陳肖瑜,羅文奇,張鳳友,蔣芳誠(chéng),莫濡蔚,黨裔武

腎細(xì)胞癌包括三種主要的組織學(xué)亞型：透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell cancer, CCRCC)、乳頭狀腎細(xì)胞癌和嫌色腎細(xì)胞癌。CCRCC起源于腎小管上皮系統(tǒng),形態(tài)具有異質(zhì)性,是腎細(xì)胞癌最常見的類型,占腎細(xì)胞癌的70%。早中期CCRCC首選手術(shù)治療,早期術(shù)后5年生存率約70%,約30%患者術(shù)后3～5年內(nèi)復(fù)發(fā)[1]。局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性CCRCC患者的預(yù)后較差。晚期CCRCC患者的最佳治療方案是免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor, ICI)聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI),但CCRCC異常糖酵解信號(hào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞形成抑制性免疫微環(huán)境,介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,從而影響免疫治療的效果[2]。惡性腫瘤的代謝重排是繼免疫治療后的又一研究熱點(diǎn)。人神經(jīng)元特異性γ-烯醇酶2(enolase 2, ENO2),又稱神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase, NSE),它在糖酵解中起重要的作用,在促進(jìn)β-甘油磷酸酯轉(zhuǎn)化為二羥磷酸丙酮的同時(shí),形成腺苷三磷酸(ATP)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[3]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道ENO2作為癌基因可促進(jìn)CCRCC的進(jìn)展[4-5],本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化法對(duì)97例CCRCC組織進(jìn)行分析,驗(yàn)證其表達(dá)情況及診斷價(jià)值,初探其促進(jìn)CCRCC發(fā)展的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料收集2018年5月～2023年5月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院存檔的97例CCRCC和對(duì)應(yīng)正常腎組織石蠟標(biāo)本,納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前均未行放、化療或分子靶向治療;(2)近5年內(nèi)的根治術(shù)標(biāo)本;(3)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批;(4)所有病例均經(jīng)副主任醫(yī)師以上職稱病理專家審核確診。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化MaxVision法檢測(cè)ENO2(貨號(hào)MAB-0791,福州邁新公司,稀釋1∶100)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作,采用檸檬酸高壓修復(fù)法。結(jié)果判讀：(1)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分,呈淺黃色為1分,黃色或棕黃色為2分,深黃色或黃褐色為3分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘得到最終評(píng)分：>3分為高表達(dá),≤3分為低表達(dá)。

1.2.2公共數(shù)據(jù)提取 從腫瘤基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas, TCGA)(https：//portal.gdc.cancer.gov)獲得542例CCRCC和72例正常腎組織mRNA測(cè)序數(shù)據(jù),獲得ENO2 mRNA在CCRCC及正常組織中的表達(dá)水平。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//gepia.cancer-pku.cn/)儲(chǔ)存了來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的516例CCRCC的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)以及對(duì)應(yīng)的生存資料,根據(jù)516例CCRCC中ENO2 mRNA表達(dá)量的中位數(shù)分為ENO2高表達(dá)組和ENO2低表達(dá)組,利用GEPIA工具進(jìn)行生存分析,以探究ENO2表達(dá)與CCRCC患者預(yù)后的關(guān)系。使用TIMER在線數(shù)據(jù)(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/)分析ENO2的表達(dá)與糖代謝路徑關(guān)鍵基因的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。χ2檢驗(yàn)分析ENO2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析ENO2 mRNA表達(dá)在CCRCC組和對(duì)照正常組間的差異。ROC曲線分析ENO2在CCRCC中表達(dá)的敏感性和特異性。Log-rank檢驗(yàn)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)516例CCRCC中ENO2高表達(dá)組和低表達(dá)組間的總生存期與預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 CCRCC中ENO2蛋白和mRNA水平利用免疫組化法檢測(cè)97例CCRCC及配對(duì)正常腎石蠟包埋組織中ENO2蛋白的表達(dá),ENO2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。免疫組化結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),ENO2蛋白在CCRCC組織中的高表達(dá)率為71.13%(69/97),而在正常腎組織中均未見表達(dá)。ENO2蛋白在CCRCC組織的表達(dá)顯著高于正常腎組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。應(yīng)用TCGA-CCRCC數(shù)據(jù)庫(kù)分析ENO2 mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與正常對(duì)照腎組織相比,CCRCC中ENO2 mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.001,圖2)。

