王雅雯,程亞楠,楊 賓,蘇碧昊,徐 普

骨重建中新生血管生成主要涉及以內皮細胞為主的血管再生,血管內皮細胞作為血管再生的主要參與者,細胞的增殖、遷移和分化是骨再生的重要促進因素[1-2]。有研究[3-5]表明,在新生骨形成的微環(huán)境中,新生血管與骨組織之間相輔相成,內皮細胞分泌的血管內皮生長因子有利于骨重建的發(fā)生。自噬通過吞噬并溶解多余或受損的細胞器為細胞供能,是維持細胞正常生長發(fā)育的有利因素。雷帕霉素(rapamycin,Rapa)通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin,mTOR)達到激活細胞自噬的目的,是研究自噬較為成熟的自噬激活劑[6-7]。

課題組前期研究[8-9]結果表明,氧濃度的改變會影響成骨細胞的自噬活性,進而改變細胞的增殖和分化能力。但內皮細胞的自噬活性改變對局部成骨造成影響目前少見報道。該研究通過Rapa作用于人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立細胞自噬模型,探討Rapa上調HUVECs自噬對細胞增殖的影響,為后續(xù)血管再生與骨重建相關性研究提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HUVECs購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。Rapa購自美國MCE公司,人臍靜脈血管內皮細胞完全培養(yǎng)基購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(F-12K+0.1 mg/ml heparin+ECGS+10%FBS),PBS磷酸鉀緩沖液、青鏈霉素購自美國Gibco公司,微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)、unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase 1, ULK1)和mTOR一抗購自美國CST公司,Beclin1 一抗、GAPDH一抗、Goat Anti-Rabbit IgG二抗購自英國 Abcam公司,CCK-8試劑盒購自日本同仁公司,自噬染色檢測試劑盒(MDC法)、EdU-488細胞增殖檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和實驗分組 HUVECs常規(guī)培養(yǎng),每2 d換液1次。待細胞生長達合適密度時進行相關實驗。以正常培養(yǎng)(10%FBS培養(yǎng))為對照組,以10%FBS培養(yǎng)液中加入終濃度100 nmol/L的Rapa為實驗組,作用于HUVECs,3、6、12、24 h收集細胞進行實驗檢測。

1.2.2Western blot檢測自噬相關蛋白表達 細胞常規(guī)培養(yǎng),以50%的密度接種于10 cm2培養(yǎng)皿中,待細胞生長融合至85%時加入終濃度為100 nmol/L的Rapa分別處理3、6、12、24 h。加入RIPA細胞裂解液1 ml,4 ℃、12 140 r/min離心5 min,BCA蛋白定量后加上樣緩沖液,95 ℃蛋白變性5 min,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品加入4%～20%梯度膠上樣孔中,依次120 V恒壓50 min蛋白電泳,冰上300 mA恒流30 min轉膜,封閉后分別加入一抗LC3(1 ∶1 000)、Beclin 1(1 ∶3 000)、ULK1(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜;室溫下孵育二抗(1 ∶2 000和1 ∶10 000)1 h,化學發(fā)光1 min后拍照。Image J軟件進行灰度值測量,相對蛋白表達強度以目標條帶與內參蛋白的灰度比值表示。

1.2.3透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)檢測自噬小體 細胞處理24 h后取1 ml電鏡固定液加入皿中,室溫固定5 min,隨后細胞刮輕輕刮下細胞置于1.5 ml EP管,1 200 r/min離心3 min,加入新固定液1 ml,室溫固定30 min,4 ℃?zhèn)錅y。

1.2.4MDC法檢測自噬熒光表達 細胞常規(guī)培養(yǎng)后,以1×104/孔接種于24孔板中,24 h后吸凈培養(yǎng)液。每孔加入250 μl MDC染色液,培養(yǎng)箱避光孵育1 h;吸凈MDC染色液,使用Assay Buffer洗滌3次,更換新Assay Buffer,熒光顯微鏡下拍攝綠色熒光,熒光強度用Image J進行統計。

