)RA分離株不發(fā)酵糖類及山梨醇、甘露醇，氧化酶試驗均為陽性，尿素酶試驗除了6株RA分離株結(jié)果為陽性，其余均為陰性，基本符合鴨疫里默氏桿菌的生化特性。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 34株鴨疫里默氏桿菌分離株對卡那霉素、慶大霉素耐藥性最強，為97.1%，其次是丁胺卡那、鏈霉素、阿奇霉素，為94.1%；對頭孢拉定完全敏感，其次分別對頭孢曲松（97.1%）、氟苯尼考（97.1%）、大觀霉素（94.1%）、磺胺異惡唑（91.2%）等抗生素較敏感（表2）。

表2 34 株RA 分離株對不同藥物的敏感性比例Table 2 The sensitivity ratio of 34 RA isolates to diff erent drugs

安徽地區(qū)34株鴨疫里默氏桿菌分離株有33株（97.06%）存在多重耐藥現(xiàn)象，且最高可達19種抗生素耐藥，其中耐14種抗生素的菌株比例最高，達24%（表3）。

表3 34 株RA 分離株的多重耐藥性Table 3 The multidrug resistance of 34 RA isolates

2.3 Ⅰ型整合子基因盒和氨基糖苷類耐藥基因檢測結(jié)果 經(jīng)檢測，34株鴨疫里默氏桿菌分離株均攜帶Ⅰ類整合子，其基因盒大小為1 kb（圖4），經(jīng)測序比對分析表明其攜帶aadA1（鏈霉素耐藥基因）。

圖4 34 株RA 分離株Ⅰ類整合子PCR 鑒定圖Fig.4 Identif ication of class I integrons to 34 RAisolates by PCR

34株RA分離菌進行15種氨基糖苷類耐藥基因檢測，分別檢出aac(6')Ⅰb基因（32/34）、aac(6')Ⅱ基因（28/34）、rmtC基因（25/34），aph(3')Ⅱa基因（24/34）；其余11種耐藥基因均未能檢測到（圖5）。

圖5 aac(6')Ⅰb 基因（A）、aac(6')Ⅱ基因（B）、rmtC 基因（C）和aph(3')Ⅱa 基因基因（D）PCR 鑒定圖Fig.5 aac(6') I b gene (A), aac(6') II gene (B), rmtC gene (C) and aph(3') II a gene (D) PCR identif ication results

34株RA分離株攜帶氨基糖苷類耐藥基因譜情況表明（表4）：所有分離株均攜帶aadA1耐藥基因；攜帶2種耐藥基因的為2株，占5.88%；攜帶3種耐藥基因的為10株，占29.41%；攜帶4種耐藥基因的為1株，占2.94%；攜帶5種耐藥基因的為21株，占61.76%。

表4 34 株RA 分離株氨基糖苷類耐藥基因攜帶情況Table 4 Carrying status of aminoglycoside resistance genes to 34 RA isolates

34株RA分離株經(jīng)氨基糖苷類抗生素（大觀霉素、新霉素、鏈霉素、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素）耐藥表型和耐藥基因（aac(6')Ⅰb、aac(6')Ⅱ、rmtC、aph(3')Ⅱa、aadA1）符合率對比可知（表5），aadA1基因與這6種抗生素的符合率高達100%，其次aac(6')Ⅰb基因、aac(6')Ⅱ基因、rmtC基因、aph(3')Ⅱa基因與這6種抗生素的符合率分別大于90%、80%、70%、 69%。

表5 34 株RA 分離株氨基糖苷類藥物耐藥表型和耐藥基因符合率Table 5 Aminoglycoside drug resistance phenotype and drug resistance gene coincidence rate of 34 RA isolates

3 討論

近幾年鴨疫里默氏桿菌病在全國各地均有報道，已成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一。目前臨床多以藥物治療為主，但因抗生素的濫用，造成鴨疫里默氏桿菌多重耐藥性更加普遍。經(jīng)研究表明，廣東RA分離株對阿莫西林、青霉素的耐藥率最高，對頭孢唑啉、大觀霉素和氟苯尼考較為敏感[14]；湖北RA分離株對頭孢噻肟、大觀霉素和阿米卡星敏感性比較高，對新霉素和諾氟沙星耐藥性最強[15]。本試驗對2020年安徽地區(qū)分離的34株RA進行耐藥性的分析，結(jié)果表明34株分離株對氨基糖苷類（卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那、鏈霉素、新霉素）和大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素）藥物耐藥性最高，對頭孢類（頭孢曲松、頭孢拉定）和氯霉素類（氟苯尼考）最為敏感，這與程冰花等[16]對2017—2018年安徽地區(qū)分離株的研究結(jié)果一致；但安徽各地區(qū)之間（淮北市、蚌埠市、天長市以及靈璧市）RA分離株耐藥譜卻不同，其最高耐抗生素種類也不一致，分別為9種、10種、10種、18種，這可能與安徽各地區(qū)臨床用藥種類不一致有關(guān)。因此，不同地區(qū)的RA的耐藥性呈現(xiàn)區(qū)域性，臨床防治時要因地制宜，加強用藥指導(dǎo)，合理使用抗生素，防止耐藥性的傳播。