圖1 A.正常腎組織HE染色;B.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織HE染色;C.正常腎組織中ENO2蛋白呈陰性,MaxVision法;D.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織ENO2蛋白呈弱陽(yáng)性,MaxVision法;E.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織ENO2蛋白呈中等陽(yáng)性,MaxVision法;F.透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織ENO2蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性,MaxVision法

圖2 A. 97例根治術(shù)標(biāo)本透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織和對(duì)應(yīng)的正常腎組織中ENO2蛋白的表達(dá);B.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織和正常腎組織中ENO2 mRNA的表達(dá)

2.2 ENO2蛋白表達(dá)與CCRCC臨床病理特征的關(guān)系ENO2蛋白表達(dá)與ISUP/WHO分級(jí)(P=0.019)、有無(wú)腎周脂肪侵犯(P=0.028)密切相關(guān)(表1),而與患者年齡、性別、腫物大小、病理分期、有無(wú)癌栓均無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表1 ENO2蛋白表達(dá)與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ROC曲線分析ENO2在CCRCC中的敏感性和特異性應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中542例CCRCC和72例正常腎組織的ENO2 mRNA表達(dá)量及97例CCRCC根治術(shù)標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的正常腎組織ENO2蛋白表達(dá)量作ROC曲線分析。ROC曲線提示：CCRCC中ENO2 mRNA(95%CI為0.941～0.978,AUC=0.959,P<0.001,圖3A)以及ENO2蛋白的表達(dá)(95%CI為0.934～0.994,AUC=0.964,P<0.001,圖3B)具有較高的敏感性和特異性,對(duì)CCRCC具有較高的診斷價(jià)值。

圖3 A. TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)542例透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和72例正常腎組織的ENO2 mRNA表達(dá)量的ROC曲線;B.97例透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌根治術(shù)標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的正常腎組織ENO2蛋白表達(dá)量的ROC曲線

2.4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)516例CCRCC的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)及生存分析通過GEPIA在線網(wǎng)站分析ENO2與CCRCC患者預(yù)后的關(guān)系,其中ENO2 mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組樣本各258例,生存分析結(jié)果提示,ENO2 mRNA高表達(dá)組患者的總生存期(overall survival, OS)顯著低于低表達(dá)組,ENO2 mRNA高表達(dá)CCRCC患者具有更差的預(yù)后,OS更低(P=0.019,圖4)。

2.5 ENO2與糖代謝路徑相關(guān)基因的關(guān)系本組通過TIMER在線分析ENO2 mRNA表達(dá)與糖代謝路徑相關(guān)基因的關(guān)系,Peason相關(guān)性分析提示：ENO2 mRNA與糖代謝路徑相關(guān)基因HK2(R=0.346,P=1.81e-16)、ALDOA(R=0.201,P=2.92e-06)、PGK1(R=0.325,P=1.35e-14)、PKM2(R=0.203,P=2.34e-06)及LDHA(R=0.238,P=2.70e-08)的表達(dá)呈正相關(guān)(圖5)。

