張 愛,朱 寧,楊路路,方 媛,王勁松,李 俐

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是繼肺癌和乳腺癌之后的全球第三大常見癌癥類型。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì)。即使在進(jìn)行根治性切除的CRC患者中,仍有40%～50%的患者復(fù)發(fā)并死于轉(zhuǎn)移性疾病[1]。腫瘤TNM分期是CRC患者治療和預(yù)后評(píng)估的一項(xiàng)重要指標(biāo),但臨床研究發(fā)現(xiàn)相同的TNM分期患者對(duì)治療反應(yīng)不同,預(yù)后也不同,表明TNM分期還無法精確地預(yù)測(cè)患者預(yù)后。近些年研究表明,腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞除了具有直接殺菌活性外,還可以通過釋放多種蛋白酶來調(diào)節(jié)血管生成和組織重塑[3-4]。越來越多的研究表明,腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils, TANs)通過分泌一些因子引起致癌或加速癌細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成、遷移和侵襲。文獻(xiàn)報(bào)道TANs與胃癌、膽道癌和腎細(xì)胞癌等腫瘤的預(yù)后相關(guān)[5-7]。腫瘤促纖維間質(zhì)反應(yīng)(desmoplastic reaction, DR)是指機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞引起的腫瘤周圍間質(zhì)的反應(yīng),并發(fā)現(xiàn)不成熟型DR與CRC、胃癌和胰腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)[8-11]。目前CRC中TANs與DR的關(guān)系尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究使用CD66b染色來標(biāo)記CRC中TANs,分析CRC中TANs和DR的的臨床病理學(xué)意義及兩者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016～2017年南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)病理科診斷的CRC手術(shù)切除標(biāo)本,剔除臨床資料不全、行新輔助治療或合并其他嚴(yán)重疾病者,共納入240例。其中男性155例,女性85例;年齡<70歲115例、≥70歲125例,平均68.65歲;低+中分化腺癌171例,高分化腺癌69例;pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期132例,Ⅲ+Ⅳ期108例。病例均由2名高年資病理醫(yī)師對(duì)HE切片進(jìn)行重新評(píng)估,判斷其分化程度、浸潤(rùn)深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)。

1.2 方法手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm厚切片,行HE和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法,在Dako Autostainer Link48免疫組化儀上進(jìn)行,具體染色步驟參照儀器說明書進(jìn)行。兔抗人CD66b單克隆抗體(克隆號(hào)EPR25354-2)購(gòu)自Abcam公司,稀釋度1∶20 000。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1TANs判讀 形態(tài)學(xué)上,中性粒細(xì)胞是多形核細(xì)胞,細(xì)胞核呈分葉狀,染色質(zhì)聚集、胞質(zhì)嗜酸性。TANs定義為僅浸潤(rùn)在腫瘤上皮細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)內(nèi)的中性粒細(xì)胞,排除腫瘤腔內(nèi)中性粒細(xì)胞伴粉刺型壞死、緊鄰壞死、隱窩破裂黏膜潰瘍的區(qū)域。TAN判讀方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13],即計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中TANs的數(shù)量,取平均值作為該病例的TANs。根據(jù)每100個(gè)腫瘤細(xì)胞中<5、5～15和>15個(gè)中性粒細(xì)胞分別歸為中性粒細(xì)胞缺乏型(NP)、中性粒細(xì)胞中間型(NI)和中性粒細(xì)胞豐富型(NR)。

1.3.2DR判讀 DR的分類標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)分為成熟型、中間成熟型和不成熟型[14]。成熟型：是指纖細(xì)的膠原纖維呈多層分層狀、規(guī)則性排列,不含任何黏液基質(zhì)或瘢痕疙瘩樣膠原纖維;中間型：是指當(dāng)瘢痕疙瘩樣膠原混雜在成熟間質(zhì)中時(shí),通常與成熟膠原纖維方向平行;不成熟型：是指肥胖型的纖維母細(xì)胞散亂排列伴有明顯的黏液樣基質(zhì)。由2名高年資病理醫(yī)師對(duì)所有腫瘤切片進(jìn)行DR評(píng)估,判讀結(jié)果不一致者則由病理醫(yī)師在多頭顯微鏡下進(jìn)行會(huì)診,得出判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均使用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析其臨床病理特征。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析腫瘤內(nèi)CD66b+TANs和DR分類與CRC臨床病理特征的相關(guān)。Kaplan-Meier法分析CD66b+TANs和DR與CRC患者預(yù)后的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC中CD66b+TANs、DR與臨床病理特征的關(guān)系CRC中CD66b+TANs NR 29例,NI 47例,NP 164例(圖1)。為了方便分析,將NI/NP合并一組,結(jié)果顯示CRC中CD66b+TANs與患者年齡、性別、腫瘤大小、發(fā)病部位、神經(jīng)侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05),而與組織學(xué)分級(jí)、脈管侵犯、pTNM分期顯著相關(guān)(P<0.05,表1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CRC中CD66b+TANs NR者,pTNM分期更高,分化更差,更容易出現(xiàn)脈管侵犯。DR中,不成熟型85例,中間型63例,成熟型92例(圖2),CRC中DR與患者性別、年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小、脈管侵犯等均無關(guān)(P>0.05),而與腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期密切相關(guān)(P<0.05,表1)。

