王一丹, 王泊雅, 李 璐, 張 勇, 褚菲菲, 吳慧麗

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 消化內(nèi)科, 河南 鄭州, 450000)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率在各種惡性腫瘤中分別位居第3位和第2位[1]。目前針對結(jié)直腸癌的治療取得了較大進展,但患者的5年生存率仍不足40%[2]。腫瘤細胞即使在有氧條件下也傾向于通過糖酵解途徑來獲取能量,這一現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”[3]。有氧糖酵解參與能量的快速合成、腫瘤微環(huán)境的改變和細胞信號通路的激活[4]。由基因肌肉磷酸果糖激酶(PFKM)編碼的6-磷酸果糖激酶1(PFK1)在糖酵解途徑中發(fā)揮重要作用。相關(guān)文獻[5]顯示下調(diào)PFK1抑制鼻咽癌的增殖、遷移和侵襲能力,促進細胞凋亡,但PFK1在結(jié)直腸癌中的研究鮮有報道。

N6-甲基腺苷(m6A)修飾受三類調(diào)節(jié)因子調(diào)控,包括甲基化酶、去甲基酶和m6A閱讀蛋白[6]。決定m6A修飾命運的是m6A閱讀蛋白,其可以識別并與含有m6A的RNA相互作用,調(diào)節(jié)其功能[7]。m6A閱讀蛋白人類抗原R(HuR)是一種胚胎致死性視覺異常RNA結(jié)合蛋白,由基因ELAV樣蛋白1(ELAVL1)所編碼,可通過識別并結(jié)合靶基因上的m6A修飾位點增強mRNA穩(wěn)定性[8]。HuR參與肺腺癌[9]、肝癌[10]、乳腺癌[11]的糖酵解過程,而目前關(guān)于HuR在結(jié)直腸癌糖酵解中的研究較少,作用機制尚不清楚。本課題組前期生物信息分析顯示, PFK1上存在m6A修飾位點,且HuR與PFK1表達呈正相關(guān),推測二者存在密切聯(lián)系。本研究探討HuR對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)行為的影響及其與PFK1的關(guān)系,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2022年4—12月就診于鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院的33例結(jié)直腸癌患者,收集其結(jié)直腸癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織,術(shù)后立即將標(biāo)本冷凍保存于-80 ℃冰箱中待用。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并監(jiān)督(倫理號: 202242), 且獲得所有患者的知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 患者原發(fā)癌經(jīng)組織病理學(xué)證實; ② 未接受放療、化療者; ③ 臨床病歷資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并其他惡性腫瘤者; ② 已接受相關(guān)藥物治療者。

人正常腸上皮細胞NCM460及結(jié)直腸癌細胞系HCT8、SW480、SW620、HCT116、LoVo、RKO購自武漢普諾賽生命科技有限公司; Trizol試劑、RIPA裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; 青霉素、鏈霉素、胎牛血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基購自武漢益普生物公司; Transwell小室、基質(zhì)膠、細胞培養(yǎng)瓶及6孔板購自Conring公司; 葡萄糖含量檢測試劑盒、丙酮酸含量檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司; HuR、PFK1、β-actin引物由上海華大基因科技有限公司合成; HuR小干擾RNA(si-HuR-1; si-HuR-2; si-HuR-3)及其陰性對照組(si-NC)由河南睿英生物公司提供; β-actin(兔源,稀釋比例1∶10 000)、PFK1(兔源,稀釋比例1∶1 000)一抗抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體均購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng): 將NCM460、HCT8、SW480、SW620、HCT116、LoVo、RKO和COLO205細胞置于含有1%青霉素、鏈霉素、10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCT): 使用Trizol試劑提取RNA, 通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 并使用SYBR Green法進行擴增反應(yīng),β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性10 min, 95 ℃下10 s, 60 ℃下30 s, 共45個循環(huán),采用2-△△Ct方法計算HuR、PFK1的相對表達量。PCR引物及序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 蛋白免疫印跡實驗(Western blot): 收集細胞后,使用RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑從細胞中提取蛋白,通過BCA檢測試劑盒進行定量,金屬浴煮沸使蛋白變性。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣本,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上, 5%脫脂牛奶封閉1 h, TBST洗滌后,將PVDF膜與特異性一抗PFK1(1∶1 000)、β-actin(1∶10 000)在4 ℃下孵育過夜。再次TBST洗滌后,加入二抗(1∶10 000)在室溫下孵育1 h; 將膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀中,均勻加入ECL顯色液,觀察蛋白條帶。β-actin作為內(nèi)參,通過Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.2.4 細胞分組: 將si-NC、si-HuR-1、si-HuR-2、si-HuR-3分別轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的HCT116、SW480細胞,命名為si-NC組、si-HuR-1組、si-HuR-2組、si-HuR-3組,轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)實驗。HuR siRNA序列見表2。