1.2.5CCK-8法檢測細胞增殖情況 細胞常規(guī)培養(yǎng)后,以1×104/孔接種于96孔板中,設置4個復孔,按實驗分組分別于3、6、12、24、48 h加入10 μl CCK-8液,37 ℃繼續(xù)孵育1 h,酶標儀450 nm測光密度(optical density, OD)值,計算抑制率,抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.6EdU檢測細胞增殖 細胞以2×104/孔接種于24孔板中,處理24 h;去除50%原培養(yǎng)基,加入等體積EdU工作液進行細胞標記;37 ℃繼續(xù)孵育細胞2 h;4%多聚甲醛室溫固定15 min,洗滌液洗3次;加入通透液室溫孵育15 min,洗滌液洗2次;每孔加入100 μl的Click反應液,室溫避光孵育30 min,洗滌液洗3次;每孔加入100 μl Hoechst 33342溶液,室溫孵育10 min進行細胞核染色,熒光倒置顯微鏡進行熒光檢測。Hoechst 33342為藍色熒光,EdU染色為綠色熒光。

1.2.7血管形成實驗檢測細胞管腔形成能力 Matrigel提前4 ℃過夜,所需槍頭、EP管及24孔板4 ℃過夜預冷。培養(yǎng)基和Matrigel配比2∶1配置實驗用膠,96孔板內加入50 μl/孔實驗用膠鋪膠,培養(yǎng)箱中固化。細胞消化離心后依據分組選用相對應的培養(yǎng)基進行重懸,2×104/孔加入細胞懸液,37 ℃培養(yǎng)箱靜置2 h后,觀察血管形成情況,并于最佳時間點進行拍照。

1.3 統計學處理應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析,結果以均數±標準差表示,組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用獨立樣本t檢驗,各組實驗均重復3次,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Rapa上調HUVECs自噬活性

2.1.1自噬蛋白表達上調 經過Rapa處理后,自噬蛋白相對蛋白表達高于對照組,自噬活性增強。LC3-II/LC3-I相對比值的蛋白表達在起始3 h時出現明顯升高(P<0.001),隨后蛋白表達強度減弱,但在作用的24 h時又明顯增強(P<0.001)。Beclin1的相對蛋白表達均高于對照組,最高值出現在作用后的6 h(P<0.001),而ULK1的相對蛋白量同樣呈現不斷升高的趨勢,最高值出現在作用后的24 h(P<0.001)。見圖1。

圖1 Western blot法檢測 Rapa 分別處理HUVECs 3、6、12、24 h后自噬蛋白表達水平

2.1.2自噬小體形成 TEM檢測觀察自噬小體形成情況,結果顯示,對照組和實驗組均可見自噬小體及自噬溶酶體,自噬體融合變成單層膜結構的自噬溶酶體,其內可見已溶解的細胞器,見圖2。

圖2 TEM觀察Rapa作用后自噬體形成

2.1.3自噬熒光表達增強 MDC法檢測結果顯示,經過Rapa處理的實驗組,HUVECs的自噬熒光表達較強,熒光強度為 15.706±2.776,高于對照組的8.782±2.310(F=0.162,P=0.029),見圖3。

圖3 MDC法檢測Rapa作用后自噬熒光表達 ×200

2.2 Rapa上調HUVECs自噬活性抑制細胞增殖

2.2.1HUVECs的增殖能力減弱 CCK-8法檢測結果顯示,隨著細胞培養(yǎng)時間延長,OD值不斷增加,在6 h前,實驗組與對照組OD值的差值雖隨著時長增大,但差異無統計學意義(P>0.05),見表1。與對照組相比,在處理24 h時細胞抑制率值最高,為(55.56±1.30)%(F=109.069,P=0.001)。見圖4。

表1 Rapa處理HUVECs后OD450值

圖4 CCK-8法檢測Rapa作用后細胞增殖抑制率

2.2.2增殖細胞減少 EdU法檢測結果顯示,實驗組可觀察到EdU綠色熒光細胞數減少,平均每視野(9±1)個,明顯低于對照組(21±3)個(F=1.160,P=0.001),見圖5。