圖5 ENO2 mRNA與糖代謝路徑關(guān)鍵相關(guān)基因的關(guān)系

3 討論

CCRCC在泌尿系統(tǒng)中是常見的致死性疾病,全球每年新增約40.3萬(wàn)腎細(xì)胞癌新發(fā)病例和17.5萬(wàn)死亡病例[6]。晚期CCRCC患者的預(yù)后不佳,5年生存率大幅度下降。CCRCC糖酵解代謝異?；钴S[7],被認(rèn)為是一種代謝性疾病,涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖旁路、脂肪酸和氨基酸代謝通路的廣泛改變[8]。肥胖和糖尿病成為CCRCC發(fā)病的危險(xiǎn)因素,通過糖酵解調(diào)控聯(lián)合免疫或靶向治療的方案將成為現(xiàn)有CCRCC治療的重要補(bǔ)充,從而改變晚期CCRCC治療現(xiàn)狀[2]。ENO2是一種長(zhǎng)鏈酸性二聚體蛋白,含433個(gè)氨基酸,通常在成熟神經(jīng)元和神經(jīng)元來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá),是腫瘤中神經(jīng)內(nèi)分泌分化的常見標(biāo)志物[9-10]。此外,它也在紅細(xì)胞、血小板、乳腺組織、前列腺和子宮組織中表達(dá)[11-12]。

據(jù)報(bào)道,ENO2在膠質(zhì)瘤、胃癌、前列腺癌和許多其他類型的惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[13-15]。在急性淋巴細(xì)胞白血病中ENO2能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[16],在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,ENO2表達(dá)較高的患者OS明顯低于ENO2表達(dá)較低的患者,敲除ENO2能顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移[15]。本研究通過免疫組化檢測(cè)了97例CCRCC根治術(shù)標(biāo)本和對(duì)應(yīng)正常腎組織中ENO2蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示ENO2蛋白在正常腎組織中幾乎不表達(dá),而在CCRCC中明顯高表達(dá),并且具有較高的敏感性和特異性,對(duì)CCRCC和正常腎組織具有較好的區(qū)分能力,是一個(gè)潛在的CCRCC的鑒別診斷標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道ENO2也是小細(xì)胞肺癌診斷、預(yù)后和隨訪中可靠的腫瘤標(biāo)志物[11]。分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中516例CCRCC的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)以及對(duì)應(yīng)的生存資料,結(jié)果顯示ENO2基因高表達(dá)組具有更差的預(yù)后,因此檢測(cè)ENO2蛋白對(duì)預(yù)測(cè)CCRCC患者生存有一定的指導(dǎo)價(jià)值[17],有望成為CCRCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。有研究發(fā)現(xiàn),ENO2在CCRCC組織中高表達(dá),并在激活細(xì)胞周期、EMT和PI3K/AKT信號(hào)通路中發(fā)揮作用[18-19]。同時(shí),ENO2可能通過糖酵解促進(jìn)CCRCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲,其中糖酵解/糖異生已經(jīng)被證實(shí)與CCRCC的發(fā)病密切相關(guān)[20],而ENO2高表達(dá)可能與Warburg效應(yīng)有關(guān),提示ENO2參與促進(jìn)CCRCC的發(fā)生、發(fā)展。TIMER分析ENO2與糖代謝路徑相關(guān)基因HK2、ALDOA、PGK、PKM2及LDHA的表達(dá)呈正相關(guān),ENO2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解,滿足腫瘤細(xì)胞的能量代謝并促進(jìn)增殖。通過調(diào)節(jié)晚期CCRCC患者的ENO2表達(dá),控制糖酵解進(jìn)程,促進(jìn)腫瘤的免疫微環(huán)境形成,阻礙腫瘤細(xì)胞逃逸,再對(duì)其進(jìn)行免疫治療或靶向治療,或許能取得更好的治療效果。最新研究[21]表明,ENO2高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者對(duì)抗血管生成治療反應(yīng)較差,由于ENO2衍生的磷酸烯醇丙酮酸作為內(nèi)源性HDAC1抑制劑發(fā)揮作用,并對(duì)抗血管生成治療產(chǎn)生抗性。有效抑制ENO2或代謝相關(guān)基因的活性,可能給代謝重排和抗血管治療CCRCC患者提供新的機(jī)會(huì)。

綜上,本實(shí)驗(yàn)基于免疫組化及TCGA、GEO、TIMER等數(shù)據(jù)庫(kù)分析,研究ENO2在CCRCC中的作用及潛在分子機(jī)制,豐富了ENO2在腎臟腫瘤中的研究理論依據(jù),ENO2有望成為CCRCC潛在的診療及預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物。