康龍山，于慧茹，楊德全，李 鑫，沈海瀟，楊顯超，王 建，徐麗娜，葛菲菲

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056009；2.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一種急性接觸性傳染病，主要引起仔豬發(fā)病，感染部位在小腸。臨床特征為急性衰弱性腹瀉、脫水、嘔吐和高死亡率[1]。1971年，英國首次出現(xiàn)了PED在育肥豬中暴發(fā)的報(bào)道，該病與傳染性胃腸炎極為相似，但對(duì)4～5周齡仔豬進(jìn)行致病性研究后發(fā)現(xiàn)，該病與已經(jīng)報(bào)道的TGEV的臨床癥狀不同[2]。1978年，比利時(shí)根特大學(xué)的科學(xué)家從當(dāng)?shù)匕l(fā)病豬場中分離出1株該病毒，并命名為CV777[3]。2010年以后，PED在中國各省開始廣泛流行，仔豬死亡率高達(dá)80%～100%，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)[4]。PED還出現(xiàn)在韓國[5]、日本[6]等亞洲其他國家。2013年，PED首次在美國暴發(fā)，僅在一年內(nèi)造成了美國國內(nèi)約10%的豬只死亡，總計(jì)約700萬頭，隨后PED傳播到加拿大和墨西哥等美國周邊國家[7]。目前為止，PEDV已經(jīng)成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一[8]。

PEDV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），甲型冠狀病毒屬（Al-phacoronavirus），基因組全長約28 kb，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白），4種非結(jié)構(gòu)蛋白（1a、1b、3a、3b）[9]。S蛋白是由1383個(gè)氨基酸組成的位于病毒粒子表面的Ⅰ型膜糖蛋白，由S1蛋白和S2蛋白組成[10]，S1蛋白的主要功能是識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞受體，同時(shí)與病毒毒力有關(guān)；S2蛋白主要介導(dǎo)病毒感染過程中的細(xì)胞膜融合過程[11]。S蛋白在誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生方面起到重要作用[12]，通過S蛋白基因組分析可以了解PEDV的流行特點(diǎn)和毒株的遺傳變異情況，同時(shí)在疫苗研發(fā)過程中起到重要作用。PEDV目前分為兩個(gè)基因群，GⅠ群和GⅡ群，GⅠ群分為GⅠ-a和GⅠ-b亞群，GⅡ群分為GⅡ-a、GⅡ-b、GⅡ-c亞群。自2010年10月以來，PEDV在我國多個(gè)省份流行，并隨時(shí)間不斷發(fā)生變異，給我國PEDV防控帶來更大的挑戰(zhàn)[1]。趙攀登等[13]對(duì)2017—2018年河南省8個(gè)規(guī)?；i場采集的部分PEDV陽性樣本的S基因序列分析發(fā)現(xiàn)，與CV777分處于不同基因群，同源性低。王娜等[14]分離出1株P(guān)EDV上海株，對(duì)其進(jìn)行基因序列分析后發(fā)現(xiàn)與國外毒株和CV777等經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。楊丹嬌等[15]對(duì)2018年1～12月份采集的甘孜州12個(gè)藏豬養(yǎng)殖場的144份腹瀉樣本中獲得了7株P(guān)EDV毒株完整的S基因，分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)S蛋白的核苷酸在重要位點(diǎn)發(fā)生突變，7株毒株的S基因在G1群和G2群之間形成亞群，可能代表兩種新的基因型。以上研究表明了我國PEDV的復(fù)雜性。本研究對(duì)上海某豬場暴發(fā)的PEDV進(jìn)行了病毒檢測及全基因序列分析，以期為上海地區(qū)PEDV的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源 樣品來源于上海某規(guī)?；i場，發(fā)病豬為產(chǎn)房3～5日齡仔豬。臨床癥狀為嚴(yán)重腹瀉、精神沉郁、脫水、消瘦。對(duì)死亡仔豬進(jìn)行病理剖檢，主要病理變化有小腸脹氣，腸壁變薄，腸系膜充血，腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸內(nèi)有黃色液體。采集發(fā)病仔豬糞便樣本共4份用于后續(xù)檢測。

1.2 主要試劑 PEDV、TGEV和ROTA熒光RT-PCR試劑盒均購自廣州維伯鑫生物科技股份有限公司；核酸提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司。

1.3 樣品處理 分別稱取0.5g糞便樣本置于4個(gè)1.5 mL滅菌離心管中，每管加入1 mL無菌PBS后混勻，在4℃條件下8000 ×g離心2 min，取上清液100 μL于新的1.5 mL滅菌離心管中備用。

