陳易華, 羅 艷, 田 強(qiáng), 曾冬梅, 許 雷

(中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 病理科, 四川 成都, 610083)

結(jié)直腸癌(CRC)屬于胃腸道常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率與病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位居前列[1]。CRC早期臨床表現(xiàn)為排便習(xí)慣的改變、腹瀉、局部腹痛等,由于其早期癥狀無(wú)特殊性,患者確診時(shí)病情已發(fā)展至晚期,癌細(xì)胞已轉(zhuǎn)移至其他重要器官,對(duì)患者的生命健康造成巨大的威脅[2]。目前,影響結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展與預(yù)后的機(jī)制尚不清楚,而尋找潛在標(biāo)記物用于早期診斷結(jié)直腸癌是目前臨床研究的重點(diǎn)。視黃酸X受體a(RXRA)屬于醇/甲狀腺激素核內(nèi)受體超家族成員。研究[3-4]表明, RXRA可參與調(diào)控細(xì)胞的分化與已經(jīng)發(fā)育的胚胎,并在不同腫瘤組織中差異表達(dá)。核受體相互作用蛋白1(NRIP1)可參與炎癥、細(xì)胞程序性壞死與凋亡,與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]。本研究探討結(jié)直腸癌組織中RXRA、NRIP1表達(dá)與患者臨床病理、預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2018年8月—2020年8月本院收治的106例結(jié)直腸癌患者癌組織標(biāo)本設(shè)為結(jié)直腸癌組(n=106), 將對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本設(shè)為癌旁組(n=106); 患者年齡20～75歲,平均(51.24±2.68)歲。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)病理學(xué)診斷確診為結(jié)直腸癌[6]、病理類型為腺癌者; ② 納入本研究前未接受過任何抗腫瘤治療者; ③行結(jié)直腸癌根治術(shù)者; ④ 患者及監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病者; ②合并其他器官惡性腫瘤者; ③ 既往有結(jié)直腸手術(shù)史患者; ④ 醫(yī)患溝通障礙、不愿配合者; ⑤ 出院后失訪及拒絕參與本研究者。本研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 RXRA及NRIP1檢測(cè): 術(shù)中取結(jié)直腸癌患者的癌組織與癌旁正常組織,經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋,制成厚度為4 μm切片。采取免疫組化法檢測(cè)RXRA、NRIP1表達(dá)情況,具體操作流程需參考使用說明書。將石蠟切片、脫蠟、乙醇脫水、自來(lái)水脫水后放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液PBS(pH值6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù),滴入3%過氧化氫溶液,置于室溫條件下孵育15 min, 加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次; 加入兔抗人RXRA單克隆抗體1∶5 000、兔抗人NRIP1單克隆抗體1∶1 500(北京康源綠洲生物科技有限公司),放入微波爐在加熱15 min后冷卻10 min, 在4 ℃環(huán)境下過夜,最后自然冷卻至室溫; 第2天取出后室溫下靜置30 min, 加入PBS洗滌3次,加入帶有生物素標(biāo)記的二抗(1∶5 000)(比克曼生物有限公司), 30 ℃孵育35 min, 放入二氨基聯(lián)苯胺DAB染色試劑盒,蘇木素染色劑復(fù)染,梯度乙醇脫水,透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡(天津微儀光電顯微鏡微域光學(xué)儀器有限公司)下觀察結(jié)果。

1.2.2 結(jié)果判定: RXRA、NRIP1陽(yáng)性染色表現(xiàn)為光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或褐色沉淀。選取5個(gè)高倍視野(每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞), 500倍鏡下選取癌細(xì)胞陽(yáng)性染色集中區(qū)域,計(jì)算5個(gè)視野平均陽(yáng)性百分率。平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%計(jì)0分, >5%～25%計(jì)1分, >25%～50%計(jì)2分, >50%～75%計(jì)3分, >75%～100%計(jì)4分。不染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色依次計(jì)0、1、2、3分; 每張切片陽(yáng)性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)分為陰性(0分)、弱陽(yáng)(0～4分)、陽(yáng)性(5～8分)、強(qiáng)陽(yáng)性(>8分); 陰性與弱陽(yáng)性定為陰性表達(dá),陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3 預(yù)后: 所有結(jié)直腸癌患者出院后通過門診復(fù)查、電話隨訪等方式連續(xù)隨訪3年,記錄患者的生存情況,隨訪截至患者因結(jié)腸癌死亡或2023年8月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, RXRA、NRIP1表達(dá)水平采用[n(%)]描述,應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較,預(yù)后影響因素采用多因素Cox回歸分析,雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌患者組織中RXRA、NRIP1表達(dá)

結(jié)直腸癌組RXRA、NRIP1陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1、圖1。

表1 結(jié)直腸癌患者組織中RXRA、NRIP1表達(dá)情況[n(%)]

