余才翰,李 岱,謝 敏

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2020年全球新發(fā)癌癥病例1 929萬例,其中乳腺癌新增人數(shù)達(dá)226萬,成為全球第一大癌癥[1]。癌癥不僅是一種遺傳疾病,更是一種代謝疾病[2],線粒體作為能量代謝的主要細(xì)胞器,在腫瘤發(fā)生、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[3]。線粒體功能受損可顯著降低腫瘤細(xì)胞增殖和致瘤能力[4]。研究[5]表明,線粒體DNA缺失的小鼠無法形成腫瘤。

葛根素是從葛根屬豆科植物中提取的一種黃酮類分子,具有抗腫瘤活性。葛根素可阻斷核因子-κB p65 (NF-κB p65)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk)抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和黏附[6],還可通過降低葡萄糖代謝誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞線粒體依賴性凋亡[7]。然而,葛根素在乳腺癌中的機(jī)制尚未明確,有待進(jìn)一步探索。該研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接預(yù)測葛根素的潛在靶點和分子途徑,通過體內(nèi)外實驗進(jìn)行驗證,為乳腺癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞HCC1806和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A均購自廣州吉尼歐生物科技有限公司。HCC1806細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中,MCF10A細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中。兩種培養(yǎng)基均含有10%胎牛血清、50 U/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素,并置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2實驗動物 20只雄性BALB/c裸鼠,SPF級,8周齡,體質(zhì)量20～25 g,購自湖北貝恩特生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2021-0027]。

1.1.3藥物、試劑與儀器 葛根素購于上海源葉生物科技有限公司(批號:B20446)。RPMI-1640培養(yǎng)基(批號:8121368)、DMEM培養(yǎng)基(批號:8123037)購自美國Gibco公司,DMSO(批號:ST038)購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。CO2培養(yǎng)箱(新加坡藝思高科技有限公司),超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司),顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)收集 通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)收集乳腺癌和正常乳腺組織數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)集編號為GSE42568;收集線粒體疾病與對照組數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)集編號為GSE42986。在線GEO2R分析差異性表達(dá)基因。使用韋恩圖分析乳腺癌與線粒體數(shù)據(jù)集之間的重疊基因。對重疊基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析,使用STRING數(shù)據(jù)庫分析重疊基因的相互作用網(wǎng)絡(luò),使用Cytoscape可視化重疊基因相互作用網(wǎng)絡(luò),并通過介數(shù)中心篩選核心基因。GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)在線分析樞紐基因在乳腺癌患者中的差異性表達(dá)。Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)下載對相關(guān)蛋白的乳腺癌和正常乳腺組織的免疫組化染色圖像。

1.2.2CCK-8細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞,以每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板(Corning,USA)中。然后,用不同濃度的葛根素(0、3、10和30 mol/L)處理細(xì)胞。處理24 h后,向每個孔中加入10 μl CCK-8試劑,然后培養(yǎng)2 h,利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度。

1.2.3細(xì)胞劃痕實驗 取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞,以每孔5×105個細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)箱中孵育24 h,融合率達(dá)到90%左右,用 20 μl無菌槍頭在孔內(nèi)垂直橫線劃痕,用 PBS洗除脫落細(xì)胞后,加入葛根素含1%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并在0、24 h顯微鏡下觀察各孔并拍照,每組實驗重復(fù)3次及以上。用 Image J 軟件測量劃痕面積,用 Graphpad Prism8軟件分析實驗結(jié)果。