表2 siRNA序列

1.2.5 細胞劃痕實驗: 將1×105個細胞接種于6孔板中的每個孔中,并生長至100%匯合度,用無菌10 μL移液器槍頭垂直劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,加入不含F(xiàn)BS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。計算細胞在第0、24小時的劃痕面積。劃痕愈合率(%)=(第0小時的劃痕面積-第24小時的劃痕面積)/第0小時的劃痕面積×100%。

1.2.6 Transwell實驗: 使用含有小室的24孔板(帶或不帶基質(zhì)膠涂層)進行遷移和侵襲實驗。在上層小室內(nèi)加入含200 μL細胞懸浮液的無血清培養(yǎng)基(每孔2.5×105個細胞),并將600 μL含10%FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入下層小室中。培養(yǎng)48 h后,用棉簽擦去上室的細胞和基質(zhì)膠, 4%多聚甲醛固定細胞15 min, 0.5%結(jié)晶紫染色25 min, 空氣風(fēng)干。在顯微鏡下觀察細胞并拍照,通過Image J軟件分析細胞數(shù)。

1.2.7 RNA穩(wěn)定性實驗: 將1×105個細胞接種于6孔板中的每個孔中,轉(zhuǎn)染48 h后,使用5 μg/mL放線菌素D處理細胞0、3、6 h, 分別收集上述時間點的細胞,提取細胞RNA, 通過qRT-PCR檢測PFK1mRNA相對表達量。

1.2.8 糖酵解水平檢測: 將1×105個細胞接種于6孔板中的每個孔中,轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組細胞,使用葡萄糖含量檢測試劑盒、丙酮酸含量檢測試劑盒檢測細胞葡萄糖攝取量、丙酮酸生成量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。HuR、PFK1在結(jié)直腸癌及對應(yīng)癌旁組織的表達量使用配對樣本t檢驗,各細胞組間差異比較使用獨立樣本t檢驗進行分析。所有實驗均重復(fù)3次,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HuR在結(jié)直腸癌組織和細胞系中高表達

基于基因表達水平值的交互式分析平臺(GEPIA)數(shù)據(jù)庫分析顯示,結(jié)直腸癌組織中的HuR表達水平高于正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 與癌旁組織相比,結(jié)直腸癌組織中HuRmRNA表達量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); 與人正常腸上皮細胞NCM460相比, HuR在人結(jié)直腸癌細胞系HCT8、SW480、SW620、HCT116、LoVo、RKO和COLO205細胞中的表達量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 其中HCT116、SW480細胞的HuR表達水平相對較高,選擇HCT116、SW480細胞進行后續(xù)實驗。將3種實驗組siRNA-HuR及陰性對照組轉(zhuǎn)染到HCT116、SW480細胞中,相較于對照組,實驗組HuRmRNA表達量顯著下降,其中si-HuR-1和si-HuR-3的差異最為顯著(P<0.01), 說明轉(zhuǎn)染明顯有效,選擇si-HuR-1和si-HuR-3進行后續(xù)細胞功能試驗。見圖1。

2.2 敲低HuR抑制結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲

與對照組si-NC相比,實驗組si-HuR-1、si-HuR-3的劃痕愈合率下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2; 與對照組si-NC相比,實驗組si-HuR-1、si-HuR-3的遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖3。

2.3 敲低HuR抑制結(jié)直腸癌細胞糖酵解

與對照組si-NC相比,實驗組si-HuR-1、si-HuR-3的葡萄糖攝取量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 敲低HuR使HCT116、SW480細胞的丙酮酸生成量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

2.4 敲低HuR抑制結(jié)直腸癌細胞PFK1 mRNA和蛋白的表達量

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示PFK1在結(jié)直腸癌中高表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);PFK1mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達量高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001); GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示,結(jié)直腸癌組織中HuR與PFK1表達水平呈正相關(guān); 與對照組相比,實驗組PFK1mRNA及其蛋白的表達量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

2.5 敲低HuR抑制PFK1 mRNA的穩(wěn)定性

利用RMBase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PFK1上存在著m6A修飾的序列; 使用m6AVar數(shù)據(jù)庫顯示基因組上的功能變異能夠使PFK1上的m6A修飾的序列發(fā)生改變,并且RM2Target算法預(yù)測PFK1能夠與HuR存在直接結(jié)合; 敲低HuR降低了PFK1的mRNA半衰期,即抑制PFK1mRNA穩(wěn)定性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