養(yǎng)殖場的用藥習(xí)慣以及抗生素濫用是導(dǎo)致RA耐藥性增強的重要原因，但也有研究表明這可能與其所攜帶的整合子結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]。整合子是細菌固有結(jié)構(gòu)之一，它可通過捕獲自然界的外源基因來豐富自身基因的多樣性，同時可將耐藥基因水平傳播至其他細菌，造成耐藥性的擴散[18]。根據(jù)整合子的結(jié)構(gòu)差異可將其分為Ⅰ類整合子、Ⅱ類整合子、Ⅲ類整合子、移動整合子和超級整合子五大類，其中Ⅰ類整合子最為常見，廣泛存在于革蘭氏陰性菌中。2009年仲崇岳等[19]檢測77株RAⅠ～Ⅲ類整合子，其中Ⅰ類整合子檢出率61%，攜帶4種不同類型耐藥基因盒，Ⅱ類和Ⅲ類整合子均未檢測到。2012年，Sun等[20]在華南地區(qū)103株RA中檢出攜帶aadA2和aac(6)Ⅱ-catB3-aadA1基因盒的Ⅰ類整合子。2014年蔡秀磊等[21]對浙江省22株RA進行Ⅰ類整合子檢測，陽性率為100%，1株攜帶aadA5耐藥基因盒，21株攜帶aac(6)Ⅱ-catB3-aadA1耐藥基因盒。本研究對2020年安徽地區(qū)分離的34株RA分離株進行Ⅰ類整合子檢測，陽性率為100%，所攜帶的耐藥基因盒均為addA1（介導(dǎo)鏈霉素耐藥），分離株攜帶相同的耐藥基因盒可能是由于同一地區(qū)的菌株其耐藥基因盒相互傳播所致，傳播范圍較大，但耐藥基因盒的類型仍單一。

細菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥機制主要包括：產(chǎn)生修飾酶（鈍化酶）修飾抗生素結(jié)構(gòu)；通過核糖體修飾影響細菌對抗生素的結(jié)合；改變細胞膜通透性減少體內(nèi)藥物蓄積；外排泵系統(tǒng)的主動外排作用[22]。國內(nèi)對RA耐藥基因的研究報道中，多與鈍化酶基因有關(guān)，且檢出率較高[23-24]。34株分離株攜帶的氨基糖苷類耐藥基因與臨床耐藥表型符合率均大于69%，因此兩者表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，總體表現(xiàn)出一致性；但也發(fā)現(xiàn)所有菌株均含有aadA1基因，仍出現(xiàn)分離株對鏈霉素敏感的表型，這表明鴨疫里默氏桿菌的的耐藥機制復(fù)雜，其耐藥性可能與本身所攜帶的耐藥基因、整合子結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)，也有可能是這些因素共同作用的結(jié)果。本研究通過對15種氨基糖苷類耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)三種鈍化酶基因aac(6')Ⅰb（94.1%）、aac(6')Ⅱ（82.4%）、aph(3')Ⅱa（70.6%）和16S甲基化酶基因rmtC（73.5%）；經(jīng)研究表明三種鈍化酶基因均有耐慶大霉素的特性，同時aac(6')Ⅰb基因也具有耐卡那霉素特性[25]，這與本研究慶大霉素和卡那霉素的耐藥表型結(jié)果相符；16S rRNA甲基化酶作為一種新型耐藥機制，常在革蘭氏陰性菌中發(fā)揮作用，編碼這種酶的基因多位于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子上，與整合子一樣易于傳播擴散[26]，本研究中安徽地區(qū)25株分離株均攜帶16S rRNA甲基化酶基因rmtC的菌株，或?qū)⒃诃h(huán)境中廣泛傳播，需引起警惕。另外，經(jīng)本研究表明安徽省各地區(qū)（淮北市、蚌埠市、天長市以及靈璧市）RA分離株均含有aac(6')Ⅰb-aac(6')Ⅱ-rmtCaph(3')Ⅱa-aadA1，其余氨基唐苷類耐藥基因譜分布卻不一樣；其耐藥表型和基因型符合率也不一致，分別為≥50%、66.7%、90%、50%；因此，安徽省不同地區(qū)的耐藥基因型也呈現(xiàn)地區(qū)性，加強安徽省不同地區(qū)RA分離株的耐藥表型和基因型的鑒定，及時了解兩者的符合率，對該病的后期的臨床用藥以及探究其多重耐藥性提供依據(jù)。此外，本研究也對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（ermA、ermB、ermC、ermF）、喹諾酮類耐藥基因（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqXA、oqXB）、林可酰胺類耐藥基因（linA）鑒定，結(jié)果34株分離株未檢出，我們后續(xù)也會對34株安徽分離株進行全基因組測序進一步確認不同類型的耐藥基因分布情況，為該病的防治以及探究鴨疫里默氏桿菌耐藥表型以及耐藥基因型之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。