1.2.4Transwell細(xì)胞遷移侵襲實驗 將含5×104個細(xì)胞的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基200 μl加入上室,在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,在37 ℃條件下細(xì)胞浸潤24 h。4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,再用結(jié)晶紫染色15 min,PBS洗滌3次,用棉簽去除上室細(xì)胞,顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5EdU細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞,以每孔5×103個細(xì)胞接種于24孔板,培養(yǎng)約24 h后葛根素干預(yù)。配制EdU工作液,等體積混合孵育2 h,去除培養(yǎng)液,PBS洗滌2次。免疫染色固定液室溫固定15 min,去除固定液,PBS洗滌2次,免疫染色強(qiáng)力通透液室溫孵育15 min,去除通透液,PBS洗滌2次。加入配制好的Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min,吸除反應(yīng)液,PBS洗滌2次。加入預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液,用含DAPI抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6TUNEL細(xì)胞凋亡實驗 葛根素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,免疫染色固定液固定30 min。PBS清洗2次,含0.3% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞,室溫孵育5 min。PBS洗滌2次,用50 μl TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次,加入預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液,用含DAPI抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7線粒體膜電位水平檢測 Mito-Tracker Red CMXRos是一種紅色線粒體特異性探針,用于檢測線粒體膜電位。取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞,以每孔5×103個細(xì)胞接種于24孔板,培養(yǎng)約24 h后葛根素干預(yù)。去除細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,加入配制好的工作液,37 ℃避光孵育30 min。去除工作液,PBS洗滌2次,加入預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液,用含DAPI抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8乳腺癌裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建及處理 本研究中所有動物實驗均經(jīng)湖北科技學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:2022-03-042),并按照當(dāng)?shù)睾蛧H的動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。雄性裸鼠在SPF級無菌動物室適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。取對數(shù)期生長乳腺癌細(xì)胞消化離心后重懸,最終細(xì)胞濃度為4×106個/μl。裸鼠深度麻醉后,于裸鼠背部皮下注射接種,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型。當(dāng)腫瘤平均體積約為50 mm3時,將裸鼠隨機(jī)分為對照組、葛根素給藥組。給藥組每日腹腔注射葛根素(按20 mg/kg給藥),對照組每日腹腔注射等量生理鹽水。14 d后處死小鼠,剝離瘤體計算體積,計算公式如下:體積=a×b2/2 (a=長,b=寬,單位為mm)。

1.2.9免疫組化實驗 瘤體組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋,制作石蠟切片(4 μm),脫蠟,抗原修復(fù) 20 min,PBS 漂洗 3 次,每次 10 min,過氧化氫孵化 10 min,PBS 漂洗 3 次, 每次 10 min,封閉液封閉 1 h,Ⅰ 抗(1 ∶100)孵育過夜,PBS 清洗3次,每次10 min,Ⅱ抗(1 ∶1 000)孵育 1 h,PBS 清洗3次, 每次10 min,DAB染色5 min,PBS清洗,蘇木精染色5 min,PBS 清洗,脫水、透明,中性樹脂封片,熒光顯微鏡下觀察拍片。

1.2.10分子對接 分子對接PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載DST(ID為5YNV)結(jié)構(gòu);Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載葛根素二維(2D)結(jié)構(gòu);ChemBio3D優(yōu)化葛根素;Autodock_vina將葛根素分別與DST對接;OpenBabel(v2.3.1)39分離文件,添加氫鍵并分配可旋轉(zhuǎn)鍵和電荷;PDBQT進(jìn)一步對接;PyMOL可視化對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及線粒體相關(guān)基因差異性表達(dá)分析乳腺癌數(shù)據(jù)集GSE42568包含9 667個差異性表達(dá)基因(圖1A),線粒體疾病數(shù)據(jù)集GSE42986包含256個差異性表達(dá)基因(圖1B),兩個數(shù)據(jù)集的重疊基因共132個(圖1C)。使用GO和KEGG富集分析對132個重疊基因分析。GO功能富集分析得到生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三方面的注釋和分類,將排名前8的條目繪制柱狀圖,結(jié)果見圖1D。KEGG通路富集篩選出3條信號通路,結(jié)果見圖1E。

圖1 乳腺癌和線粒體疾病相關(guān)基因分析

2.2 乳腺癌線粒體差異性表達(dá)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心基因分析將乳腺癌線粒體差異性表達(dá)基因相互作用在線分析并可視化,篩選出10個核心基因,結(jié)果見圖1F。GEPIA分析10個核心基因在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1 085 例乳腺癌患者中,DST在乳腺癌組織中蛋白水平呈低表達(dá),見圖2A。同時,HPA數(shù)據(jù)庫查詢到DST在免疫組化染色圖像中乳腺癌組織呈現(xiàn)更低的陽性率,見圖2B。分子對接結(jié)果顯示,葛根素可與DST蛋白的60位精氨酸、207位谷氨酸和277位天冬氨酸結(jié)合,結(jié)合能量為-9.2 kcal/mol,見圖2C。同時,免疫印跡結(jié)果顯示,DST蛋白的相對表達(dá)量給藥組(1.55±0.13)顯著高于對照組(1.00±0.05)(t=-6.74,P<0.05,n=3),見圖2D。

圖2 DST與乳腺癌的相關(guān)性分析

2.3 葛根素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖CCK-8法檢測結(jié)果顯示,在3～30 μmol/L時葛根素對正常乳腺上皮細(xì)胞存活沒有顯著影響,但明顯抑制乳腺癌細(xì)胞存活,并隨著葛根素的濃度增大乳腺癌細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05),IC50=14.51 μmol/L,后續(xù)給藥濃度選擇10 μmol/L,見圖3A。EdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,EdU陽性細(xì)胞給藥組(0.30±0.07)顯著少于對照組(0.73±0.07)(t=10.05,P<0.05,n=3),見圖3B。