1.4 核酸提取 核酸提取按照試劑盒說明書步驟操作。取96孔板，A1～A4孔中加入10 μL磁珠-蛋白酶k混合液、90 μL Buffer MLB和50 μL上清液；B1-B4孔中加入150 μL Buffer MW1；C1-C4和D1-D4孔中加入150 μL Buffer MW2；E排、F排和G排為空白孔，H1-H4孔加入50 μL ddH2O，使用核酸提取儀提取核酸，整個(gè)過程需要23 min。

1.5 熒光PCR檢測 參照試劑盒說明書進(jìn)行PCR檢測。將PEDV、TGEV、RV反應(yīng)液20 μL和酶液1 μL分別加入PCR反應(yīng)管后，分別加入提取的4份核酸樣本、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各4 μL，混勻后使用熒光PCR儀進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件為：42℃ 20min；95℃10 min；94℃ 15s，55℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。

1.6 基因組氨基酸同源性比較 借助MegAlign分析軟件，將毒株編碼蛋白氨基酸序列與對(duì)應(yīng)的疫苗株編碼蛋白氨基酸的序列對(duì)齊后，使用Lipman-Pearson方法對(duì)毒株與疫苗株CV777和AJ1102的結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸做同源性比較。

1.7 全基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析 樣本RNA送上海探普生物科技有限公司進(jìn)行二代測序：使用隨機(jī)六聚體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用DNA酶處理和清除之后，然后進(jìn)行第二鏈合成，使用Nextera XT試劑（Illumina）進(jìn)行文庫制備，并在NovaSeq 6000（Illumina）上進(jìn)行測序。測序完成后，將該病毒全基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫。使用MEGA3.1分析軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）對(duì)全基因和S基因進(jìn)行序列對(duì)比，Bootstrap計(jì)算進(jìn)行1000次重復(fù)，構(gòu)建全基因和S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光PCR檢測結(jié)果 采用仔豬糞便樣本進(jìn)行熒光RT-PCR檢測，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線為陽性；檢測通道35＜Ct值≤38，為可疑建議重復(fù)檢測；樣本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值為陰性。結(jié)果顯示：TGEV、RV檢測為陰性，PEDV檢測為陽性。陽性對(duì)照Ct值為25.767；1～4號(hào)樣本的Ct值分別為16.563、 16.019、20.963、22.452（圖1）。

圖1 PEDV 熒光RT-PCR 檢測結(jié)果Fig.1 The results of PEDV real-time RT-PCR detection

2.2 CMMZH2110全基因組測序結(jié)果 對(duì)毒株進(jìn)行二代測序后拼接成全基因組，上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號(hào)為OL347994），該毒株命名為CMMZH2110。結(jié)果顯 示：CMMZH2110基因組全長28 038 bp，包括以下基因：5'UTR（nt 1-292）、ORF1a（nt 293 ～12601），ORF1b（nt12601～20637）、S（nt 20634～24794）、ORF3（nt 24794～25468）、E（nt 25449～25679）、M（nt 25687～26367)）、N（nt 26379～27704）、3'UTR（nt 27705～28038）。

2.3 氨基酸同源性比較 將CMMZH21110所有結(jié)構(gòu)蛋白與疫苗株CV777和AJ1102做同源性比較，結(jié)果可知，CMMZH2110與CV777的S蛋白同源性最低，為91.9%；與M蛋白的同源性最高，為97.3%；E蛋白和N蛋白的同源性分別為94.7%和97.1%。CMMZH2110與AJ1102的E蛋白同源性最低，為97.4%；M蛋白的同源性最高，為99.1%；S蛋白和N蛋白的同源性分別為97.8%和97.5%（表1）。結(jié)果表明，毒株CMMZH2110與疫苗株CV777的結(jié)構(gòu)蛋白同源性較低，與AJ1102的同源性整體高于CV777。

表1 CMMZH2110 編碼蛋白的氨基酸同源性比較Table 1 The Comparison of amino acid homology of CMMZH2110 encoding protein