表1 結(jié)直腸癌中CD66b+TANs、DR與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 結(jié)直腸癌中TANs分類：A.TANs缺乏型;B.TANs中間型;C.TANs豐富型;D.CD66b在TANs缺乏型中的表達(dá),EnVision法;E.CD66b在TANs中間型中的表達(dá),EnVision法;F.CD66b在TANs豐富型中的表達(dá),EnVision法

圖2 結(jié)直腸癌中DR分類：A.DR成熟型;B.DR中間型;C.DR不成熟型

2.2 CRC中CD66b+TANs、DR與預(yù)后的關(guān)系與CD66b+TANs NI和NP CRC患者相比,CD66b+TANs NR CRC患者的3年總生存率(overall survival, OS)較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065,圖3A)。CD66b+TANs NR的CRC患者3年OS明顯低于NI/NP CRC患者(P=0.021,圖3B)。不同類型DR CRC患者的3年OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,伴有不成熟型DR的CRC患者3年OS最低(圖3C)。多因素Logistic回歸分析顯示：TANs和DR是CRC預(yù)后的獨(dú)立影響因子(表2)。

表2 結(jié)直腸癌中單因素和多因素Logistic回歸分析

圖3 結(jié)直腸癌中CD66b+TAN和DR與患者3年總生存期的Keplan-Meier生存曲線：A.CD66b+TANs NR結(jié)直腸癌患者的3年總生存期低于NI和NP結(jié)直腸癌患者;B. CD66b+TANs NI/NP結(jié)直腸癌患者的3年總生存期高于CD66b+ TANs NR結(jié)直腸癌患者;C. DR不成熟型、中間型和成熟型結(jié)直腸癌患者的3年總生存期

2.3 CRC中CD66b+TANs與DR的相關(guān)性CRC中CD66b+TANs為NR者,腫瘤間質(zhì)不成熟型17例(20.0%)、中間型6例(9.5%)和成熟型6例(6.5%);而CD66b+TANs為NI/NP者,間質(zhì)不成熟型68例(80.0%)、中間型57例(90.5%)和成熟型86例(93.5%)。相關(guān)性分析顯示,隨著CD66b+TANs數(shù)量增加,DR由成熟型轉(zhuǎn)變至未成熟,TANs與DR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.176,P=0.006,表3)。

表3 結(jié)直腸腺癌中CD66b+TANs與DR的相關(guān)性[n(%)]

3 討論

目前研究已表明惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅涉及惡性腫瘤細(xì)胞,而且還與TME密切相關(guān)。TME是一種由各種細(xì)胞類型包括癌癥相關(guān)性纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外成分組成的復(fù)雜系統(tǒng)。TME內(nèi)各種成分通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展,進(jìn)而影響患者的預(yù)后。TANs不僅是炎癥微環(huán)境內(nèi)一種主要的組成成分,也是腫瘤中一種主要的浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞成員[15]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)TANs以復(fù)雜和多用途的方式起作用,對(duì)癌細(xì)胞表現(xiàn)出直接的細(xì)胞毒性抑制轉(zhuǎn)移,但也能夠發(fā)揮促癌作用,如新生血管形成、促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、上皮-間葉轉(zhuǎn)化等[16-17]。