2.2 結(jié)直腸癌患者RXRA、NRIP1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

病理Ⅲ期、低分化、有漿膜浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的RXRA陽(yáng)性表達(dá)率、NRIP1陽(yáng)性表達(dá)率高于病理Ⅱ期、中高分化、無(wú)漿膜浸潤(rùn)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者RXRA、NRIP1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后生存情況以及單因素分析

106例結(jié)直腸癌患者出院后連續(xù)隨訪3年, 58例患者存活,總生存率為54.72%(58/106)。結(jié)直腸癌患者的3年總生存率與病理分期、分化程度、漿膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P<0.05); RXRA陰性、NRIP1陰性患者的3年總生存率高于RXRA陽(yáng)性、NRIP1陽(yáng)性患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后單因素分析[n(%)]

2.4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

將結(jié)直腸癌患者預(yù)后作為因變量,將單因素分析有意義的指標(biāo)作為自變量并進(jìn)行賦值(病理分期: Ⅱ期=0, Ⅲ期=1; 分化程度: 中高分化=0, 低分化=1; 漿膜浸潤(rùn): 無(wú)=0, 有=1; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移: 無(wú)=0, 有=1; RXRA: 陰性=0,陽(yáng)性=1; NRIP1: 陰性=0, 陽(yáng)性=1), 進(jìn)行多因素Cox回歸分析,有漿膜浸潤(rùn)、RXRA陽(yáng)性、NRIP1陽(yáng)性是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05), 見表4。

表4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

結(jié)直腸癌是中國(guó)消化道常見的惡性腫瘤之一, 40～60歲人群發(fā)病率較高,近年來(lái)有年輕化趨勢(shì)[7]。結(jié)直腸癌在中國(guó)的發(fā)病率和病死率呈直線上升,每年增長(zhǎng)率為3.05%[8]。結(jié)直腸癌癥狀隱匿,多數(shù)患者就診時(shí)病情已發(fā)展至中晚期。手術(shù)、輔助化療等一系列醫(yī)療措施可有效增強(qiáng)患者抗腫瘤療效,改善其預(yù)后,但治療后癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)仍然是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因[9-10]。

RXRA屬于核受體,通過參與視黃酸介導(dǎo)的基因激活來(lái)介導(dǎo)類視黃醇的生物學(xué)效應(yīng),可通過受體的形式與靶基因啟動(dòng)因子相結(jié)合,起到轉(zhuǎn)錄因子的作用; 在腫瘤細(xì)胞中可通N端切割形式tRXRA發(fā)揮促癌作用,促成癌癥的發(fā)生發(fā)展[11-12]。本研究結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌RXRA陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組(P<0.05), 說明RXRA呈高表達(dá)提示結(jié)直腸癌的發(fā)生。RXRA與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系結(jié)果顯示,病理分期為Ⅲ期、低分化、有漿膜浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的RXRA陽(yáng)性表達(dá)率更高,提示RXRA可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。研究[13]顯示RXRA在多種腫瘤中異常表達(dá),與本研究結(jié)果相似。分析原因可能為, RXRA具有轉(zhuǎn)錄因子的作用,癌細(xì)胞可刺激其通過激活磷酸肌醇-3激酶(P13K)或蛋白激酶B(AKT)、核轉(zhuǎn)錄因子-KB(NF-KB)等信號(hào)通路幫助癌細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行大量的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[14-15]。研究[16]表明, RXRA還可與PML等相互作用,促進(jìn)白血病的發(fā)展,可作為該疾病患者的獨(dú)立預(yù)后因素,與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示, RXRA陰性患者的3年總生存率顯著高于RXRA陽(yáng)性患者(P<0.05), 提示RXRA陽(yáng)性是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素之一,可能可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。

NRIP1是一種核蛋白,與核受體的激素依賴性激活域AF2特異性相互作用,可調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而參與機(jī)體內(nèi)代謝、衰老以及其他生理過程; NRIP1在宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌等癌組織中呈異常表達(dá)[17-18]。本研究結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組NRIP1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組(P<0.05); 進(jìn)一步對(duì)NRIP1與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系研究結(jié)果顯示,病理分期為Ⅲ期、低分化、有漿膜浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的NRIP1陽(yáng)性表達(dá)率更高,表明NRIP1可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。分析原因?yàn)? NRIR1中的蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸激酶能與多種蛋白結(jié)合、相互作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的信號(hào),促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖,對(duì)機(jī)體多個(gè)重要器官進(jìn)行浸潤(rùn),導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生與病情的進(jìn)展[19-20]。本研究結(jié)果顯示, NRIR1陰性患者的3年總生存率顯著高于NRIR1陽(yáng)性患者(P<0.05), 提示NRIR1陽(yáng)性是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素之一,其具有作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后評(píng)估的潛力生物標(biāo)志物。

綜上所述, RXRA、NRIP1在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá),與腫瘤分期、分化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能可作為輔助評(píng)估患者預(yù)后的生物標(biāo)記物。