2.4 CMMZH2110全基因組及S基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 參考文獻(xiàn)[18]中使用的近年來全球部分國家的PEDV流行株，繪制PEDV全基因及S基因進(jìn)化樹。全基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果可知：CMMZH2110全基因與中國西南地區(qū)毒株MH061339CH/SCA210/2017、福建毒株XM2-4和上海毒株shxx1902（本課題組之前在上海某豬場分離到的1株P(guān)EDV毒株）親緣關(guān)系最近，和來自美國的毒株OH851屬于一個(gè)群，都屬于GⅡ-c亞群。CV777原代株屬于GⅠ-a亞群，CV777疫苗株屬于GⅠ-b亞群，中國目前使用的疫苗株AJ1102屬于GⅡ-b亞群（圖2）。S基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示（圖3），CMMZH2110S基因與中國毒株CH HNLB2017、CH HNPJ2017親緣關(guān)系最近，與AJ1102同屬于GⅡ-b亞群，但不在同一支上，與CV777不在同一個(gè)亞群。結(jié)果表明，毒株CMMZH2110全基因和S基因均與CV777和AJ1102親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于新型流行毒株。

圖2 CMMZH2110 全基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the complete genome sequence of CMMZH2110

圖3 CMMZH2110 S 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the S gene sequences of CMMZH2110

3 討論

中國是養(yǎng)豬大國，近年來，PEDV在我國各省均有暴發(fā)，已成為我國養(yǎng)豬業(yè) 的巨大威脅[16]。PEDV可導(dǎo)致各年齡段的豬群發(fā)病，對(duì)7日齡以下仔豬的危害最大[17]。目前對(duì)PEDV的防控主要以疫苗免疫為主，近年來我國PED V多發(fā)生變異，傳統(tǒng)疫苗株難以提供好的保護(hù)，準(zhǔn)確分析當(dāng)?shù)亓餍卸局甑姆肿由飳W(xué)特性，根據(jù)毒株流行特點(diǎn)開發(fā)針對(duì)性的疫苗至關(guān)重要。上海某豬場暴發(fā)的仔豬腹瀉，產(chǎn)房3～5日齡仔豬出現(xiàn)腹瀉、脫水和死亡，發(fā)病率為30%～50%，死亡率為20%～30%。采集病死仔豬的腸道組織及內(nèi)容樣本進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示PEDV呈陽性。豬場此前使用了大北農(nóng)活疫苗進(jìn)行過免疫，但是仍然出現(xiàn)PEDV暴發(fā)，排除疫苗質(zhì)量、接種方式等人為因素，提示原因可能是由于疫苗與毒株基因型不匹配引起的。

按照Wang等[18]對(duì)PEDV基因群的劃分方法，對(duì)毒株進(jìn)行全基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，我們的基因進(jìn)化結(jié)果與上述參考文獻(xiàn)一致。CMMZH2110屬于GⅡ-c亞群，與本課題組在上海另一豬場分離到的毒株shxx1902屬于同一亞群。全基因和S基因均與CV777分屬于不同亞群，S基因與中國目前使用的疫苗株AJ1102同屬于一個(gè)亞群，但是全基因分屬于不同亞群。Guo等[19]研究表明，GⅡ-c亞群病毒屬于嵌合病毒，CMMZH2110全基因組屬于GⅡ-c亞群，S基因?qū)儆贕Ⅱ-b亞群，符合嵌合病毒特點(diǎn)，提示CMMZH2110可能是由不同亞群之間的病毒重組產(chǎn)生的。S基因序列對(duì)比分析顯示，CMMZH2110與AJ1102屬于同一亞群，但不屬于同一分支，S蛋白同源性為97.8%，與CV777不在同一亞群，S蛋白同源性為91.9%，與二者的同源性都不高。大多數(shù)PEDV的S1基因比S2基因更易突變，多作為遺傳進(jìn)化分析和疫苗研發(fā)的目標(biāo)蛋白[20]。研究上海地區(qū)PEDV流行毒株的S基因的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，可為上海地區(qū)PEDV科學(xué)防控提供理論支持。

分析表明PEDV新基因型在上海地區(qū)出現(xiàn)，今后如何對(duì)PEDV進(jìn)行有效防控，可從以下幾方面進(jìn)行：首先，加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)控和分子生物學(xué)特性研究，及時(shí)對(duì)母豬進(jìn)行與流行 毒株匹配的疫苗免疫。其次要保證產(chǎn)房的溫度處于穩(wěn)定，為仔豬和母豬提供適宜的環(huán)境。再次，母豬在妊娠階段使用微生態(tài)制劑飼喂，保證母豬腸道健康，提高母豬整體的健康狀況，使母豬可以分泌更多乳汁，仔豬可以獲得更多的母源抗體。最后，分娩豬舍不同的豬舍間糞污分開，及時(shí)清空和消毒，并留出足夠的空欄時(shí)間，防止病毒的循環(huán)傳播。