3 討 論

m6A修飾是真核生物mRNA中最豐富的內(nèi)部修飾,參與多種生物過程,如RNA剪接、穩(wěn)定性和翻譯[12]。HuR是m6A修飾中的重要成員,在癌癥的進展中發(fā)揮重要作用[13]。DUAN X H等[14]發(fā)現(xiàn)敲低HuR可通過降低肺癌細胞FGFRL1mRNA的穩(wěn)定性抑制化療耐藥性,進而誘導(dǎo)其凋亡。LIU H L等[15]研究顯示HuR在肝癌中高表達,抑制HuR的表達能夠降低MMP1mRNA的穩(wěn)定性,進一步抑制肝癌細胞的增殖能力。上述研究結(jié)果顯示, HuR可能可以成為提示腫瘤進展和預(yù)后的潛在分子靶點。目前國內(nèi)外對HuR在結(jié)直腸癌中的研究較少,作用機制尚不清楚。本研究中, GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示HuR(基因名稱為ELAVL1)在結(jié)直腸癌組織中高表達,這一結(jié)果在臨床樣本中得到了驗證, HuR在結(jié)直腸癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織。通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)HuRmRNA的表達量在HCT116、SW480細胞中升高,因此選擇HCT116、SW480細胞作為研究對象進行后續(xù)功能學(xué)研究。敲低HuR后,實驗組細胞劃痕愈合率、細胞遷移數(shù)和細胞侵襲數(shù)均降低,提示敲低HuR能夠抑制結(jié)直腸癌細胞的遷移、侵襲能力。

“Warburg效應(yīng)”的特征是葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生增強,乳酸的產(chǎn)生為腫瘤細胞提供了酸性環(huán)境,促使腫瘤細胞進一步增殖、遷移、侵襲以及抵抗凋亡,同時誘導(dǎo)分泌血管內(nèi)皮生成因子為腫瘤細胞生長提供養(yǎng)料[16-17]。為探討HuR是否參與結(jié)直腸癌糖酵解途徑,通過檢測葡萄糖攝取水平和丙酮酸生成水平,發(fā)現(xiàn)敲低HuR可以抑制HCT116、SW480細胞的葡萄糖攝取量、丙酮酸生成量,證明HuR參與并促進結(jié)直腸癌的糖酵解途徑。

腫瘤細胞有氧糖酵解能力是正常細胞的20～30倍,為腫瘤代謝提供大量能量和中間產(chǎn)物[3]。研究[18]顯示,抑制腫瘤細胞糖酵解途徑能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖,甚至可以起到殺傷腫瘤細胞的作用。因此阻斷有氧糖酵解目前被認為是一種有前景的腫瘤治療策略,靶向糖酵解等異常環(huán)節(jié)的代謝酶也成為抗腫瘤治療的重點[19]。PFK1是糖酵解的主要限速酶和主要調(diào)節(jié)點,催化6-磷酸果糖生成1, 6-二磷酸果糖(F2-6BP)[20]。既往研究[21]顯示, PFK1不僅能夠參與糖酵解過程,還在多種腫瘤中扮演著重要角色,如下調(diào)PFK1抑制肝癌細胞增殖能力,過表達PFK1可促進肺癌生長和轉(zhuǎn)移[22]。本研究中, GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示PFK1(編碼基因PFKM)在結(jié)直腸癌組織中顯著高表達,并且與HuR表達水平呈正相關(guān); 進一步通過qRT-PCR驗證顯示PFK1在結(jié)直腸癌組織中的表達量顯著升高; 敲低HuR后,HCT116、SW480細胞中PFK1mRNA和蛋白表達量降低,提示敲低HuR能夠抑制PFK1表達。HuR是一種關(guān)鍵的m6A閱讀蛋白,其發(fā)揮作用的機制可能為: 首先,通過生物信息學(xué)分析預(yù)測HuR與PFK1(編碼基因PFKM)結(jié)合,且PFK1上存在m6A修飾位點; 其次,通過RNA穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)敲低HuR可以抑制PFK1mRNA半衰期,即降低PFK1mRNA穩(wěn)定性。本研究并未進行實驗證明PFK1上存在m6A位點,后續(xù)將通過甲基化RNA免疫共沉淀實驗(MeRIP)來驗證。

綜上所述, m6A閱讀蛋白HuR在結(jié)直腸癌中高表達,可能通過識別結(jié)合PFK1上的m6A位點,降低PFK1mRNA穩(wěn)定性,從而調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的遷移、侵襲和糖酵解能力。