圖3 葛根素對乳腺癌細(xì)胞存活率和增殖的影響

2.4 葛根素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲Transwell實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,給藥組細(xì)胞遷移穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05),見表1和圖4A。劃痕實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,給藥組24 h后劃痕距離顯著增寬(P<0.05),見表1和圖4B。

表1 葛根素對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

圖4 Transwell和細(xì)胞劃痕實驗分析葛根素對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.5 葛根素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡TUNEL實驗結(jié)果顯示,乳腺癌細(xì)胞經(jīng)葛根素處理48 h后,凋亡率明顯增加(P<0.05),見表2、圖5A。同時免疫印跡實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,給藥組顯著增加凋亡因子Cleaved-Caspase3和Bax的表達(dá)水平,并下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)(P<0.05),見表2、圖5B。

表2 葛根素對乳腺癌細(xì)胞凋亡水平的影響

圖5 TUNEL和免疫印跡分析葛根素對細(xì)胞凋亡的影響

2.6 葛根素降低線粒體功能Mito-Tracker Red 法檢測線粒體膜電位,結(jié)果顯示,葛根素處理后,與對照組(1.00±0.06)相比,給藥組(0.53±0.70)的相對熒光強(qiáng)度明顯減弱(t=9.16,P<0.05,n=3),見圖6。

圖6 葛根素對線粒體膜電位的影響 ×60

2.7 葛根素對乳腺癌移植瘤的影響HCC1806 細(xì)胞皮下異種移植瘤,連續(xù)給藥 14 d,與對照組相比,給藥組顯著減慢腫瘤的生長(P<0.05) ,見表3和圖7A。免疫組化顯示葛根素連續(xù)給藥14 d后,給藥組瘤體組織中DST陽性細(xì)胞明顯增加(P<0.05),見表3和圖7B。

表3 葛根素對乳腺癌皮下異種移植瘤體積以及瘤體組織DST表達(dá)的影響

圖7 葛根素對乳腺癌皮下異種移植瘤生長及對瘤體組織中DST表達(dá)的影響

3 討論

本研究顯示葛根素可能通過結(jié)合DST抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲,同時誘導(dǎo)其凋亡。DST是一種獨特的具有磷酸化酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì),是多種癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵蛋白質(zhì),并與不良臨床結(jié)果相關(guān)。DST的表達(dá)與肝癌、非小細(xì)胞癌、腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌以及乳腺癌患者的生存相關(guān)[8]。6.4%的肺癌患者據(jù)報告存在DST基因改變,DST基因組擴(kuò)增的患者表現(xiàn)出較差的生存率[9]。DST可通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移并增加隨后的化療耐藥性[10]。DST低表達(dá)也可增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶14表達(dá),并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲,并增加體內(nèi)的致瘤性[11]。DST基因突變通過激活ERK1/2和 MMP2/9信號通路,促進(jìn)單發(fā)纖維性腫瘤/血管外皮細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。在慢性化療藥物治療存活的三陰性乳腺癌患者的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DST的表達(dá)量明顯高于未治療組[13]。因此,DST可作為癌癥治療的一個有效靶標(biāo)。

DST的穩(wěn)定與線粒體的完整性密切相關(guān),從而維持有效的線粒體形態(tài)和生理功能。DST過表達(dá)可在應(yīng)激條件下抑制線粒體磷酸化解偶聯(lián),減少ATP形成,引發(fā)線粒體功能障礙及線粒體適用性降低,從而抑制肺癌的進(jìn)展[9]。DST可激活線粒體動力相關(guān)蛋白1介導(dǎo)的線粒體分裂,降低氧化磷酸化和糖酵解,從而促進(jìn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲性[14]。本研究表明葛根素可降低線粒體功能。因此,推測葛根素通過激活DST表達(dá)降低線粒體功能從而抑制腫瘤的進(jìn)程。

本研究創(chuàng)新點在于通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)篩選出核心基因DST,然后進(jìn)行體內(nèi)和體外實驗驗證DST在乳腺癌中的作用及可能機(jī)制,為后期研究乳腺癌治療方法提供了新思路和新靶點。然而,本研究未深入探討DST蛋白在乳腺癌中的作用機(jī)制,在后續(xù)研究中可將DST作為靶點采用藥理學(xué)方法激活或抑制其活性、病毒學(xué)方法過表達(dá)或敲降該基因,分析其下游信號的改變,從而闡明其在乳腺癌中的作用機(jī)制。

(致謝:感謝湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院胡美純博士在乳腺癌移植瘤實驗中提供的支持和幫助。)