CRC中腫瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞的臨床病理學(xué)意義研究結(jié)果尚不一致,Galediero等[18]采用免疫組化法研究了271例Ⅰ～Ⅳ期CRC標(biāo)本中CD66b和髓過氧化物酶(MPO)在中性粒細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD66b是識(shí)別CRC組織中TANs的一種可靠標(biāo)志物,Ⅳ期CRC患者中CD66b+TANs數(shù)量明顯低于Ⅰ～Ⅲ期,Cox分析顯示較高的TANs密度與預(yù)后好相關(guān)。另外,該研究還發(fā)現(xiàn)較高的TANs密度與基于5-FU化療有較好的反應(yīng)。Ye等[19]使用ssGSEA和CIBERSOTR工具分析GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫中1 802例CRC中腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞包括CD66b+TANs的預(yù)后價(jià)值,并對(duì)1 008例CRC活檢標(biāo)本進(jìn)行CD66b免疫組化檢測(cè),研究結(jié)果顯示高度豐富的CD66b+TANs與CRC預(yù)后相關(guān),而且是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子。Yin等[20]研究發(fā)現(xiàn)在CRC浸潤(rùn)前沿CD8+腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞和CD66b+TANs數(shù)量對(duì)預(yù)測(cè)CRC患者的生存可提供有意義的預(yù)后價(jià)值,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)前沿CD66b+TANs數(shù)量降低與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),且與CRC患者低生存期和無瘤生存期均相關(guān)。這些研究結(jié)果提示,CD66b+TANs在CRC中的臨床病理學(xué)意義還需進(jìn)一步研究。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)240例CRC腫瘤組織內(nèi)CD66b+TANs數(shù)量,分析CD66b+TANs數(shù)量與CRC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示CRC中CD66b+TANs數(shù)量與組織學(xué)分級(jí)、脈管侵犯、pTNM分期顯著相關(guān);進(jìn)一步分析CD66b+TANs與CRC患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn),NR CRC患者與NI/NP CRC患者相比,3年OS更差,提示CRC組織內(nèi)CD66b+TANs數(shù)量可能促進(jìn)CRC的侵襲轉(zhuǎn)移,腫瘤組織中CD66b+TANs數(shù)量高可能預(yù)測(cè)CRC患者不良的預(yù)后。

DR最早由Ueno等[21]提出,他們根據(jù)“瘢痕疙瘩樣”膠原纖維和黏液樣基質(zhì)將纖維性癌性間質(zhì)分為成熟型、中間型和不成熟型3類。最近對(duì)DR的組織學(xué)特征和不同類型的確定進(jìn)行了更明確的定義[22-23]。在CRC研究中,Uneo等[24]的研究結(jié)果顯示DR類型與腫瘤部位、pT和pN分期、腫瘤分化、靜脈侵犯、腫瘤出芽和克隆氏樣淋巴結(jié)反應(yīng)明顯相關(guān),不成熟型DR與肝、肺、淋巴結(jié)、腹膜和局部區(qū)域高復(fù)發(fā)率有關(guān),而且5年無瘤生存率在成熟型DR組高于未成熟型DR組。一項(xiàng)多中心研究也發(fā)現(xiàn),DR分類是Ⅱ期CRC患者5年無復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,且DR分類與腫瘤出芽和靜脈侵犯存在顯著相關(guān)性[25]。最近一項(xiàng)三期前瞻性驗(yàn)證研究結(jié)果顯示991例Ⅱ期結(jié)腸癌患者中,5年無復(fù)發(fā)生存率在成熟型組最高,其次為中間型,不成熟型組最低;多因素分析顯示DR分類是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素,也是預(yù)測(cè)無復(fù)發(fā)生存的第一個(gè)分割因子,其次為T分期、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)和腫瘤出芽[26]。本研究結(jié)果顯示,CRC中DR分類與腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期密切相關(guān),具有不成熟型DR的CRC具有更加侵襲性臨床生物學(xué)行為,進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)不成熟型DR的CRC患者3年OS明顯低于具有中間型和成熟型DR的CRC患者,且與Uneo等研究結(jié)果相似,多因素分析顯示DR類型是CRC患者3年OS的獨(dú)立預(yù)后因素,本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CRC中DR類型不僅可影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,而且還可預(yù)測(cè)CRC患者的預(yù)后。

TME中含有多種成分,它們之間相互作用組成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)影響惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。TME中免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互關(guān)系目前還沒有深入研究。Akimoto等[27]應(yīng)用多種免疫熒光技術(shù)分析了908例CRC中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與DR的關(guān)系,研究結(jié)果顯示不成熟型DR與較低的上皮內(nèi)CD3+CD8+CD45RO+細(xì)胞和間質(zhì)M1樣巨噬細(xì)胞相關(guān),表明在CRC TME內(nèi)腫瘤上皮內(nèi)記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞和間質(zhì)M1樣巨噬細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞可能發(fā)生相互作用影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。Gonzalez等[28]研究也發(fā)現(xiàn)CRC中上皮內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞與低腫瘤出芽和非黏液樣DR明顯相關(guān),提示TME中各種成分可能存在交互作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CRC中CD66b+TANs與DR分類呈負(fù)相關(guān),CD66b+TANs越豐富的CRC,其DR越不成熟,提示CD66b+TANs可能通過分泌一些細(xì)胞因子影響DR的成熟,具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

總之,CD66b+TANs和DR在CRC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,CD66b+TANs豐富型和不成熟型DR的CRC患者具有不良的預(yù)后,CD66b+TANs與DR之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系提示TANs可能影響DR類型。在臨床實(shí)踐中常規(guī)報(bào)告CD66b+TANs和DR類型可有助于預(yù)測(cè)CRC患者的預(yù)后。