圖5 EdU法檢測自噬上調后細胞增殖水平 ×200

2.3 HUVECs管腔形成能力減弱與對照組相比,實驗組未能很好地形成完整的管腔樣結構,管腔壁連續(xù)性破壞,出現殘缺、斷裂等表現,細胞血管形成能力減弱,見圖6。

圖6 血管形成實驗檢測自噬活性上調對HUVECs管腔形成的影響 ×100

3 討論

局部新生微血管作為影響種植區(qū)域良好骨結合的重要因素,是促進種植成功的關鍵基礎[10]。自噬是細胞生活的基礎,自噬活性的改變引發(fā)一系列的細胞功能變化,而過度的自噬則會抑制細胞生長[11]。細胞自噬的過程受自噬相關基因所調控,目前發(fā)現的自噬相關基因約31個,Beclin1是首個被學者所熟悉的關鍵自噬啟動基因,ULK1能促進Beclin1的磷酸化誘導自噬,而LC3是自噬體膜形成的關鍵蛋白[12]。因此,本研究通過Rapa誘導HUVECs構建自噬模型,探討HUVECs自噬活性改變對細胞增殖的影響,為骨修復材料促血管化提供一定的理論依據。

mTOR是一種調節(jié)細胞生長的絲氨酸蘇氨酸激酶,是細胞自噬活化的核心,mTOR信號通路是氧感受重要自噬信號通路,對細胞的生長、分化和增殖起著重要調控作用,Rapa通過降低mTOR的穩(wěn)定性和轉錄活性,上調細胞自噬活性[13-15]。既往研究[13,16-22]表明,Rapa作為mTOR蛋白的抑制劑能有效降低mTOR的表達,mTOR作為許多疾病,如卵巢癌、乳腺癌、肝損傷、視網膜病變、阿爾茨海默病及心血管疾病潛在治療靶點,在血管形成中起著重要的作用。ULK1是自噬啟動的關鍵因子,通過磷酸化Beclin1參與自噬體膜的延伸,同時也是mTOR的負調控蛋白[23]。本研究中,經Rapa處理HUVECs后ULK1表達上調,細胞自噬啟動,提示ULK1可能參與Rapa對HUVECs的自噬調控,但mTOR作為治療的靶點及ULK1在其中的調控作用可能需要更多的研究證據。

細胞受到外界刺激后由Beclin1啟動自噬反應,LC3由非脂質型的LC3-Ⅰ轉變?yōu)橹|型LC3-Ⅱ參與構成自噬小體雙層膜結構,進而包裹并溶解受損細胞器或衰老蛋白,釋放能量維持細胞穩(wěn)定[6,23]。本研究結果顯示,與對照組相比,Beclin1和LC3-Ⅱ 的蛋白表達升高,提示自噬已被激活,即Rapa能上調HUVECs的自噬活性。同時,透射電鏡和MDC自噬熒光檢測的結果也顯示,細胞胞質內可見自噬小體形成,自噬熒光表達增強,進一步證實Rapa能增強HUVECs自噬活性。這與其他學者關于Rapa能上調HUVECs的自噬活性的研究結果一致[20,24]。

自噬作為維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的重要因素,其活性的改變對細胞功能產生的影響已成為研究的焦點。眾多學者研究結果顯示,自噬活性改變對細胞功能的調控受疾病種類、治療方式以及種屬差異所影響。本課題研究的結果初步顯示,在一定的時間內,激活HUVECs 的自噬活性,細胞的增殖能力減弱,增殖受到抑制,同時細胞管腔形成能力降低。有研究提示,內皮細胞自噬活性對細胞增殖的調控具有雙面性,處理的方式、作用時間都是可能的影響因素。上調HUVECs 自噬活性能增強過氧化氫處理后細胞的增殖能力,而敲低GRB2關聯結合蛋白1(Grb2-associated binder1,GAB1)表達同樣如此[25-26],但缺血環(huán)境下,自噬活性的改變則對細胞增殖起反作用[27]。而在本研究中,Rapa作用48 h后,細胞的抑制率下調,其中的原因仍需要深入研究。

自噬是細胞選擇性降解過程,能消除異常積累的蛋白質和受損細胞器,增加細胞在低氧環(huán)境存活概率[28]。骨重建中新生血管生成是促進新骨形成的重要因素,自噬在種植骨結合過程中對新生血管及新生骨形成的調控,以及兩者之間的關系目前仍不清楚。本研究結果提示,上調HUVECs自噬活性能抑制細胞增殖,在此基礎上,仍需繼續(xù)探討在骨組織工程中自噬活性介導血管內皮細胞增殖可能的分子機制,為骨生物材料血管化研究提供新的理論依據。